Elishay tahlillari uchun ultratovush namunasi tayyorlash

Elishay kabi tahlillar in vitro diagnostika, kasallik bilan bog'liq oqsillarni aniqlash va sifatini nazorat qilish uchun keng qo'llaniladi (masalan, oziq-ovqat allergiyasini kuzatish). Ultrasonik namunani tayyorlash - bu hujayralarni lyzalash va hujayra ichidagi oqsillarni, DNK, RNK va organoidlarni ajratish uchun tezkor, ishonchli va takrorlanadigan usul. Hielscher Ultrasonics bitta namunalarni, bir nechta flakonlarni, shuningdek mikrotiter plitalari va 96 quduqli plitalarni qulay tayyorlash uchun turli ultratovushli echimlarni taklif etadi.

Elishay – Fermentlar bilan bog'langan immunosorbentni tahlil qilish

Elishay fermentlar bilan bog'langan immunosorbent tahlilini anglatadi va ligand bilan bog'laydigan tahlillar toifasining keng qo'llaniladigan biokimyoviy tahlil uslubidir. Elishayda suyuqlik biriktiruvchi statsionar qattiq fazaga maxsus bog'lanish xususiyatlariga qo'shiladi. Odatda statsionar qattiq faza quduq plitasi yoki Elishay plastinkasiga qoplama sifatida qo'llaniladi. Keyin har xil suyuqlik reagentlari ketma-ket qo'shiladi, inkubatsiya qilinadi va yuviladi, natijada quduqdagi oxirgi suyuqlikda optik o'zgarish (masalan, fermentativ reaktsiya mahsuloti bilan rang rivojlanishi) sodir bo'ladi. Optik o'zgarish analitik miqdorini miqdoriy deb ataladigan o'lchovga imkon beradi “o'qish ». Miqdoriy o'qish uchun spektrofotometr, florometr yoki lyuminometr uzatiladigan yorug'likning intensivligini aniqlash va o'lchash uchun ishlatiladi. Aniqlanish sezgirligiga analitik reaktsiyalar paytida signalning kuchayishi ta'sir qiladi. Ferment reaktsiyalari yaxshi o'rganilganligi va amplifikatsiya jarayonlari ishonchli bo'lganligi sababli signalni yaratish uchun fermentlardan foydalaniladi. To'g'ri miqdorni aniqlash uchun fermentlar aniqlangan nisbatlarda aniqlanadigan reagentlar bilan bog'langan bo'lib, bu "fermentlar bilan bog'liq" immunosorbent tahlilining nomini ham tushuntiradi.
Elishay tahlillari mikrotiter plitalarida / 96 quduqli plastinkalarda o'tkazilganligi sababli, u plastinka asosidagi tahlil usuli sifatida tanilgan va masalan, antikorlar, peptidlar, oqsillarni aniqlash va miqdorini aniqlash uchun klinik in-vitro diagnostika, tadqiqotlar, dori vositalarini ishlab chiqarishda va boshqalarda qo'llaniladi. va gormonlar.
Elishay texnikasi tibbiyot, biotexnologiya, o'simlik patologiyasida diagnostika vositasi sifatida tez-tez ishlatiladi va ko'plab sohalarda sifatni nazorat qilishning muhim o'lchovidir.

VialTweeter komplektini o'rnatish: UP200St ultrasonik protsessorida VialTweeter sonotrode

Ultratovush namuna tayyorgarlik birligi VialTweeter hujayra lizisi va ELISA tahlillaridan oldin oqsillarni ekstrakti qilish uchun ishlatiladi

Elishaydan oldin ultratovush namunasini tayyorlash

Elishay tahlilini o'tkazishdan oldin namunalar hujayra lizisini tayyorlash va hujayra ichidagi oqsillarni, DNK, RNK va boshqalarni ajratib olish jarayonlarini talab qiladi, ultratovushli hujayra lizisi va oqsil izolyatsiyasi yuqori samaradorligi, ishonchliligi va takrorlanuvchanligi. Ushbu omillarning barchasi yuqori sifatli diagnostika va tadqiqot natijalarini olish uchun muhimdir

Elishaydan oldin ultratovushli lizizning afzalliklari

Bir hil namunalarni davolash
To'liq lizis
Proteinning to'liq chiqarilishi (masalan, antikorlar, DNK)
Hujayra turiga optimal moslashish
Har qanday namuna hajmi uchun
tekrarlanabilir
Harorat bilan boshqariladi
SD-kartada ma'lumotlarni avtomatik protokollash

Elishaygacha ultratovushli hujayra lizisi uchun protokol

Hujayra madaniyati uchun: Ultratovushli hujayra lizisidan oldin mikrosentrifugada 270 xg da 5 minut davomida santrifüj xujayralari. Supernatantni aspiratsiya yo'li bilan olib tashlang va hujayralarni 30 - 100 mL RIPA tamponida qayta ishlab chiqaring. Keyin, hujayra pelletini 30 daqiqa davomida muzga soling.
Endi hujayra namunasi ultratovushli lizizga tayyor:
Zond tipidagi ultratovush tekshirgichidan foydalaning (masalan, Uf200 ः t S26d2 probi bilan) yoki ultratovushli ko'p namunali qurilma (masalan, bir vaqtning o'zida 10 flakongacha sonikatsiyalash uchun VialTweeter yoki mikrotitrli plitalar / 96 quduqli plitalar uchun UIP400MPT) tayyorlashingiz kerak bo'lgan namunalarga bog'liq.
Bitta namunaning prob tipidagi sonikatsiyasi uchun hujayralarni 1,5 ml mikrosentrifugali naychalarga joylashtiring.
Ultrasonikatorning raqamli menyusida ultratovush davomiyligini, umumiy energiya kiritilishini, tsikl rejimini va / yoki harorat chegaralarini oldindan o'rnating. Bu juda ishonchli sonikatsiyani va takrorlanuvchanlikni ta'minlaydi.
Sonotrodni o'rnating va ultratovush moslamasini yoqing. Namunani bir xil sonikatsiyalash uchun ultratovush probining mikro uchini namuna orqali muloyimlik bilan harakatlantiring.
Ko'pgina hujayralar uchun ultratovushli lizis 10 sekund sonikatsiyaning 2-4 tsiklidan so'ng tugaydi.
Sonikatsiyadan so'ng sonotrodni namunadan olib tashlang. Namunalar 5 daqiqa davomida muz ustida inkübe qilinishi kerak. Keyin, qoldiqlarni peletlash uchun 20 daqiqa davomida 10,000 xg da santrifüj qiling. Supernatantlarni yangi mikrosentrifuga naychasiga o'tkazing. Analitiklarni etiketlang va -20 ° C da saqlang.
Ultratovushli sonotrodni alkogol bilan to'ldirilgan stakanda alkogol yoki sonikat bilan yaxshilab artib tozalash mumkin, masalan, 70% etanol. Titandan tayyorlangan barcha ultratovushli problar avtoklavlanishga yaroqlidir.

To'qimalarning homogenatlari uchun:

Haddan tashqari gemoliz qonini yaxshilab tozalash uchun to'qimalarni muzli PBS (0,01M, pH = 7,4) bilan yuvib tashlang.
To'qimalarni torting (buyrak, yurak, o'pka, taloq va boshqalar) va uni mayda qismlarga bo'ling, ular PBSda bir hil holga keladi. Kerakli PBS hajmi to'qimalarning og'irligi bilan bog'liq. Qoida tariqasida, 1 g to'qima taxminan talab qiladi. 9 ml PBS. PBSga bir oz proteaz inhibitori qo'shilishi tavsiya etiladi. (RIPA yoki proteaz va fosfataza inhibitori kokteylini o'z ichiga olgan gipotonik lizis tamponidan foydalanish mumkin.)
To'qimalarning kattaligiga qarab, qisqa vorteks bilan davolash (taxminan 1-2 min. 15 sek. Pulslarda) to'qimalarni oldindan davolashda yordam beradi.
Ultrasonikatoringizga mikro uchini, masalan S26d2 ni ulang. Namuna naychasini to'qima bilan muzli hammomga joylashtiring.
Namunani ultratovush tekshirgichingiz bilan sonikatsiya qiling, masalan UP200St (80% amplituda) 1 daqiqa davomida. impuls rejimida (15 sekund yoqilgan, 15 sekundlik pauza). Namunani muzli hammomda saqlang.
Keyin homogenatlar santrifüjlanib, oqsilni tahlil qilish uchun boyitish uchun o'ziga xos hovuzlarni (sitosolik, yadro, mitoxondriyal yoki lizosomal) olish uchun olinadi. 5000 × g gacha bo'lgan namunani 5 daqiqa davomida santrifüjlash orqali, ustki moddalar olinadi.

Sonotrode MTP-24-8-96 mikrotiter plitalarining quduqlarini ultratovush qilish uchun sakkizta ultratovushli proba mavjud.

Sonikatsiya paytida haroratni ishonchli boshqarish

Harorat biologik namunalarni davolash uchun, masalan, oqsillarning termal degradatsiyasini oldini olish uchun juda muhim bo'lgan jarayonga ta'sir qiluvchi hal qiluvchi omil hisoblanadi. Barcha mexanik namunalarni tayyorlash texnikasi kabi ultratovush issiqlikni hosil qiladi. Biroq, Hielscher Ultrasonics qurilmalaridan foydalanganda namunalarning harorati yaxshi nazorat qilinishi mumkin. Sizga proba ultrasonikatori yoki VialTweeter oldindan analitik ravishda tayyorlanganda namunalaringizning haroratini kuzatish va nazorat qilishning turli xil variantlarini taqdim etamiz.

Namuna haroratini nazorat qilish: Barcha Hielscher raqamli ultratovushli protsessorlari aqlli dasturiy ta'minot va ulanadigan harorat sensori bilan jihozlangan. Harorat sensori ultratovushli qurilmaga ulang (masalan, Uf200 ः t, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) va namlik naychalarining biriga harorat sensori uchini joylashtiring. Raqamli rangli sensorli displey orqali ultratovushli protsessor menyusida ultratovush namunasi uchun ma'lum bir harorat oralig'ini o'rnatishingiz mumkin. Ultrasonikator maksimal haroratga yetganda avtomatik ravishda to'xtaydi va namuna harorati belgilangan haroratning pastki qiymatiga tushguncha to'xtaydi. Keyin sonikatsiya yana avtomatik ravishda boshlanadi. Ushbu aqlli xususiyat issiqlik ta'sirida buzilishning oldini oladi.
VialTweeter ultratovushli ko'p namunali birligi to'g'risida, namunali naychalarni ushlab turadigan titanium blokni oldindan sovutish mumkin. Titan blokini oldindan sovutish uchun muzlatgichga yoki muzlatgichga VialTweeter blokini qo'ying (faqat transdusersiz sonotrod!) Namunadagi harorat ko'tarilishini kechiktirishga yordam beradi. Iloji bo'lsa, namunaning o'zi ham oldindan sovutilishi mumkin.
Sonikatsiya paytida sovutish uchun muzli hammom yoki quruq muzdan foydalaning. Sonikatsiya paytida namuna kolbaingizni muzli hammomga joylashtiring. VialTweeter uchun quruq muz bilan to'ldirilgan sayoz laganda foydalaning va issiqlik tezda tarqalishi uchun VialTweeterni quruq muz ustiga qo'ying.

Dunyo bo'ylab mijozlar biologik, biokimyoviy, tibbiy va klinik laboratoriyalarda kundalik namunalarni tayyorlash ishlarida Hielscher prob-ultrasonikatorlari hamda VialTweeter va UIP400MTP ultratovushli ko'p sonli birliklaridan foydalanadilar. Hielscher protsessorlarining aqlli dasturiy ta'minoti va haroratni boshqarish, harorat ishonchli boshqariladi va issiqlik ta'sirida namuna parchalanishiga yo'l qo'yilmaydi. Hielscher ultratovushli echimlari bilan ultratovush namunasini tayyorlash juda ishonchli va takrorlanadigan natijalarni beradi!

Biz bilan bog'lanish! Bizdan so'rang!

Ultrasonik yuqori kesish gomogenizatorlari laboratoriya, dastgoh, uchuvchi va sanoat ishlov berishda qo'llaniladi.

Hielscher Ultrasonics laboratoriya, uchuvchi va sanoat miqyosida dasturlarni aralashtirish, tarqatish, emulsifikatsiya va ekstraktsiya qilish uchun yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqaradi.

Adabiyotlar / Adabiyotlar

Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.

Tegishli xabarlar

Bilishingiz kerak bo'lgan dalillar

Elishay turlari

Elishayning bir nechta turlari mavjud, ular ishlash printsipi bilan ajralib turadi. Ular to'g'ridan-to'g'ri Elishay, bilvosita Elishay, sendvich Elishay, raqobatdosh Elishay va teskari Elishay sifatida tanilgan. Quyida biz sizga turli xil Elishay turlari va ularning asosiy xususiyatlari va farqlari haqida umumiy ma'lumotni taqdim etamiz.
Elishay sifatli yoki miqdoriy shaklda o'tkazilishi mumkin. Sifatli natijalar oddiy ijobiy yoki salbiy natija beradi, shu bilan birga kantitativ Elishayda namunaning optik zichligi (OD) standart egri bilan taqqoslanadi, bu odatda maqsad molekulasining ma'lum konsentratsiyali eritmasining ketma-ket suyultirilishi.

To'g'ridan-to'g'ri Elishay

To'g'ridan-to'g'ri Elishay - bu Elisaning eng oddiy tahlil shakli, bu erda faqat ferment bilan belgilangan asosiy antikor ishlatiladi va ikkilamchi antikorlar talab qilinmaydi. Ferment bilan belgilangan birlamchi antikor to'g'ridan-to'g'ri maqsadga, ya'ni antigenga bog'lanadi. Tamponlangan antigen eritmasi mikrotitr plitasining har bir qudug'iga qo'shiladi (odatda 96 quduqli plitalar, Elishay plitalari), bu erda zaryadlarning o'zaro ta'siri orqali plastik yuzaga yopishadi. Birlamchi antikorga bog'langan ferment uning substrat bilan reaksiyaga kirganda, u spektrofotometr, florometr yoki lyuminometr orqali o'lchanadigan ko'rinadigan signal hosil qiladi.

Bilvosita Elishay

Bilvosita Elishay testi uchun ham asosiy antikor, ham ikkinchi darajali antikor kerak. Ammo to'g'ridan-to'g'ri Elishaydan farqli o'laroq, birlamchi antikor emas, balki ikkilamchi antikor ferment bilan belgilanadi. Antigen quduq plastinkasiga immobilizatsiya qilinadi va birlamchi antikor bilan bog'lanadi. Keyinchalik, ferment bilan belgilangan ikkilamchi antikor birlamchi antikor bilan bog'lanadi. Va nihoyat, ikkilamchi antikorga bog'langan ferment, uning substrat bilan reaksiyaga kirishib, aniqlanadigan signalni hosil qiladi.

Sendvich Elishay

To'g'ridan-to'g'ri va bilvosita Elishay sinovlarida antigen immobilizatsiya qilinadi va quduq plitasining yuzasiga qoplanadi, sendvich Elishayda antikor Elishay-plastinkaning plastik yuzasiga immobilizatsiya qilinadi. Sendvich ELISA tarkibidagi immobilizatsiya qilingan antikorlar ushlash antikorlari sifatida tanilgan. Qo'lga olish antikorlariga qo'shimcha ravishda sendvich Elishayda aniqlanadigan antitellar deb ham ataladi. Aniqlash antikorlariga etiketlanmagan birlamchi aniqlash antikorlari va fermentlar bilan belgilangan ikkilamchi aniqlash antikorlari kiradi.
Bosqichma-bosqich, qiziqish antigeni plastinkaga immobilizatsiya qilingan tutish antikoriga bog'lanadi. Keyinchalik, birlamchi aniqlash antikorlari antigen bilan bog'lanadi. Keyinchalik, ikkilamchi aniqlash antitelasi asosiy aniqlash antikoriga bog'lanadi. Oxirgi reaktsiya bosqichida ferment o'zining substrat bilan reaksiyaga kirishib, optik ravishda aniqlanishi mumkin bo'lgan ko'rinadigan signalni hosil qiladi.

Raqobatli Elishay

Elishay inhibisyoni deb ham ataladigan raqobatdosh Elishay eng murakkab Elishay turi hisoblanadi, chunki u inhibitor antigenidan foydalanishni o'z ichiga oladi. To'g'ridan-to'g'ri, bilvosita va sendvich ELISA uchta formatining har biri raqobatdosh ELISA formatiga moslashtirilishi mumkin. Raqobatli Elishayda inhibitor antigen va qiziqish antigeni birlamchi antikor bilan bog'lanish uchun raqobatlashadi.
Raqobatbardosh Elishay uchun yorliqsiz antikor o'zining antigeni, ya'ni namuna ishtirokida inkubatsiya qilinadi. Ushbu bog'langan antikor / antigen komplekslari keyinchalik antigen bilan qoplangan quduqqa qo'shiladi.
Plastinka yuviladi, shu bilan bog'lanmagan antikorlar olib tashlanadi. Raqobatbardosh Elishay o'z nomiga ega, chunki namunada antigen qancha ko'p bo'lsa, antigen-antikor komplekslari shuncha ko'p hosil bo'ladi. Bu shuni anglatadiki, quduqdagi antigen bilan bog'lanish uchun kam bog'lanmagan antikorlar mavjud va antigenlar mavjud antikor uchun raqobatlashishi kerak. Birlamchi antikorga mos keladigan ikkilamchi antikor qo'shiladi. Ushbu ikkinchi antikor ferment bilan bog'liq. Substrat qo'shilganda qolgan fermentlar xromogen yoki lyuminestsent signal hosil qiladi.
Ushbu nuqtada, signalning oxiriga qadar to'yinganligini oldini olish uchun reaktsiya to'xtatiladi.
Ba'zi raqobatdosh Elishay to'plamlari fermentlar bilan bog'langan antikor o'rniga ferment bilan bog'langan antijeni o'z ichiga oladi. Belgilangan antigen namuna antigeni bilan birlamchi antikorlarni bog'lash joylari uchun raqobatdosh (yorliqsiz). Namuna tarkibidagi antigen qancha kam bo'lsa, etiketli antigen shuncha ko'p saqlanib qoladi va signal kuchayadi.

Elishayning teskari tomoni

Teskari Elishay quduq plitalarini ishlatmaydi, ammo antigenlarni sinov suyuqligida to'xtatib turadi. Teskari Elishay testi antigen orqali bog'langan antikor miqdorini o'lchaydi. U G'arbiy Nil virusi konvertidagi oqsilni aniqlash va tekshirish va virusga xos antikorlarni qanday topish imkoniyatiga ega bo'lish uchun maxsus ishlab chiqilgan.

Elishay uchun ishlatiladigan fermentativ marker

Quyidagi ro'yxatda Elishay tahlillarida ishlatiladigan eng keng tarqalgan fermentativ belgilar mavjud bo'lib, ular tahlil natijalarini tugatgandan so'ng o'lchashga imkon beradi.

OPD (o-fenilendiamin dihidroklorid) sarg'ish rangga aylanib, ko'pincha konjuge oqsil sifatida ishlatiladigan HRP (Horseradish Peroxidase) ni aniqlaydi.
TMB (3,3′, 5,5′-tetrametilbenzidin) HRP ni aniqlaganda ko'k rangga aylanadi va oltingugurt yoki fosfor kislotasi qo'shilgandan keyin sarg'ayadi.
ABTS (2,2′-Azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-sulfan kislotasi] -diammonium tuzi) HRP ni aniqlashda yashil rangga aylanadi.
PNPP (p-Nitrofenil fosfat, Disodium Tuz) ishqoriy fosfatazani aniqlashda sarg'ayadi.