ELISA tahlillari uchun namunalarni ultratovush yordamida tayyorlash

ELISA kabi tahlillar in-vitro diagnostika, kasalliklar bilan bogʻliq oqsillarni aniqlash va sifat nazorati (masalan, oziq-ovqat allergenlarini kuzatish) uchun keng qoʻllaniladi. Namunalarni ultratovush yordamida tayyorlash hujayralarni lizis qilish va hujayra ichidagi oqsillar, DNA, RNA hamda organellalarni ajratib olishning tezkor, ishonchli va takrorlanuvchan usulidir. Hielscher Ultrasonics alohida namunalar, bir nechta flakon, shuningdek, mikrotitr plastinalari va 96 quduqchali plastinalardagi namunalarni qulay tayyorlash uchun turli ultratovushli yechimlarni taklif etadi.

ELISA – ferment bilan bogʻlangan immunosorbent tahlil

ELISA ferment bilan bogʻlangan immunosorbent tahlil degan maʼnoni anglatadi va ligandlarni bogʻlash tahlillari toifasiga kiruvchi, keng qoʻllaniladigan biokimyoviy tahlil usulidir. ELISA da suyuq namuna maxsus bogʻlash xususiyatlariga ega boʻlgan harakatsiz qattiq faza ustiga qoʻshiladi. Odatda, harakatsiz qattiq faza quduqchali plastina yoki ELISA plastinasiga qoplama sifatida surtiladi. Keyin turli suyuq reagentlar ketma-ket qoʻshiladi, inkubatsiya qilinadi va yuviladi, natijada quduqchadagi yakuniy suyuqlikda optik oʻzgarish (masalan, fermentativ reaksiya mahsuloti tufayli rang hosil boʻlishi) yuz beradi. Optik oʻzgarish analit miqdorini miqdoriy “oʻqish” deb ataladigan usul bilan oʻlchash imkonini beradi. Miqdoriy oʻqishda oʻtgan yorugʻlik intensivligini aniqlash va oʻlchash uchun spektrofotometr, fluorometr yoki luminometr ishlatiladi. Aniqlash sezgirligiga tahliliy reaksiyalar davomida signalning kuchaytirilishi taʼsir qiladi. Fermentativ reaksiyalar yaxshi oʻrganilgan va ishonchli kuchaytirish jarayonlari boʻlgani uchun signalni hosil qilishda fermentlardan foydalaniladi. Aniq miqdoriy oʻlchashni taʼminlash uchun fermentlar aniqlash reagentlariga belgilangan nisbatlarda bogʻlanadi; immunosorbent tahlil nomidagi “ferment bilan bogʻlangan” iborasi ham shundan kelib chiqadi.
ELISA tahlillari mikrotitr plastinalarida / 96 quduqchali plastinalarda bajarilgani sababli, u plastina asosidagi tahlil usuli sifatida tanilgan va, masalan, klinik in-vitro diagnostika, tadqiqotlar, dori vositalarini ishlab chiqish va boshqa sohalarda antitanalar, peptidlar, oqsillar hamda gormonlarni aniqlash va ularning miqdorini oʻlchash uchun qoʻllaniladi.
ELISA usuli tibbiyot, biotexnologiya va oʻsimliklar patologiyasida diagnostika vositasi sifatida tez-tez qoʻllaniladi hamda koʻplab sanoat tarmoqlarida sifat nazoratining muhim oʻlchovi hisoblanadi.

ELISA dan oldin namunalarni ultratovush yordamida tayyorlash

ELISA tahlilini bajarishdan oldin namunalar hujayralarni lizis qilish hamda hujayra ichidagi oqsillar, DNA, RNA va boshqalarni ajratib olish kabi tayyorlash bosqichlaridan oʻtkazilishi kerak. Hujayralarni ultratovush yordamida lizis qilish va oqsillarni ajratib olishning afzalligi uning yuqori samaradorligi, ishonchliligi va takrorlanuvchanligidir. Bu omillarning barchasi yuqori sifatli diagnostika va tadqiqot natijalarini olish uchun muhimdir

