Drosophila Melanogaster namunalarining ultratovushli lizisi

Drosophila melanogaster laboratoriyalarda model organizm sifatida keng qo'llaniladi. Shuning uchun Drosophila melanogaster namunalarining lizis, hujayra buzilishi, oqsillarni ajratib olish va DNKni kesish kabi tahlildan oldingi tayyorgarlik bosqichlari tez-tez bajarilishi kerak. Ultrasonik dismembratatorlar ishonchli va samarali bo'lib, faqat ultratovushli jarayon parametrlarini sozlash orqali liziz, oqsil ekstraktsiyasi yoki DNK parchalanishi kabi turli vazifalarni bajarish uchun ishlatilishi mumkin. Shunday qilib, ultratovushli gomogenizatorlar keng ko'lamli ilovalarga ega moslashuvchan vositalardir.

Ultrasonik lizis va oqsil ekstraktsiyasi

Lizis, hujayralarni eritish, to'qimalarni homogenlashtirish va oqsillarni ekstraktsiyalash biologik laboratoriyalarda ultratovushli dismembratatorlar uchun odatiy vazifalardir. Ultrasonik dismembratatorlar va hujayra disruptorlari hayvonlar to'qimalarini, hasharotlarni (masalan, Drosophila melanogaster, C. elegans) yoki o'simlik namunalarini homogenlashtirish uchun juda mos keladi. Ultrasonikatsiyaning keyingi qo'llanilishi hujayra suspenziyalari va granulalarini lizis qilish, shuningdek hujayra ichidagi oqsillarni ekstraktsiya qilishdir.
Ultrasonik lizis va oqsillarni ajratib olish yuqori ishonchli va takrorlanadigan jarayonlar bo'lib, ular belgilangan protokollar asosida amalga oshirilishi mumkin. Ultrasonik jarayonning intensivligi amplituda, tsikl / puls rejimi, harorat va namuna hajmi kabi sonikatsiya parametrlari orqali aniq sozlanishi mumkinligi sababli, tasdiqlangan protokollar bir xil natija bilan qayta-qayta takrorlanishi mumkin.

Ultrasonik DNK va RNK parchalanishi

Hujayra lizisi va oqsil ekstraktsiyasidan so'ng, namunani tayyorlashning umumiy talab qilinadigan bosqichi DNK, RNK va xromatinni kesish va parchalashdir, masalan, xromatin immunoprecipitatsiyasi (ChIP) oldidan. DNK va RNK parchalanishiga jismoniy kuchlar ta'sirida DNKni ushlab turuvchi kovalent aloqalarni uzish orqali ishonchli tarzda erishish mumkin. Sonikatsiya kabi jismoniy kesishdan foydalanib, dastlab DNK iplari buziladi, so'ngra DNK kichikroq bo'laklarga bo'linadi.
Ultrasonik DNK parchalanishi DNKni maqsadli uzunlikka, masalan, 500bp (asosiy juftlar) ga kesishda ishonchli va samarali hisoblanadi. Ultrasonik DNK parchalanishining asosiy afzalliklari ultratovush jarayonining parametrlari va intensivligini aniq nazorat qilishni o'z ichiga oladi. Ultrasonik jarayon parametrlari sonikatsiya intensivligini, tsikllarni va vaqtni aniq sozlash orqali sozlanishi mumkin. Bu kerakli DNK o'lchamlarini yaratishga imkon beradi va maqsadli DNK uzunligini ishonchli tarzda ishlab chiqarish va qayta ishlab chiqarish mumkin. Ultrasonik DNKni kesish ham yuqori molekulyar og'irlikdagi DNK parchalarini yaratish uchun idealdir.

Drosophila melanogasterning ultratovushli lizisi uchun protokollar

Quyida Drosophila namunalarining ultratovush yordamida lizis, oqsil ekstraktsiyasi va DNK yoki xromatin parchalanishi uchun turli protokollarni topishingiz mumkin.

O'zaro bog'langan immunoprecipitatsiya (CLIP) tahlili uchun ultratovushli lizis

CLIP tahlili avval xabar qilinganidek, ba'zi o'zgartirishlar bilan amalga oshirildi. 0-1 kunlik yovvoyi turdagi urg'ochilarning taxminan 20 mg tuxumdonlari UV o'zaro bog'langan (3 × 2000 mkJ/sm2), 1 ml RCB buferida (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaClm, 200 mM Na5M2,) muz ustida bir hil holga keltirildi. MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saxaroza, 1 mM DTT, 1 × EDTAsiz to'liq proteaz inhibitörleri, 1 mM PMSF) 300 U RNAseOUT bilan to'ldirilgan va 30 daqiqa davomida muzga joylashtirilgan. Gomogenat muz ustida, 80% quvvatda, Hielscher ultratovushli protsessoridan foydalangan holda, 20 soniyada besh marta, 60 s dam olish bilan sonikatsiya qilindi. UP100H (100 Vt, 30 kHz) va santrifüjlanadi (4°C da 5 daqiqa davomida 16000 × g). Eriydigan ekstrakt 4°C da 20 daqiqa davomida 20 mkl Protein-G dinabeadlari bilan oldindan tozalandi. Immunoblotlash va RNK kiritish miqdorini aniqlash uchun namunalar olib tashlangandan so'ng (1%), HP1 450 mkl oldindan tozalangan ekstraktdan 50 mkl Protein-G dinabeadlari bilan 4 soat davomida inkubatsiya qilish orqali anti-HP1 9A9 antikori bilan immuno-presipitatsiya qilindi. Immunopretsipitatlar RCB bilan 4 marta yuvildi. Immunitetga uchragan RNKlarni tozalash uchun granulalangan boncuklar 100 mkl UltraPure DEPC bilan ishlangan suvda 5 daqiqa qaynatiladi. RNK tayyorlash uchun olingan supernatantga 900 mkl Qiazol reagent qo'shildi. Tozalangan RNK ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq oligo dT, tasodifiy heksamerlar va SuperScript teskari transkriptaza III yordamida cDNKni sintez qilish uchun shablon sifatida ishlatilgan.
(Kassale va boshq. 2019)

Xromatin Immunoprecipitation Assay uchun ultratovush lizis

Xromatin immunopresipitatsiyasi Menet tomonidan kichik o'zgarishlar bilan tavsiflangan usul bo'yicha amalga oshirildi. 0 dan 1 kungacha bo'lgan yovvoyi turdagi urg'ochilarning taxminan 20 mg tuxumdonlari 1 ml NEB buferida (pH 8,0 da 10 mM HEPES-Na, 10 mM NaCl, pH 8, 0 m da 0,1 mM EGTA-Na) gomogenlashtirildi. EDTA-Na pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidin, 0,15 mM Spermin, 1 × EDTAsiz To'liq proteaz inhibitörleri) gomogenizator / immersion disperser bilan 1 min (3000 rpm da). Gomogenat oldindan sovutilgan shisha idishga o'tkazildi va qattiq pestle bilan 15 ta to'liq zarba qo'llanildi. Keyin erkin yadrolar 4 ° C da 10 daqiqa davomida 6000xg da santrifüj qilindi. Yadro o'z ichiga olgan granulalar 1 ml NEBda qayta suspenziya qilindi va 20000 × g da saxaroza gradientida 20 daqiqa davomida santrifüj qilindi (NEBda 0,65 ml 1,6 M saxaroza, NEBda 0,35 ml 0,8 M saxaroza). Pelet 1 ml NEB va formaldegidda yakuniy konsentratsiyasi 1% gacha qayta suspenziya qilindi. Yadrolar xona haroratida 10 daqiqa davomida o'zaro bog'langan va 1/10 hajmli 1,375 M glisin qo'shilishi bilan söndürülmüştür. Yadrolar 5 daqiqa davomida 6000 × g da santrifüjlash orqali yig'ildi. Yadrolar ikki marta 1 ml NEBda yuvildi va 1 ml Lizis Buferida (pH 7,6 da 15 mM HEPES-Na, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, pH 8 da 1 mM EDTA, 1% Triton X-050) qayta suspenziya qilindi. mM DTT, 0,1% Na Deoksixolat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkosin va 1 × EDTAsiz to'liq proteaz inhibitörleri). Yadrolar Hielscher ultratovushli protsessor yordamida sonikatsiya qilindi UP100H (100 Vt, 30 kHz) olti marta 20 soniya davomida va muz ustida 1 minut. Sonikatsiyalangan yadrolar 4 ° C da 4 daqiqa davomida 13000 × g da santrifüj qilindi. Soniklangan kromatinning ko'p qismi uzunligi 500 dan 1000 ta asosiy juft (bp) edi. Har bir immunoprecipitatsiya uchun 15 mkg xromatin 10 mkg HP1 9A9 monoklonal antikori ishtirokida inkubatsiya qilindi (aylanuvchi g'ildirakda 4 ° C da 3 soat). Keyin 50 mkl Dynabeads protein G qo'shildi va inkubatsiya kechasi 4 ° C da davom ettirildi. Supernatantlar tashlab yuborildi va namunalar ikki marta Lizis tamponida (har bir yuvish 4 °C da 15 daqiqa) va ikki marta TE tamponida (pH 8 da 1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl) yuvildi. Xromatin ikki bosqichda boncuklardan elutsiya qilindi; birinchi bo'lib 100 mkl Eluition Bufer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, pH 8 da 50 mM TrisHCl) 65 ° C da 15 daqiqa davomida, so'ngra sentrifugalash va supernatantni tiklash. Boncuk materiallari 100 mkl TE + 0,67% SDSda qayta ekstraksiya qilindi. Birlashtirilgan eluat (200 mkl) o'zaro bog'lanishlarni qaytarish uchun 65 ° C da bir kechada inkubatsiya qilindi va 65 ° C da 15 daqiqa davomida 50 mkg / ml RNaseA va 65 ° C da 3 soat davomida 500 mkg / ml Proteinaz K bilan ishlov berildi. Namunalar fenol-xloroform ekstrakti va etanol cho'ktirildi. DNK 25 mkl suvda qayta suspenziya qilindi. DNK immuno-presipitatsiyasi bilan molekulyar tahlillarni maksimal darajada oshirish uchun nomzod genlar bir reaktsiyada o'xshash erish haroratiga ega bo'lgan ikki xil primerlar to'plamidan foydalangan holda optimallashtirilgan dupleks-PCR protokoli orqali juft bo'lib kuchaytirildi.
(Casale va boshq. 2019)
 

Biologik namunalar uchun yuqori samarali ultratovushli hujayralarni buzuvchilar

Hielscher Ultrasonics sizning uzoq tajribali hamkoringiz bo'lib, u hujayra buzilishi, liziz, oqsil ekstraktsiyasi, DNK, RNK va xromatin parchalanishi uchun yuqori samarali ultrasonikatorlar, shuningdek, tahlildan oldingi namuna tayyorlash bosqichlari haqida gap ketganda. Ultrasonik laboratoriya gomogenizatorlari va namunalarni tayyorlash bo'linmalarining keng qamrovli portfelini taklif qiluvchi Hielscher sizning biologik dasturingiz va talablaringiz uchun ideal ultratovush qurilmasiga ega.
Klassik zond tipidagi ultratovush apparati, masalan, mikro uchli UP200St (200 Vt; chapdagi rasmga qarang) yoki ultratovushli namuna tayyorlash moslamalaridan biri VialTweeter yoki UP200ST_TD_CupHorn VialHolder bilan tadqiqot va analitik laboratoriyalarda sevimli modellar. Klassik ultratovushli prob idealdir, chunki kamroq namunalarni tayyorlashda lizing, ekstraksiya yoki parchalanish kerak. Namuna tayyorlash birliklari VialTweeter va UP200St_TD_CupHorn bir vaqtning o'zida mos ravishda 10 yoki 5 flakongacha sonikatsiya qilish imkonini beradi.
Agar yuqori namunalar soni (masalan, 96 quduqli plitalar, mikrotitr plitalari va boshqalar) qayta ishlanishi kerak bo'lsa, UIP400MTP ideal sonication o'rnatish hisoblanadi. UIP400MTP suv bilan to'ldirilgan va mikro quduq plitalarini ushlab turish uchun etarli joyga ega bo'lgan kattaroq idish kabi ishlaydi. 400 vattli kuchli ultratovushli protsessor bilan jihozlangan UIP400MTP hujayralarni buzish, namunalarni lizlash, granulalarni eritish, oqsillarni ekstraksiya qilish yoki DNKni kesish uchun ko'p quduqli plitalarning juda bir xil va intensiv sonikatsiyasini ta'minlaydi.

Aqlli dasturiy ta'minot orqali aniq nazorat

200 vattdan yuqori bo'lgan barcha Hielscher sonication echimlari raqamli rangli sensorli ekran va aqlli dasturiy ta'minot bilan jihozlangan. Smart ma'lumotlar protokoli orqali ultratovush jarayonining barcha parametrlari ultrasonikator ishga tushirilishi bilan avtomatik ravishda o'rnatilgan SD-kartada CSV fayli sifatida saqlanadi. Bu tadqiqot va protokollashni ancha qulay qiladi. Sonikatsiya sinovlaridan yoki namunani tayyorlashdan so'ng, siz har bir sonication ishining sonikatsiya parametrlarini ko'rib chiqishingiz va ularni solishtirishingiz mumkin.
Intuitiv menyu orqali sonikatsiyadan oldin ko'plab parametrlarni oldindan belgilash mumkin: Masalan, namunadagi haroratni nazorat qilish va uning termal degradatsiyasini oldini olish uchun namuna haroratining yuqori chegarasini o'rnatish mumkin. Ultrasonik qurilma bilan birga keladigan ulanadigan harorat sensori ultratovushli protsessorga haqiqiy sonikatsiya harorati haqida fikr bildiradi. Yuqori harorat chegarasiga yetganda, ultratovush qurilmasi o'rnatilgan ∆T ning pastki chegarasiga yetguncha to'xtab qoladi va keyin avtomatik ravishda yana sonikatsiya qilishni boshlaydi.
Agar ma'lum energiya kiritish bilan sonikatsiya kerak bo'lsa, siz sonikatsiyaning yakuniy ultratovush energiyasini oldindan belgilashingiz mumkin. Albatta, ultratovushli pulsatsiya va tsikl rejimi ham alohida o'rnatilishi mumkin.
Eng muvaffaqiyatli sonikatsiya parametrlarini qayta ishlatish uchun siz turli sonikatsiya rejimlarini (masalan, sonikatsiya vaqti, intensivlik, sikl rejimi va h.k.) oldindan o'rnatilgan rejimlar sifatida saqlashingiz mumkin, shunda ular oson va tez qayta ishga tushirilishi mumkin.
Operatsion qulayligi uchun barcha raqamli ultratovush qurilmalari istalgan umumiy brauzerda (masalan, InternetExplorer, Safari, Chrome va boshqalar) brauzerning masofadan boshqarish pulti orqali boshqarilishi mumkin. LAN ulanishi oddiy plagin-n-play sozlamalari bo'lib, qo'shimcha dasturiy ta'minotni o'rnatishni talab qilmaydi.
Biz Hielscherda biologik namunalarning muvaffaqiyatli sonikatsiyasi aniqlik va takrorlanuvchanlikni talab qilishini bilamiz. Shuning uchun biz ultrasonikatorlarimizni samarali, ishonchli, takrorlanadigan va qulay namuna tayyorlash imkonini beruvchi barcha xususiyatlarga ega aqlli qurilmalar sifatida ishlab chiqdik.

Quyidagi jadval ko'plab namunalarni qulay va ishonchli tayyorlash uchun ultratovushli mikro-maslahatlardan va klassik ultratovushli gomogenizatorlardan MultiSample ultrasonikatorlariga qadar ultratovush tizimlarimizning taxminiy qayta ishlash quvvati haqida ma'lumot beradi: