Drosophila Melanogaster namunalarining ultratovushli lizisi

Drosophila melanogaster laboratoriyalarda model organizm sifatida keng qoʻllaniladi. Shu sababli Drosophila melanogaster namunalarini lizis qilish, hujayralarni parchalash, oqsillarni ekstraksiya qilish va DNKni siljish kuchlari bilan uzish kabi tahlildan oldingi tayyorlash bosqichlarini tez-tez bajarish zarur. Ultratovushli parchalagichlar ishonchli va samarali boʻlib, faqat ultratovush jarayoni parametrlarini sozlash orqali lizis, oqsil ekstraksiyasi yoki DNK fragmentatsiyasi kabi turli vazifalarni oson bajarish uchun qoʻllanilishi mumkin. Shu tariqa ultratovushli gomogenizatorlar qoʻllanish doirasi keng boʻlgan moslashuvchan vositalardir.

Ultratovushli lizis va oqsil ekstraksiyasi

Lizis, hujayralarni eruvchan holatga keltirish, toʻqimalarni gomogenlashtirish va oqsillarni ekstraksiya qilish biologik laboratoriyalarda ultratovushli parchalagichlar bajaradigan odatiy vazifalardir. Ultratovushli parchalagichlar va hujayra parchalagichlari hayvon toʻqimalari, hasharotlar (masalan, Drosophila melanogaster, C. elegans) yoki oʻsimlik namunalarini gomogenlashtirish uchun juda mos keladi. Ultratovush bilan ishlov berishning keyingi qoʻllanishlari hujayra suspenziyalari va choʻkmalarining lizisi hamda hujayra ichidagi oqsillarni ekstraksiya qilishni oʻz ichiga oladi.
Ultratovushli lizis va oqsil ekstraksiyasi oʻta ishonchli va takrorlanuvchan jarayonlar boʻlib, ularni belgilangan protokollar asosida bajarish mumkin. Ultratovush jarayonining intensivligini amplituda, sikl / impuls rejimi, harorat va namuna hajmi kabi ultratovush bilan ishlov berish parametrlari orqali aniq sozlash mumkinligi sababli, bir marta tasdiqlangan protokollarni ayni natija bilan qayta-qayta takrorlash mumkin.

DNK va RNKning ultratovushli fragmentatsiyasi

Hujayra lizisi va oqsil ekstraksiyasidan keyin namunani tayyorlashda odatda talab etiladigan bosqich DNK, RNK va xromatinni siljish kuchlari bilan uzish va fragmentatsiya qilishdir, masalan, xromatin immunopretsipitatsiyasidan (ChIP) oldin. DNKni bir butun holda tutib turadigan kovalent bogʻlarni fizik kuchlar bilan uzish orqali DNK va RNK fragmentatsiyasiga ishonchli erishish mumkin. Ultratovush bilan ishlov berish kabi fizik siljish kuchlaridan foydalanilganda avval DNK zanjirlari uziladi, soʻng DNK kichikroq boʻlaklarga parchalanadi.
DNKning ultratovushli fragmentatsiyasi DNKni maqsadli uzunlikkacha, masalan, 500bp (asos jufti) gacha siljish kuchlari bilan uzishda ishonchli va samaralidir. DNKning ultratovushli fragmentatsiyasining asosiy afzalliklari ultratovush jarayoni parametrlari va intensivligini aniq boshqarishni oʻz ichiga oladi. Ultratovush bilan ishlov berish intensivligi, sikllari va vaqtini aniq oʻzgartirish orqali ultratovush jarayoni parametrlarini sozlash mumkin. Bu kerakli oʻlchamdagi DNKni hosil qilish imkonini beradi va maqsadli uzunlikdagi DNKni ishonchli hosil qilish hamda qayta hosil qilish mumkin. DNKni ultratovush yordamida siljish kuchlari bilan uzish yuqori molekulyar massali DNK fragmentlarini hosil qilish uchun ham juda mos keladi.

Drosophila melanogaster ultratovushli lizisi uchun protokollar

Quyida Drosophila namunalarining ultratovush yordamidagi lizisi, oqsil ekstraksiyasi va DNK yoki xromatin fragmentatsiyasi uchun turli protokollarni topishingiz mumkin.

Koʻndalang bogʻlash immunopretsipitatsiyasi (CLIP) tahlili uchun ultratovushli lizis

CLIP tahlili avval xabar qilinganidek, ayrim oʻzgartirishlar bilan bajarildi. 0–1 kunlik yovvoyi tipdagi urgʻochilardan olingan taxminan 20 mg tuxumdonlar UV yordamida koʻndalang bogʻlandi (3 × 2000 μJ/cm2), 300 U RNAseOUT qoʻshilgan 1 mL RCB buferida (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saxaroza, 1 mM DTT, 1× EDTA saqlamaydigan Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) muz ustida gomogenlashtirildi va 30 min muz ustiga qoʻyildi. Gomogenatga muz ustida, 80% quvvatda, orasida 60 s tanaffus bilan besh marta 20 s lik impulslar davomida Hielscher ultratovush protsessori UP100H (100 W, 30 kHz) yordamida ultratovush bilan ishlov berildi va sentrifugalandi (16 000 × g da 5 min, 4°C da). Eruvchan ekstrakt 20 μl Protein-G dynabeads bilan 4°C da 20 min davomida dastlabki tozalashdan oʻtkazildi. Immunoblotting va kiritilgan RNK miqdorini aniqlash (1%) uchun namunalar ajratib olingach, 450 μl dastlabki tozalangan ekstraktdagi HP1 anti-HP1 9A9 antitanasi bilan, 50 μl Protein-G dynabeads ishtirokida 4 h inkubatsiya qilish orqali immunopretsipitatsiya qilindi. Immunopretsipitatlar RCB bilan 4 marta yuvildi. Immunopretsipitatsiya qilingan RNKlarni elyutsiya qilish uchun choʻktirilgan donachalar 100 μL DEPC bilan ishlov berilgan UltraPure suvida 5 min qaynatildi. RNK tayyorlash uchun ajratib olingan supernatantga 900 μL Qiazol Reagent qoʻshildi. Tozalangan RNK ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq oligo dT, tasodifiy geksamerlar va SuperScript teskari transkriptaza III yordamida cDNK sintez qilish uchun matritsa sifatida ishlatildi.
(Cassale et al. 2019)

