Elishay tahlillari uchun ultratovush namunasini tayyorlash
Elishay kabi tahlillar in vitro diagnostika, kasallik bilan bog'liq oqsillarni aniqlash va sifat nazorati (masalan, oziq-ovqat allergenlarini kuzatish) uchun keng qo'llaniladi. Ultrasonik namunani tayyorlash - bu hujayrani parchalash va hujayra ichidagi oqsillarni, DNK, RNK va organellalarni ajratish uchun tez, ishonchli va takrorlanadigan usul. Hielscher Ultrasonics yagona namunalarni, bir nechta flakonlarni, shuningdek, mikrotitr plitalari va 96-quduqli plitalarni qulay tayyorlash uchun turli xil ultratovushli echimlarni taklif etadi.
ELISA – Ferment bilan bog'liq immunosorbent tahlili
Elishay ferment bilan bog'langan immunosorbent tahlilini anglatadi va ligandlarni bog'lash tahlillari toifasining keng qo'llaniladigan biokimyoviy tahlil usulidir. Elishay usulida suyuqlik namunasi maxsus bog'lovchi xususiyatlarga ega statsionar qattiq fazaga qo'shiladi. Odatda, statsionar qattiq faza quduq plitasi yoki ELISA plastinkasiga qoplama sifatida qo'llaniladi. Keyin turli suyuq reagentlar ketma-ket qo'shiladi, inkubatsiya qilinadi va yuviladi, natijada quduqdagi oxirgi suyuqlikda optik o'zgarish (masalan, fermentativ reaktsiya mahsuloti bo'yicha rang rivojlanishi) sodir bo'ladi. Optik o'zgarish tahlil qilinadigan moddaning miqdorini miqdoriy deb ataladigan narsa bilan o'lchash imkonini beradi “o'qish". Miqdoriy o'qish uchun spektrofotometr, florometr yoki luminometr o'tkaziladigan yorug'likning intensivligini aniqlash va o'lchash uchun ishlatiladi. Aniqlanishning sezgirligiga analitik reaktsiyalar paytida signalning kuchayishi ta'sir qiladi. Ferment reaktsiyalari yaxshi o'rganilgan va ishonchli kuchaytirish jarayonlari bo'lgani uchun signalni yaratish uchun fermentlar qo'llaniladi. Fermentlar aniq miqdorni aniqlashga imkon berish uchun aniqlangan nisbatlarda aniqlash reagentlari bilan bog'langan, bu "ferment bilan bog'langan" immunosorbent tahlil nomini ham tushuntiradi.
Elishay tahlillari mikrotitr plitalari / 96-quduqli plastinkalarda amalga oshirilganligi sababli, u plastinka asosidagi tahlil usuli sifatida tanilgan va masalan, klinik in vitro diagnostika, tadqiqot, dori-darmonlarni ishlab chiqish va hokazolarda antikorlarni, peptidlarni, oqsillarni aniqlash va miqdorini aniqlash uchun ishlatiladi. va gormonlar.
Elishay usuli tibbiyotda, biotexnologiyada, o'simliklar patologiyasida diagnostika vositasi sifatida tez-tez qo'llaniladi va ko'plab sohalarda muhim sifat nazorati o'lchovidir.
Ultrasonik namunani tayyorlash qurilmasi VialTweeter Elishay tahlillari oldidan hujayra lizisi va oqsil ekstraktsiyasi uchun ishlatiladi
Elishaydan oldin ultratovush namunasini tayyorlash
Elishay tahlilini o'tkazishdan oldin namunalar tayyorlash bosqichlarini talab qiladi, masalan, hujayra lizisi va hujayra ichidagi oqsillar, DNK, RNK va boshqalarni ekstraksiya qilish. Ultrasonik hujayra parchalanishi va oqsil izolyatsiyasining afzalligi uning yuqori samaradorligi, ishonchliligi va takrorlanishidir. Bu omillarning barchasi yuqori sifatli diagnostika va tadqiqot natijalarini olish uchun muhimdir
- Bir hil namunali ishlov berish
- To'liq lizis
- To'liq protein ekstraktsiyasi (masalan, antikorlar, DNK)
- Hujayra turiga optimal moslashish
- Har qanday namuna o'lchami uchun
- Qayta tiklanadigan
- Harorat nazorati ostida
- SD-kartada ma'lumotlarni avtomatik protokollash
Pre-ELISA ultratovushli hujayra lizisi uchun protokol
- Hujayra madaniyati uchun: Ultrasonik hujayra lizisidan oldin hujayralarni mikrotsentrifugada 270 xg da 5 daqiqa davomida santrifüj qiling. Supernatantni aspiratsiya orqali olib tashlang va hujayralarni 30-100 mL RIPA buferida qayta suspenziya qiling. Keyin hujayra pelletini 30 daqiqa davomida muz ustida inkubatsiya qiling.
- Endi hujayra namunasi ultratovushli lizizga tayyor:
Zond tipidagi ultratovush qurilmasidan foydalaning (masalan UP200Ht S26d2 probi bilan) yoki ultratovushli ko'p namunali qurilma (masalan, bir vaqtning o'zida 10 flakongacha sonikatsiya qilish uchun VialTweeter yoki mikrotitr plitalari / 96 quduqli plitalar uchun UIP400MPT) siz tayyorlashingiz kerak bo'lgan namunalar miqdoriga qarab.
Bitta namunaning zond tipidagi sonikatsiyasi uchun hujayralarni 1,5 ml mikrosentrifuga naychalariga joylashtiring. - Ultrasonikatorning raqamli menyusida ultratovush davomiyligini, jami energiya sarfini, aylanish rejimini va/yoki harorat chegaralarini oldindan belgilang. Bu juda ishonchli sonikatsiya va takrorlanuvchanlikni ta'minlaydi.
- Sonotrodni joylashtiring va ultratovush qurilmasini yoqing. Namunani bir xilda sonikatsiya qilish uchun ultratovushli probning mikro uchini namuna bo'ylab muloyimlik bilan harakatlantiring.
Ko'pgina hujayralar uchun ultratovushli lizis 10 soniyali sonikatsiyaning 2-4 tsiklidan keyin yakunlanadi. - Sonikatsiyadan so'ng, sonotrodni namunadan olib tashlang. Namunalar muz ustida 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilinishi kerak. Keyin qoldiqlarni pelletlash uchun 20 daqiqa davomida 10000 xg da sentrifuga qiling. Supernatantlarni yangi mikrotsentrifuga naychasiga o'tkazing. Tahlil qiluvchi moddalarni belgilang va -20 ° C da saqlang.
- Ultrasonik sonotrodni spirt bilan to'ldirilgan stakanda, masalan, 70% etanolda alkogol yoki sonikat bilan to'g'ri tozalash orqali tozalash mumkin. Titandan tayyorlangan barcha ultratovushli problar avtoklavlanadi.
bilan E.coli hujayralaridan oqsil ekstraktsiyasi ultratovushli probi UP200St
- Ortiqcha gemoliz qonini yaxshilab olib tashlash uchun to'qimalarni muzdek sovuq PBS (0,01M, pH=7,4) bilan yuvib tashlang.
- To'qimalarni (buyrak, yurak, o'pka, taloq va boshqalar) torting va uni PBSda bir hil holga keltiriladigan kichik bo'laklarga bo'ling. Kerakli PBS hajmi to'qimalarning og'irligi bilan bog'liq. Qoida tariqasida, 1 g to'qimalarga taxminan kerak bo'ladi. 9 ml PBS. PBS ga ba'zi proteaz inhibitörlerini qo'shish tavsiya etiladi. (Muqobil ravishda proteaza va fosfataza inhibitori kokteylini o'z ichiga olgan RIPA yoki gipotonik lizis tamponidan foydalanish mumkin.)
- To'qimalarning o'lchamiga qarab, qisqa vorteks bilan davolash (15 sek. impulslarda taxminan 1-2 min.) to'qimalarni oldindan davolash uchun foydali bo'lishi mumkin.
- Ultrasonikatoringizga mikro uchini o'rnating, masalan, S26d2. Namuna trubkasini to'qima bilan muzli hammomga joylashtiring.
- Namunani ultrasonikatoringiz bilan, masalan, UP200St (80% amplituda) bilan 1 daqiqa davomida sonikating. impuls rejimida (15 soniya yoqilgan, 15 soniya pauza). Namunani muzli hammomda saqlang.
- Keyin gomogenatlar tahlil uchun oqsilni boyitish uchun maxsus hovuzlarni (sitozolik, yadroviy, mitoxondrial yoki lizosomal) olish uchun santrifüj qilinadi. Namunani 5 minut davomida 5000 × g da santrifüj qilish orqali supernatant olinadi.
MTP-24-8-96 sonotrodida mikrotiter plitalari quduqlarini sonikatsiya qilish uchun sakkizta ultratovushli prob mavjud.
Sonication paytida ishonchli harorat nazorati
Harorat jarayonga ta'sir etuvchi hal qiluvchi omil bo'lib, ayniqsa biologik namunalarni davolashda, masalan, oqsillarning termal degradatsiyasini oldini olishda muhim ahamiyatga ega. Namuna tayyorlashning barcha mexanik usullari singari, sonikatsiya issiqlik hosil qiladi. Biroq, Hielscher Ultrasonics qurilmalaridan foydalanganda namunalarning harorati yaxshi nazorat qilinishi mumkin. Biz sizga namunalaringiz haroratini kuzatish va nazorat qilish uchun turli xil variantlarni taqdim etamiz, shu bilan birga ularni prob tipidagi ultratovush apparati yoki VialTweeter bilan oldindan tahliliy ravishda tayyorlaymiz.
- Namuna haroratini kuzatish: Barcha Hielscher raqamli ultratovushli protsessorlari aqlli dasturiy ta'minot va ulanadigan harorat sensori bilan jihozlangan. Harorat sensorini ultratovush qurilmasiga ulang (masalan, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Ko'p quduqli plastinka sonikatori UIP400MTP) va harorat sensori uchini namuna naychalaridan biriga soling. Raqamli rangli sensorli displey orqali siz ultratovushli protsessor menyusida namunaviy sonikatsiya uchun ma'lum bir harorat oralig'ini o'rnatishingiz mumkin. Ultrasonikator maksimal haroratga erishilganda avtomatik ravishda to'xtaydi va namuna harorati belgilangan harorat ∆ pastki qiymatiga tushguncha pauza qiladi. Keyin sonication yana avtomatik ravishda boshlanadi. Bu aqlli xususiyat issiqlikdan kelib chiqadigan buzilishning oldini oladi.
- Ultrasonik ko'p namunali VialTweeter qurilmasiga kelsak, namuna naychalarini ushlab turadigan titan bloki oldindan sovutilishi mumkin. Titan blokini oldindan sovutish uchun VialTweeter blokini (faqat transdusersiz sonotrod!) muzlatgichga yoki muzlatgichga qo'ying, namunadagi harorat ko'tarilishini kechiktirishga yordam beradi. Iloji bo'lsa, namunaning o'zi ham oldindan sovutilishi mumkin.
- Sonikatsiya paytida sovutish uchun muzli hammom yoki quruq muzdan foydalaning. Namuna naycha(lar)ingizni sonikatsiya paytida muz hammomiga joylashtiring. VialTweeter uchun quruq muz bilan to'ldirilgan sayoz patnisdan foydalaning va issiqlik tez tarqalishi uchun VialTweeterni quruq muz ustiga qo'ying.
Butun dunyo bo'ylab mijozlar Hielscher zond tipidagi ultrasonikatorlardan, shuningdek, ko'p namunali sonikatsiya birliklari VialTweeter va UIP400MTP dan biologik, biokimyoviy, tibbiy va klinik laboratoriyalarda kundalik namuna tayyorlash ishlari uchun foydalanadilar. Hielscher protsessorlarining aqlli dasturiy ta'minoti va haroratni nazorat qilish, harorat ishonchli tarzda boshqariladi va issiqlik ta'sirida namuna degradatsiyasining oldini oladi. Hielscher ultratovushli yechimlari bilan ultratovush namunasini tayyorlash juda ishonchli va takrorlanadigan natijalarni beradi!
Tahlillar uchun UIP400MTP ko'p quduqli plastinka sonikatoridan foydalangan holda yuqori o'tkazuvchan sonikatsiya haqida ko'proq o'qing!
Biz bilan bog'lanish! / Bizdan so'rang!
Hielscher Ultrasonics laboratoriya, uchuvchi va sanoat miqyosida ilovalar, dispersiya, emulsifikatsiya va ekstraktsiyani aralashtirish uchun yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqaradi.
Adabiyot / Adabiyotlar
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Bilishga arziydigan faktlar
Elishayning qanday turlari mavjud?
Elishayning bir necha turlari mavjud bo'lib, ular ishlash printsipi bilan ajralib turadi. Ular to'g'ridan-to'g'ri Elishay, bilvosita Elishay, sendvich Elishay, raqobatbardosh Elishay va teskari Elishay deb nomlanadi. Quyida biz sizga Elishayning turli xil turlari va ularning asosiy xususiyatlari va farqlari haqida umumiy ma'lumot beramiz.
Elishay sifat yoki miqdoriy formatda o'tkazilishi mumkin. Sifatli natijalar oddiy ijobiy yoki salbiy natijani beradi, miqdoriy Elishayda namunaning optik zichligi (OD) odatda maqsadli molekulaning ma'lum konsentratsiyali eritmasining ketma-ket suyultirilishi bo'lgan standart egri bilan taqqoslanadi.
To'g'ridan-to'g'ri ELISA
To'g'ridan-to'g'ri Elishay Elisa uchun eng oddiy tahlil shakli bo'lib, bu erda faqat ferment bilan belgilangan asosiy antikor ishlatiladi va ikkilamchi antikorlar talab qilinmaydi. Ferment bilan belgilangan birlamchi antikor to'g'ridan-to'g'ri nishonga, ya'ni antigenga bog'lanadi. Buferlangan antigen eritmasi mikrotitr plitasining har bir qudug'iga qo'shiladi (odatda 96 quduqli plastinkalar, Elishay plitalari), u erda zaryad o'zaro ta'siri orqali plastik sirtga yopishadi. Birlamchi antikor bilan bog'langan ferment uning substrati bilan reaksiyaga kirishganda, u spektrofotometr, florometr yoki luminometr orqali o'lchanadigan ko'rinadigan signal hosil qiladi.
Bilvosita Elishay
Bilvosita Elishay testi uchun birlamchi antikor ham, ikkilamchi antikor ham talab qilinadi. Biroq, to'g'ridan-to'g'ri Elishaydan farqli o'laroq, asosiy antikor emas, balki ikkilamchi antikor ferment bilan belgilanadi. Antigen quduq plastinkasiga immobilizatsiya qilinadi va birlamchi antikor bilan bog'lanadi. Keyinchalik, ferment bilan belgilangan ikkilamchi antikor birlamchi antikor bilan bog'lanadi. Nihoyat, ikkilamchi antikor bilan bog'langan ferment uning substrati bilan reaksiyaga kirishib, aniqlanishi mumkin bo'lgan ko'rinadigan signal hosil qiladi.
sendvich ELISA
To'g'ridan-to'g'ri va bilvosita Elishay testlarida antigen immobilizatsiya qilinadi va quduq plastinkasi yuzasiga qoplanadi, ELISA sendvichida antikor Elishay plastinkasining plastik yuzasiga immobilizatsiya qilinadi. Sendvich Elishaydagi immobilizatsiyalangan antikorlar tutib olish antikorlari sifatida tanilgan. Qo'lga antikorlarga qo'shimcha ravishda sendvichda Elishay antikorlari deb ataladigan antikorlar ham talab qilinadi. Aniqlash antikorlari yorliqsiz birlamchi aniqlash antikorini va ferment bilan belgilangan ikkilamchi aniqlash antikorini o'z ichiga oladi.
Bosqichma-bosqich, qiziqish antijeni plastinkaga immobilizatsiya qilingan tutilish antikoriga bog'lanadi. Keyin, birlamchi aniqlash antikori antijen bilan bog'lanadi. Keyinchalik, ikkilamchi aniqlovchi antikor birlamchi aniqlovchi antikor bilan bog'lanadi. Yakuniy reaktsiya bosqichida ferment o'z substrati bilan reaksiyaga kirishib, optik jihatdan aniqlanishi mumkin bo'lgan ko'rinadigan signal hosil qiladi.
Raqobatbardosh Elishay
Raqobatbardosh Elishay, shuningdek, inhibisyon Elishay deb ham ataladi, Elishayning eng murakkab turi, chunki u inhibitor antijeni qo'llashni o'z ichiga oladi. To'g'ridan-to'g'ri, bilvosita va sendvich ELISA formatlarining har biri raqobatbardosh Elishay formatiga moslashtirilishi mumkin. Raqobatbardosh Elishayda inhibitor antigen va qiziqish antijeni birlamchi antikor bilan bog'lanish uchun raqobatlashadi.
Raqobatbardosh Elishay uchun etiketlanmagan antikor uning antijeni, ya'ni namunasi ishtirokida inkubatsiya qilinadi. Ushbu bog'langan antikor/antigen komplekslari keyin antigen bilan qoplangan quduqqa qo'shiladi.
Plastinka yuviladi, shuning uchun bog'lanmagan antikorlar chiqariladi. Raqobatbardosh Elishay o'z nomini oldi, chunki namunada antigen qancha ko'p bo'lsa, antigen-antikor komplekslari shunchalik ko'p hosil bo'ladi. Bu shuni anglatadiki, quduqdagi antijen bilan bog'lanish uchun kamroq bog'lanmagan antikorlar mavjud va antijenler mavjud antikor uchun raqobatlashishi kerak. Birlamchi antikorga mos keladigan ikkilamchi antikor qo'shiladi. Bu ikkinchi antikor ferment bilan bog'langan. Substrat qo'shilganda, qolgan fermentlar xromogen yoki floresan signal hosil qiladi.
Ushbu nuqtada, signalning yakuniy to'yinganligini oldini olish uchun reaktsiya to'xtatiladi.
Ba'zi raqobatbardosh Elishay to'plamlari ferment bilan bog'langan antikor o'rniga ferment bilan bog'langan antijenni o'z ichiga oladi. Belgilangan antigen namuna antijeni (yorliqsiz) bilan birlamchi antikor bog'lash joylari uchun raqobatlashadi. Namunadagi antigen qancha kam bo'lsa, quduqda etiketlangan antigen shunchalik ko'p saqlanadi va signal kuchliroq bo'ladi.
Teskari ELISA
Teskari Elishay quduq plitalarini ishlatmaydi, ammo antijenlarni sinov suyuqligida to'xtatib qo'yadi. Teskari Elishay testi antijen orqali bog'langan antikor miqdorini o'lchaydi. U G'arbiy Nil virusi konvert oqsilini va virusga xos antikorlarni qanday topishga qodirligini aniqlash va o'rganish uchun maxsus ishlab chiqilgan.
Elishay uchun qaysi fermentativ markerlar qo'llaniladi?
Quyidagi ro'yxat Elishay tahlillarida qo'llaniladigan eng keng tarqalgan enzimatik belgilarni beradi, ular tahlil natijalarini yakunlangandan keyin o'lchash imkonini beradi.
- OPD (o-fenilendiamin dihidroxlorid) ko'pincha konjugatsiyalangan oqsil sifatida ishlatiladigan HRP (horseradish peroxidase) ni aniqlash uchun sarg'ish rangga aylanadi.
- TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin) HRP aniqlanganda ko'k rangga aylanadi va sulfat yoki fosfor kislotasi qo'shilgandan keyin sarg'ayadi.
- ABTS (2,2′-Azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-sulfonik kislota]-diammoniy tuzi) HRPni aniqlashda yashil rangga aylanadi.
- PNPP (p-Nitrofenilfosfat, disodyum tuzi) gidroksidi fosfataza aniqlanganda sarg'ayadi.