ELISA dan oldin hujayralarni ultratovush yordamida lizis qilish protokoli

• Hujayra kulturalari uchun: Hujayralarni ultratovush yordamida lizis qilishdan oldin ularni mikrosentrifugada 270 x g da 5 min davomida sentrifugalang. Supernatantni aspiratsiya orqali olib tashlang va hujayralarni 30 – 100 μL RIPA buferida qayta suspenziyalang. Keyin hujayra choʻkmasini muz ustida 30 min davomida inkubatsiya qiling.
• Endi hujayra namunasi ultratovushli lizisga tayyor:
  Zondli ultratovush qurilmasidan (masalan, UP200Ht – S26d2 zondi bilan) yoki tayyorlashingiz kerak boʻlgan namunalar soniga qarab koʻp namunali ultratovush qurilmasidan (masalan, 10 tagacha flakonga bir vaqtda ultratovush bilan ishlov berish uchun VialTweeter yoki mikrotitr plastinalari / 96 quduqchali plastinalar uchun UIP400MPT) foydalaning.
  Bitta namunaga zond yordamida ultratovush bilan ishlov berish uchun hujayralarni 1,5 mL hajmli mikrosentrifuga probirkalariga joylashtiring.
• Ultratovush qurilmasining raqamli menyusida ultratovush bilan ishlov berish davomiyligi, kiritiladigan umumiy energiya, sikl rejimi va/yoki harorat chegaralarini oldindan belgilang. Bu ultratovush bilan ishlov berishning yuqori ishonchliligini va takrorlanuvchanligini taʼminlaydi.
• Sonotrodni kiriting va ultratovush qurilmasini yoqing. Namunaga bir xil ultratovush bilan ishlov berish uchun ultratovush zondining mikro-uchini namuna ichida asta harakatlantiring.
  Koʻpchilik hujayralarda ultratovushli lizis har biri 10 s davom etadigan ultratovush bilan ishlov berishning 2 – 4 siklidan soʻng yakunlanadi.
• Ultratovush bilan ishlov berilgandan keyin sonotrodni namunadan chiqarib oling. Namunalar muz ustida 5 min davomida inkubatsiya qilinishi kerak. Keyin hujayra qoldiqlarini choʻktirish uchun 10 000 x g da 20 min davomida sentrifugalang. Supernatantlarni yangi mikrosentrifuga probirkasiga oʻtkazing. Analitlarni yorliqlang va -20°C da saqlang.
• Ultratovushli sonotrodni spirt bilan yaxshilab artish yoki spirt, masalan, 70% etanol bilan toʻldirilgan laboratoriya stakanida ultratovush bilan ishlov berish orqali tozalash mumkin. Titandan tayyorlangan barcha ultratovush zondlarini avtoklavda sterilizatsiya qilish mumkin.

• Ortiqcha gemolizlangan qonni yaxshilab olib tashlash uchun toʻqimani muzdek sovuq PBS (0,01M, pH=7,4) bilan chaying.
• Toʻqimani (buyrak, yurak, oʻpka, taloq va boshqalar) torting va mayda boʻlaklarga maydalang; bu boʻlaklar PBS da gomogenizatsiya qilinadi. Kerakli PBS hajmi toʻqima ogʻirligiga bogʻliq. Umumiy qoida boʻyicha, 1g toʻqima uchun taxminan 9mL PBS kerak boʻladi. PBS ga biroz proteaza ingibitori qoʻshish tavsiya etiladi. (Muqobil ravishda, proteaza va fosfataza ingibitorlari aralashmasini oʻz ichiga olgan RIPA yoki gipotonik lizis buferidan foydalanish mumkin.)
• Toʻqima oʻlchamiga qarab, qisqa muddatli vorteks bilan ishlov berish (taxminan 1 – 2 min, 15 s lik impulslar bilan) toʻqimaga dastlabki ishlov berishda foydali boʻlishi mumkin.
• Ultratovush qurilmangizga mikro-uchni, masalan, S26d2 ni oʻrnating. Toʻqima solingan namuna probirkasini muzli vannaga joylashtiring.
• Namunaga ultratovush qurilmangiz, masalan, UP200St (80% amplituda) yordamida impuls rejimida (15s yoqilgan, 15s tanaffus) 1 min davomida ultratovush bilan ishlov bering. Namunani muzli vannada saqlang.
• Keyin tahlil uchun oqsilni boyitish maqsadida muayyan fraksiyalarni (sitozol, yadro, mitoxondriya yoki lizosoma fraksiyalarini) olish uchun gomogenatlar sentrifugalanadi. Namunani 5000×g da 5 daqiqa davomida sentrifugalash orqali supernatant olinadi.

Ultratovush bilan ishlov berish davomida haroratni ishonchli nazorat qilish

Harorat jarayonga taʼsir qiluvchi hal qiluvchi omil boʻlib, biologik namunalarga ishlov berishda, masalan, oqsillarning termik parchalanishini oldini olish uchun ayniqsa muhimdir. Namunalarni tayyorlashning barcha mexanik usullari kabi, ultratovush bilan ishlov berish ham issiqlik hosil qiladi. Biroq Hielscher Ultrasonics qurilmalaridan foydalanilganda namunalar haroratini yaxshi nazorat qilish mumkin. Biz sizga namunalarni tahlildan oldin zondli ultratovush qurilmasi yoki VialTweeter yordamida tayyorlash vaqtida ularning haroratini kuzatish va nazorat qilishning turli usullarini taqdim etamiz.

1. Namuna haroratini kuzatish: Hielscher kompaniyasining barcha raqamli ultratovush protsessorlari aqlli dasturiy taʼminot va ulanadigan harorat sensori bilan jihozlangan. Harorat sensorini ultratovush qurilmasiga ulang (masalan, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, koʻp quduqchali plastinalar uchun UIP400MTP ultratovush qurilmasi) va harorat sensorining uchini namuna probirkalaridan biriga kiriting. Raqamli rangli sensorli displey orqali ultratovush protsessori menyusida namunangizga ultratovush bilan ishlov berish uchun muayyan harorat oraligʻini belgilashingiz mumkin. Maksimal haroratga yetilganda ultratovush qurilmasi avtomatik ravishda toʻxtaydi va namuna harorati belgilangan harorat ∆ ning quyi qiymatigacha pasayguncha tanaffus qiladi. Keyin ultratovush bilan ishlov berish avtomatik ravishda yana boshlanadi. Bu aqlli funksiya issiqlik taʼsirida parchalanishning oldini oladi.
2. Koʻp namunali VialTweeter ultratovush qurilmasida namuna probirkalarini ushlab turadigan titan blokni oldindan sovitish mumkin. Titan blokni oldindan sovitish uchun VialTweeter blokini (faqat sonotrodni, oʻzgartirgichsiz!) sovitkich yoki muzlatkichga qoʻying; bu namunadagi harorat koʻtarilishini kechiktirishga yordam beradi. Iloji boʻlsa, namunaning oʻzini ham oldindan sovitish mumkin.
3. Ultratovush bilan ishlov berish davomida sovitish uchun muzli vanna yoki quruq muzdan foydalaning. Ultratovush bilan ishlov berish vaqtida namuna probirkangizni yoki probirkalaringizni muzli vannaga joylashtiring. VialTweeter uchun quruq muz bilan toʻldirilgan sayoz patnisdan foydalaning va issiqlik tez tarqalishi uchun VialTweeter qurilmasini quruq muz ustiga qoʻying.

Butun dunyodagi mijozlar biologik, biokimyoviy, tibbiy va klinik laboratoriyalarda kundalik namunalarni tayyorlash ishlarida Hielscher zondli ultratovush qurilmalaridan, shuningdek, koʻp namunaga ultratovush bilan ishlov beruvchi VialTweeter va UIP400MTP qurilmalaridan foydalanadilar. Hielscher protsessorlarining aqlli dasturiy taʼminoti va harorat nazorati yordamida harorat ishonchli nazorat qilinadi va namunaning issiqlik taʼsirida parchalanishi oldini olinadi. Hielscher ultratovushli yechimlari yordamida namunalarni ultratovush bilan tayyorlash yuqori darajada ishonchli va takrorlanuvchan natijalarni beradi!
Tahlillar uchun koʻp quduqchali plastinalarga moʻljallangan UIP400MTP ultratovush qurilmasi yordamida katta miqdordagi namunalarga ultratovush bilan ishlov berish haqida batafsil oʻqing!