Xromatin immunopretsipitatsiyasi tahlili uchun ultratovushli lizis

Xromatin immunopretsipitatsiyasi Menet tavsiflagan usul boʻyicha kichik oʻzgartirishlar bilan bajarildi. 0–1 kunlik yovvoyi tipdagi urgʻochilardan olingan taxminan 20 mg tuxumdonlar 1 mL NEB buferida (pH 8,0 da 10 mM HEPES-Na, 10 mM NaCl, pH 8 da 0,1 mM EGTA-Na, pH 8 da 0,5 mM EDTA-Na, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 1× EDTA saqlamaydigan Complete Protease Inhibitors) gomogenizator / botirma disperser yordamida 1 min (3000 rpm da) gomogenlashtirildi. Gomogenat oldindan sovitilgan shisha Dounce gomogenizatoriga oʻtkazildi va tigʻiz mos keladigan pestik bilan 15 ta toʻliq harakat bajarildi. Soʻng erkin yadrolar 6000xg da 10 min davomida 4°C da sentrifugalandi. Yadrolarni saqlovchi choʻkmalar 1 mL NEB da qayta suspenziyalandi va saxaroza gradientida (NEB dagi 1,6 M saxarozadan 0,65 mL, NEB dagi 0,8 M saxarozadan 0,35 mL) 20 000 × g da 20 min sentrifugalandi. Choʻkma 1 mL NEB da qayta suspenziyalandi va formaldegid yakuniy konsentratsiyasi 1% boʻlguncha qoʻshildi. Yadrolar xona haroratida 10 min davomida koʻndalang bogʻlandi va 1/10 vol 1,375 M glitsin qoʻshilib reaksiya toʻxtatildi. Yadrolar 6000 × g da 5 min sentrifugalash orqali yigʻildi. Yadrolar 1 mL NEB da ikki marta yuvildi va 1 mL lizis buferida (pH 7,6 da 15 mM HEPES-Na, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, pH 8 da 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na dezoksixolat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkozin va 1× EDTA saqlamaydigan Complete Protease Inhibitors) qayta suspenziyalandi. Yadrolarga Hielscher ultratovush protsessori UP100H (100 W, 30 kHz) yordamida olti siklda ultratovush bilan ishlov berildi; har bir sikl 20 s ultratovush bilan ishlov berish va 1 min muz ustida saqlashdan iborat boʻldi. Ultratovush bilan ishlov berilgan yadrolar 13 000 × g da 4 min davomida 4°C da sentrifugalandi. Ultratovush bilan ishlov berilgan xromatinning katta qismi 500–1000 asos jufti (bp) uzunlikda edi. Har bir immunopretsipitatsiya uchun 15 μg xromatin 10 μg HP1 9A9 monoklonal antitanasi ishtirokida inkubatsiya qilindi (aylanuvchi gʻildirakda 4°C da 3 h). Soʻng 50 μl dynabeads protein G qoʻshildi va inkubatsiya 4°C da tun boʻyi davom ettirildi. Supernatantlar tashlab yuborildi va namunalar lizis buferida ikki marta (har bir yuvish 4 °C da 15 min) hamda TE buferida (1 mM EDTA, pH 8 da 10 mM TrisHCl) ikki marta yuvildi. Xromatin donachalardan ikki bosqichda elyutsiya qilindi; avval 100 μl elyutsiya buferi 1 da (10 mM EDTA, 1% SDS, pH 8 da 50 mM TrisHCl) 65°C da 15 min, keyin sentrifugalash va supernatantni ajratib olish bajarildi. Donachalardagi material 100 μl TE + 0,67% SDS da qayta ekstraksiya qilindi. Birlashtirilgan elyuat (200 μl) koʻndalang bogʻlarni uzish uchun 65°C da tun boʻyi inkubatsiya qilindi va 50 μg/ml RNaseA bilan 65°C da 15 min hamda 500 μg/ml Proteinase K bilan 65°C da 3 h ishlov berildi. Namunalar fenol–xloroform bilan ekstraksiya qilindi va etanol bilan choʻktirildi. DNK 25 μl suvda qayta suspenziyalandi. Immunopretsipitatsiya qilingan DNK bilan molekulyar tahlillardan maksimal foydalanish uchun nomzod genlar optimallashtirilgan dupleks-PCR protokoli boʻyicha, bitta reaksiyada erish haroratlari oʻxshash boʻlgan ikki xil praymer toʻplamidan foydalanib, juft holda amplifikatsiya qilindi.
(Casale et al. 2019)
 

Biologik namunalar uchun yuqori unumdorlikdagi ultratovushli hujayra parchalagichlari

Hujayralarni parchalash, lizis, oqsil ekstraksiyasi, DNK, RNK va xromatin fragmentatsiyasi hamda namunalarni tahlildan oldin tayyorlashning boshqa bosqichlari uchun yuqori unumdorlikdagi ultratovush qurilmalari haqida gap ketganda, Hielscher Ultrasonics sizning uzoq yillik tajribaga ega hamkoringizdir. Ultratovushli laboratoriya gomogenizatorlari va namuna tayyorlash qurilmalarining keng qamrovli assortimentini taklif etuvchi Hielscher biologik qoʻllanishingiz va talablaringiz uchun ideal ultratovush qurilmasiga ega.
Mikrouchli klassik zond turidagi ultratovush qurilmasi, masalan, UP200St (200W; chapdagi rasmga qarang) yoki ultratovush yordamida namuna tayyorlash qurilmalaridan biri VialTweeter yoki UP200ST_TD_CupHorn VialHolder bilan birga tadqiqot va tahlil laboratoriyalarida sevimli modellardir. Klassik ultratovush zondi kamroq namunalarni lizis qilish, ekstraksiya qilish yoki fragmentatsiya qilish zarur boʻlganda ideal hisoblanadi. VialTweeter va UP200St_TD_CupHorn namuna tayyorlash qurilmalari mos ravishda 10 yoki 5 tagacha flakonga bir vaqtning oʻzida ultratovush bilan ishlov berish imkonini beradi.
Koʻp sonli namunalarni (masalan, 96 chuqurchali plastinalar, mikrotitr plastinalari va boshqalar) qayta ishlash zarur boʻlsa, UIP400MTP ultratovush bilan ishlov berish uchun ideal tizimdir. UIP400MTP suv bilan toʻldirilgan va mikrochuqurchali plastinalarni joylashtirish uchun yetarli joyga ega kattaroq cuphorn kabi ishlaydi. 400 vatt quvvatli ultratovush protsessori bilan ishlaydigan UIP400MTP hujayralarni parchalash, namunalarni lizis qilish, choʻkmalarni eruvchan holatga keltirish, oqsillarni ekstraksiya qilish yoki DNKni siljish kuchlari bilan uzish uchun koʻp chuqurchali plastinalarga juda bir tekis va intensiv ultratovush bilan ishlov beradi.

Aqlli dasturiy taʼminot orqali aniq boshqarish

Hielscher kompaniyasining 200 vatt va undan yuqori quvvatdagi barcha ultratovush bilan ishlov berish yechimlari raqamli rangli sensorli ekran va aqlli dasturiy taʼminot bilan jihozlangan. Maʼlumotlarni aqlli qayd etish orqali ultratovush qurilmasi ishga tushirilishi bilanoq barcha ultratovush jarayoni parametrlari ichki SD-kartaga CSV fayli sifatida avtomatik saqlanadi. Bu tadqiqot va qayd etishni ancha qulaylashtiradi. Ultratovush bilan ishlov berish sinovlari yoki namuna tayyorlashdan keyin har bir ishlov berish jarayonining parametrlarini osongina koʻrib chiqishingiz va ularni taqqoslashingiz mumkin.
Tushunarli menyu orqali ultratovush bilan ishlov berishdan oldin koʻplab parametrlarni oldindan belgilash mumkin: masalan, namunadagi haroratni boshqarish va uning issiqlik taʼsirida buzilishining oldini olish uchun namuna haroratining yuqori chegarasini belgilash mumkin. Ultratovush qurilmasi bilan birga beriladigan ulanadigan harorat sensori ultratovush protsessoriga ishlov berishning haqiqiy harorati haqida maʼlumot beradi. Yuqori harorat chegarasiga yetilganda ultratovush qurilmasi belgilangan ∆T ning pastki chegarasiga yetilguncha toʻxtab turadi va keyin avtomatik ravishda yana ultratovush bilan ishlov berishni boshlaydi.
Agar muayyan energiya kiritilishi bilan ultratovush bilan ishlov berish talab etilsa, ishlov berish jarayonining yakuniy ultratovush energiyasini oldindan belgilashingiz mumkin. Albatta, ultratovush pulsatsiyasi va sikl rejimini ham alohida sozlash mumkin.
Eng muvaffaqiyatli ultratovush bilan ishlov berish parametrlaringizdan qayta foydalanish uchun turli ishlov berish rejimlarini (masalan, ultratovush bilan ishlov berish vaqti, intensivligi, sikl rejimi va boshqalar) oldindan belgilangan rejimlar sifatida saqlashingiz mumkin, shunda ularni osongina va tez qayta ishga tushirish mumkin.
Ishlatishda yanada qulaylik yaratish uchun barcha raqamli ultratovush qurilmalarini har qanday keng tarqalgan brauzerda (masalan, InternetExplorer, Safari, Chrome va boshqalar) brauzer orqali masofadan boshqarish mumkin. LAN ulanishi oddiy ulab ishlatish tarzida sozlanadi va qoʻshimcha dasturiy taʼminot oʻrnatishni talab qilmaydi.
Biz, Hielscher kompaniyasida, biologik namunalarga muvaffaqiyatli ultratovush bilan ishlov berish aniqlik va takrorlanuvchanlikni talab qilishini bilamiz. Shu sababli ultratovush qurilmalarimizni samarali, ishonchli, takrorlanuvchan va qulay namuna tayyorlash imkonini beruvchi barcha funksiyalarga ega aqlli qurilmalar sifatida ishlab chiqdik.

Quyidagi jadval koʻplab namunalarni qulay va ishonchli tayyorlash uchun ultratovush mikrouchlari va klassik ultratovushli gomogenizatorlardan MultiSample ultratovush qurilmalarigacha boʻlgan ultratovush tizimlarimizning taxminiy ishlov berish quvvati haqida tasavvur beradi: