E. Coli ning ultratovushli lizisi

E. coli bakteriyalari mikrobiologiya va biotexnologiyada eng koʻp qoʻllaniladigan bakteriyalardir.
Ultratovushli hujayra parchalagichlar E. coli lizisi uchun ishonchli va takrorlanuvchan natijalar beradi.
Kuchli, shu bilan birga aniq boshqariladigan kavitatsiya va siljish kuchlari toʻliq parchalanish hamda yuqori ekstraksiya unumini taʼminlaydi (masalan, oqsillar, DNK).

Nima uchun E. coli hujayralarini ultratovush yordamida parchalash afzal usul hisoblanadi?

Ultratovushli gomogenizatorlar yoki zondli ultratovush qurilmalari E. coli lizisida bir qator afzalliklarni taqdim etadi, chunki kuchli ultratovush hujayra devorlari va membranalarini samarali parchalaydi. Zondli ultratovush qurilmalari quyidagi sabablarga koʻra E. coli lizisi uchun keng qoʻllaniladi:

Hujayra devorlarini samarali parchalash: E. coli peptidoglikandan tashkil topgan yarim qattiq hujayra devoriga ega boʻlib, uni anʼanaviy lizis usullari yordamida parchalash qiyin boʻlishi mumkin. Zondli ultratovush qurilmasi hujayralarni oʻrab turgan suyuqlikda kavitatsiya pufakchalarini hosil qiladigan kuchli ultratovush toʻlqinlarini yuzaga keltiradi. Bu pufakchalar qulaganda, yuqori tezlikdagi suyuqlik oqimchalari va zarba toʻlqinlarini hosil qiladi. Ular hujayra devorlarini mexanik ravishda parchalab, biomolekulalar kabi hujayra tarkibiy qismlarini samarali ajratib chiqaradi.

Chuqurroq kirib borish: Zond / sonotrod hosil qiladigan ultratovush toʻlqinlari namuna ichiga chuqur kirib borib, koʻproq E. coli hujayralariga yetib borishi va ularga bir tekis ishlov berishi mumkin. Bu namunaning barcha qismlarida lizisning bir xilda kechishini taʼminlashga yordam beradi va hujayralarni parchalash samaradorligini oshiradi.

Ishlov berish vaqtining qisqarishi: Zondli ultratovush qurilmasi uzatadigan energiya yuqori darajada jamlangan va mahalliy boʻlib, hujayralarning tez va samarali lizisiga olib keladi. Munchoqlar yordamida mexanik parchalash yoki fermentativ lizis kabi boshqa usullar bilan taqqoslaganda, ultratovush bilan ishlov berish E. coli lizisini bir necha daqiqa yoki hatto soniya ichida amalga oshirishi mumkin. Muzlatish va eritish kabi koʻplab muqobil usullar bir necha marta ishlov berishni talab qilsa, ultratovushli lizis hujayralarni jarayonning bitta bosqichida ochadi.

Haroratni nazorat qilish: Eng zamonaviy ultratovush qurilmalari harorat datchiklari va aqlli dasturiy taʼminot bilan jihozlangan boʻlib, jarayonning maksimal haroratini belgilash imkonini beradi. Harorat chegarasiga yetilganda ultratovush qurilmasi avtomatik ravishda tanaffus qiladi va belgilangan harorat nuqtasiga yetilganda ultratovush bilan ishlov berish jarayonini boshlaydi. Namunalarni muzli vannada sovitish namuna haroratini past saqlash va issiqlik taʼsirida namunaning buzilishining oldini olishning oddiy usulidir.

Miqyosni oshirish imkoniyati: Zondli ultratovush qurilmalari qoʻlda ushlab ishlatiladigan qurilmalardan tortib yirik sanoat modellarigacha turli oʻlchamlarda mavjud. Bu ularni laboratoriyada kichik hajmlarga ishlov berish yoki vaksina ishlab chiqarish yoxud molekulalar biosintezi kabi yirikroq biologik ishlov berish vazifalari uchun miqyosni oshirishga mos qiladi.

Koʻp maqsadli qoʻllanish: Ultratovush qurilmalari hujayra lizisidan tashqari DNKni siljish kuchlari yordamida parchalash, oqsil ekstraksiyasi, toʻqimalarni gomogenizatsiya qilish, nanozarrachalarni dispersiyalash va emulsiyalash kabi turli vazifalarda qoʻllanilishi mumkin. Shu sababli, zondli ultratovush qurilmasiga sarmoya kiritish tadqiqot yoki sanoat sharoitida turli vazifalarni bajarish imkonini beradi.

UP200St kabi zondli ultratovush qurilmalari ishonchli toʻqima gomogenizatorlari va hujayra parchalagichlardir, shu sababli genetikada namuna tayyorlash, masalan, E.coli lizisi uchun keng qoʻllaniladi

E.coli hujayralaridan oqsil ekstraksiyasi quyidagi qurilma yordamida samarali amalga oshiriladi: UP200St ultratovush zondi

Zondli ultratovush qurilmasi E. coli lizisi uchun koʻplab afzalliklarni taqdim etadi. Ultratovush jarayoni parametrlarini ishonchli va aniq boshqarish kerakli natijalarga erishish uchun quvvat, davomiylik va namuna bilan ishlash kabi ish parametrlarini optimallashtirish imkonini beradi.

Ushbu qo‘llanmada laboratoriya, tahlil va tadqiqot ishlarida lizis, hujayralarni parchalash, oqsillarni ajratib olish, DNK va RNKni fragmentlarga ajratish kabi namuna tayyorlash vazifalari uchun qaysi turdagi sonikator eng mos kelishi tushuntiriladi. Qo‘llanilish sohasi, namuna hajmi, namunalar soni va ishlov berish unumdorligiga mos sonikator turini tanlang. Hielscher Ultrasonics siz uchun eng mos ultratovush gomogenizatoriga ega!

Ultratovushli DNK fragmentatsiyasi koʻpincha yangi avlod sekvenslashida (NGS) namuna tayyorlash bosqichi sifatida qoʻllaniladi

0 – 15 min davomida ultratovush bilan ishlov berilgan E. coli EDL933 genomik DNKsining elektroforetik tahlillari. L DNK oʻlcham markerini bildiradi.
(tadqiqot va tasvir: ©Basselet et al. 2008)

Ultratovushli kavitatsiya yordamida hujayralarni parchalash

Zondli ultratovushli gomogenizatorlar soniyasiga taxminan 20 000 sikl bilan ishlaydi (20kHz da) va suyuqliklar yoki suspenziyalarda kavitatsiya hosil qiladi. Akustik kavitatsiya vakuumga oʻxshash bosim va yuqori haroratli mikroskopik sohalarni hosil qilib, hujayralarni parchalab tashlaydi. Harorat bir necha ming daraja Selsiyga yetishi mumkin boʻlsa-da, kavitatsiya hajmlari shunchalik kichikki, ular jarayonni sezilarli darajada qizdirmaydi. Ultratovush hosil qiladigan akustik kavitatsiya va siljish kuchlari E.coli kabi bakteriya hujayralarining membranasini teshadi yoki parchalaydi. Hielscher ultratovush qurilmalari ultratovush intensivligi, amplituda, kiritiladigan energiya va harorat kabi jarayon parametrlarini aniq boshqarish imkonini beradi. Shu tariqa, ultratovushli lizis jarayonini hujayra turi, hujayra kulturasi va jarayon maqsadiga optimal moslashtirish mumkin.

Ultratovushli lizisning afzalliklari

lizisni aniq boshqarish (intensivlik, amplituda, harorat)
ishonchli, takrorlanuvchan natijalar
muayyan namunalarga optimal moslashtirish
haroratni nazorat qilish
juda kichikdan juda kattagacha boʻlgan namunalar uchun (µL dan litrgacha)
faqat mexanik ishlov berish
foydalanish uchun qulay, xavfsiz ishlash
laboratoriyadan ishlab chiqarishgacha miqyosni chiziqli oshirish

VialTweeter ultratovush qurilmasi bir xil jarayon sharoitlarida 10 tagacha flakondagi namunalarni bir vaqtda tayyorlash imkonini beradi. (Kattalashtirish uchun bosing!)

VialTweeter ultratovushli lizis uchun

Ultratovushli gomogenizator va boshqa lizis usullari

Kimyoviy va fermentativ lizis muammoli boʻlishi mumkin – chunki kimyoviy lizis oqsil tuzilmalarini oʻzgartirishi va tozalash muammolarini keltirib chiqarishi mumkin, fermentativ lizis esa uzoq inkubatsiya vaqtini talab qiladi va takrorlanuvchan emas – ultratovush yordamida parchalash ilgʻor, tezkor hujayra parchalash usulidir.
Ultratovushli lizis faqat mexanik kuchlarga asoslanadi. Hech qanday kimyoviy moddalar qoʻshilmaydi, ultratovush bilan ishlov berish hujayra devorini siljish kuchlari yordamida parchalaydi. Kimyoviy lizis oqsil tuzilmasini oʻzgartirishi va tozalash muammolarini keltirib chiqarishi mumkin. Fermentativ parchalash uzoq inkubatsiya vaqtini talab qiladi va takrorlanuvchan emas. E.coli bakteriya hujayralarini ultratovush yordamida parchalash tez, oddiy, ishonchli va takrorlanuvchandir. Shu sababli Hielscher ultratovush qurilmalari butun dunyodagi biologiya va biokimyo laboratoriyalarida namuna tayyorlash, tahlildan oldingi ishlar, in-vitro diagnostika va turli tahlillar uchun qoʻllaniladi.

Ultratovushli lizis boʻyicha umumiy tavsiyalar

Ultratovush bilan ishlov berish juda kichik, oʻrta va katta miqdordagi hujayra suspenziyalarini lizis qilishning eng ommabop usulidir – pikolitrlardan 100L/hr gacha (ultratovushli oqim hujayrasidan foydalanilganda). Hujayralar suyuqlikdagi siljish kuchlari va kavitatsiya yordamida lizis qilinadi. Ultratovush bilan ishlov berish vaqtida DNK ham siljish kuchlari taʼsirida parchalanadi, shu sababli hujayra suspenziyasiga DNaza qoʻshish zarur emas.

E.coli ning ultratovushli lizisi davomida haroratni nazorat qilish
Namunani oldindan sovitish va ultratovush bilan ishlov berish davomida muz ustida saqlash orqali namunaning issiqlik taʼsirida buzilishini osonlik bilan oldini olish mumkin.
Ideal holatda, lizis davomida namunalar muzdek sovuq saqlanishi kerak, biroq koʻpchilik namunalar uchun harorat kultura yoki toʻqima olingan manba haroratidan oshmasa kifoya. Shu sababli suspenziyani muz ustida saqlash va bir necha qisqa, 5–10 sec ultratovush impulslari bilan, ular orasida 10–30 sec tanaffuslar qilib ishlov berish tavsiya etiladi. Tanaffuslar davomida issiqlik tarqalib, past haroratni qayta tiklash imkonini beradi. Kattaroq hujayra namunalari uchun sovitish qobiqlariga ega turli oqim hujayrasi reaktorlari mavjud.
Ultratovushli lizisni muvaffaqiyatli amalga oshirish uchun batafsil maslahat va tavsiyalarni shu yerda oʻqing!

E. Coli lizatlarini ultratovush yordamida tayyorlash protokollari

Tadqiqotchilar E.coli hujayralarini parchalash uchun Hielscher ultratovushli gomogenizatorlaridan foydalanadilar. Quyida E. coli bilan bogʻliq turli vazifalar uchun Hielscher ultratovushli gomogenizatorlari yordamida E.coli lizisini amalga oshirishning sinovdan oʻtgan va tasdiqlangan turli protokollarini topishingiz mumkin.

Ultratovush yordamida E. coli hujayralarini oʻstirish, koʻndalang bogʻlash va hujayra ekstraktlarini tayyorlash

SeqA va RNK-polimeraza ChIP-Chip uchun E. coli MG1655 yoki MG1655 ΔseqA 37°C da OD₆₀₀ qiymati taxminan 0,15 ga yetguncha 50 ml LB (+ 0,2% glyukoza) muhitida oʻstirildi, soʻng har bir ml muhitga 27 μl formaldegid (37%) qoʻshildi (yakuniy konsentratsiya 1%). Koʻndalang bogʻlash xona haroratida sekin chayqatish (100 rpm) bilan 20 min davomida amalga oshirildi, soʻng 10 ml 2,5 M glitsin bilan reaksiya toʻxtatildi (yakuniy konsentratsiya 0,5 M). Issiqlik shoki tajribalari uchun E. coli MG1655 65 ml LB muhitida 30°C da OD₆₀₀ qiymati taxminan 0,3 ga yetguncha oʻstirildi. Shundan soʻng 30 ml kultura oldindan 43°C gacha isitilgan kolbaga koʻchirildi, qolgan qismi esa 30°C da saqlandi. Koʻndalang bogʻlash va reaksiyani toʻxtatish yuqorida taʼriflanganidek bajarildi, faqat xona haroratida keyingi sekin chayqatishdan oldin hujayralar 30 yoki 43°C da 5 min saqlandi. Hujayralar sentrifugalash orqali yigʻildi va sovuq TBS (pH7.5) bilan ikki marta yuvildi. 1 ml lizis buferida (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saxaroza, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizotsim) qayta suspenziyalash va 37°C da 30 min inkubatsiyadan soʻng 4 ml IP buferi qoʻshildi. Keyin hujayralarga muz ustida Hielscher UP400St ultratovush protsessori yordamida 100% quvvat sozlamasida 12 marta 30 sec dan, orada 30 sec tanaffuslar bilan ultratovush bilan ishlov berildi. 9000 g da 10 min sentrifugalashdan soʻng supernatantning 800 μl alikvotalari -20°C da saqlandi. (Waldminghaus 2010)

Ultratovush zondi yordamida fermentlarni ortiqcha miqdorda ishlab chiqarish va tozalash

Dekagistidin (His10) yorligʻi bilan belgilangan oqsillarni ortiqcha miqdorda ishlab chiqarish uchun E. coli BL21(DE3) pET19b konstruksiyalari bilan transformatsiya qilindi. Tun davomida oʻstirilgan dastlabki kultura sentrifugalash orqali yigʻildi va uning 1% qismi ekspressiya kulturasiga ekish uchun ishlatildi. pET19mgtB ni tashuvchi hujayralar 22°C da 600 nm dagi optik zichlik (OD600) 0,7 ga yetguncha oʻstirildi. Kultura 17°C ga oʻtkazildi va 100 μM IPTG bilan induksiya qilindi. 16 h dan soʻng kultura 4°C da 7 500 × g bilan sentrifugalash orqali yigʻildi. Hujayralar pH 7,4 da 0,3 M NaCl tutgan 50 mM fosfat bilan buferlangan fiziologik eritmada (PBS) qayta suspenziyalandi va Hielscher UP200St ultratovush qurilmasiga oʻrnatilgan S2 mikro uchli sonotrod yordamida 0,5 sikl va 75% amplitudada ultratovush bilan ishlov berib parchalandi.
Dekagistidin yorligʻi bilan belgilangan GtfC ning ortiqcha miqdorda ishlab chiqarilishi 37°C da OD₆₀₀ qiymati 0,6 boʻlganda 100 μM IPTG bilan induksiya qilindi. Keyin hujayralar 4 h davomida inkubatsiya qilindi, yigʻildi va MgtB uchun yuqorida koʻrsatilganidek lizis qilindi.
Hujayra qoldiqlarini choʻktirish uchun xom hujayra ekstraktlari 15 000 × g va 4°C da sentrifugalandi. Tiniqlashtirilgan ekstraktlar ÄKTAprime Plus tizimi yordamida 1-ml HisTrap FF Crude kolonkalarga yuklandi. Fermentlar His yorligʻi bilan belgilangan oqsillarni gradientli elyutsiya qilish boʻyicha ishlab chiqaruvchi protokoliga muvofiq tozalandi. Elyutsiya qilingan oqsil eritmalari 4°C da 0,3 M NaCl tutgan 50 mM PBS, pH 7,4 ning 1 000 hajmiga qarshi ikki marta dializ qilindi. Tozalash 12% SDS-PAGE yordamida tahlil qilindi. Oqsil konsentratsiyasi Roti-Quant yordamida Bradford usuli bilan aniqlandi. (Rabausch et al. 2013)

E. coli bakteriyalaridan oqsilni ultratovush yordamida ekstraksiya qilish
Tadqiq qilinayotgan oʻlja oqsil (bu holatda Arabidopsis thaliana ning MTV1 oqsili) GST yorligʻi bilan birlashtiriladi va BL21 Escherichia coli (E. coli) hujayralarida ekspressiya qilinadi.

GST-MTV1 va GST ning har biridan bittadan choʻkma oling (50 ml bakteriya kulturasiga mos keladi) va har birini 2,5 mL muzdek sovuq ekstraksiya buferida qayta suspenziyalang.
Bakteriya hujayralarini lizis boʻlguncha parchalash uchun UP100H ultratovush qurilmasidan foydalaning (taxminan 2–5mL kichik hajmlar uchun MS3 mikro uchli sonotrod bilan jihozlangan). Lizis xiralikning kamayishi va qovushqoqlikning oshishi bilan belgilanadi. Bu ish muz ustida bajarilishi kerak va ultratovush bilan oraliqli ishlov berish tavsiya etiladi (masalan, 10 sec ultratovush bilan ishlov berish, soʻng muz ustida 10 sec tanaffus va hokazo). Haddan tashqari yuqori intensivlikda ultratovush bilan ishlov bermaslikka ehtiyot boʻlish kerak. Agar koʻpiklanish yoki oq choʻkma hosil boʻlishi aniqlansa, intensivlikni pasaytirish kerak.
Lizis qilingan bakteriyalar eritmasini 1,5 mL mikrosentrifuga probirkalariga koʻchiring va 4°C da 16 000 x g bilan 20 min davomida sentrifugalang.

Ultratovush zondlari hujayralarni parchalash va E.coli dan molekulalar hamda DNKni ekstraksiya qilish uchun akustik kavitatsiya kuchlaridan foydalanadi.

UP400St kabi zondli ultratovush qurilmalari E.coli ni samarali lizis qilish uchun akustik kavitatsiyaning ishlash tamoyilidan foydalanadi.

Ultratovush bilan ishlov berish yordamida rekombinant oqsil ekspressiyasini tahlil qilish va uni tozalash

E. coli choʻkmasiga Hielscher UP100H ultratovush qurilmasi bilan ultratovush bilan ishlov berildi. Buning uchun hujayra choʻkmasi sovitilgan lizis buferida (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) qayta suspenziyalandi va muz ustida 10 min sovitildi. Keyin hujayra suspenziyasiga 10 ta qisqa, 10 s ultratovush impulsi bilan, har biridan soʻng sovitish uchun 30 s tanaffus qilib ishlov berildi. Nihoyat, hujayra qoldiqlari 4°C da 14 000 rpm bilan 15 min davomida ultrasentrifugalash orqali olib tashlandi. rPR ekspressiyasini tasdiqlash uchun supernatant 12% poliakrilamid gelida ajratildi va SDS-PAGE hamda Western blotting yordamida tahlil qilindi. rPR ni tozalash ishlab chiqaruvchi qoʻllanmasiga muvofiq Ni2+-NTA smolasi (Invitrogen, AQSH) yordamida amalga oshirildi. Bu bosqichda nativ holatda tozalash usuli qoʻllanildi. Tozalangan oqsilning tozaligi 12% poliakrilamid gelida elektroforez va undan keyingi Coomassie koʻki bilan boʻyash yordamida baholandi. Tozalangan oqsil konsentratsiyasi Micro BCA oqsil tahlili toʻplami (PIERCE, AQSH) bilan oʻlchandi. (Azarnezhad et al. 2016)

Ushbu videoda laboratoriya namunalarini dispersiyalash, gomogenlash, ekstraksiya qilish yoki gazsizlantirish uchun 200 vatt quvvatli ultratovushli cuphorn ko‘rsatilgan.

E. coli lizisi uchun ultratovushli gomogenizatorlar

Hielscher Ultrasonics E. coli bakteriyalari va boshqa hujayra turlari, toʻqimalar hamda hujayra kulturalarini ishonchli va samarali lizis qilish uchun yuqori unumli ultratovushli gomogenizatorlarni loyihalaydi, ishlab chiqaradi va yetkazib beradi.
Ultratovush zondlari hamda bilvosita ultratovush bilan ishlov berish tizimlarining keng assortimenti hujayralarni parchalash va ekstraksiya qilish vazifangiz uchun ideal ultratovushli toʻqima gomogenizatorini taklif qilishimizga imkon beradi.

Loyihalash, ishlab chiqarish va maslahat – Germaniyada yaratilgan sifat

Hielscher ultratovush qurilmalari eng yuqori sifat va dizayn standartlari bilan mashhur. Aqlli dasturiy taʼminot, intuitiv menyu, dasturlashtiriladigan sozlamalar va maʼlumotlarni avtomatik qayd etish Hielscher ultratovush qurilmalarining ayrim xususiyatlaridir. Mustahkamlik va foydalanishning osonligi ultratovush qurilmalarimizni tadqiqot va biotexnologiya muassasalariga muammosiz integratsiya qilish imkonini beradi. Hielscher ultratovush qurilmalari hatto ogʻir sharoitlar va yuqori talablar qoʻyiladigan muhitlarda ham oson ishlaydi.

Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatiga ega kompaniya boʻlib, eng zamonaviy texnologiyalar va foydalanish qulayligini oʻzida mujassam etgan yuqori unumli ultratovush qurilmalariga alohida eʼtibor qaratadi. Albatta, Hielscher ultratovush qurilmalari CE talablariga mos keladi hamda UL, CSA va RoHs talablarini qondiradi.

Quyidagi jadval ultratovush qurilmalarimizning taxminiy ishlov berish quvvati haqida tasavvur beradi:

Partiya hajmi	Hajmiy oqim tezligi	Tavsiya etiladigan qurilmalar
koʻp uyali / mikrotitr plastinkalar	n.a.	UIP400MTP
Flakonlar yoki stakan uchun CupHorn	n.a.	Ultratovushli CupHorn
ultratovushli mikrooqim reaktori	n.a.	GDmini2
0,5 dan 1,5mL gacha hajmli 10 tagacha flakon	n.a.	VialTweeter
0,5 dan 1,5mL gacha	n.a.	VialTweeter
1 dan 500mL gacha	10 dan 200mL/min gacha	UP100H
10 dan 2000mL gacha	20 dan 400mL/min gacha	UP200Ht, UP400St
0,1 dan 20L gacha	0,2 dan 4L/min gacha	UIP2000hdT
10 dan 100L gacha	2 dan 10L/min gacha	UIP4000
n.a.	10 dan 100L/min gacha	UIP16000
n.a.	kattaroq	quyidagi qurilmalar klasteri: UIP16000

Biz bilan bogʻlaning! / Bizdan soʻrang!

Videoda istalgan standart ko‘p quduqchali planshetdagi namunalarni yuqori intensivlikdagi ultratovush yordamida ishonchli tayyorlash imkonini beruvchi UIP400MTP tizimi ko‘rsatilgan. UIP400MTP odatda hujayra lizisi, DNK, RNK va xromatinni parchalash hamda oqsillarni ekstraksiya qilish uchun qo‘llaniladi.

E. coli ning ultratovushli lizisi uchun qoʻshimcha protokollar

Ultratovushli VialTweeter yordamida E. coli dagi allitsin bilan modifikatsiyalangan oqsillar

5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoy kislota) (DTNB) tahlili yordamida sulfgidril miqdorini aniqlash
Tun davomida oʻstirilgan E. coli MG1655 kulturasi MOPS minimal muhitiga ekish uchun ishlatildi (1:100). Kultura A600 qiymati 0,4 ga yetguncha aerob sharoitda oʻstirildi. Stress taʼsirini qoʻllash uchun kultura uchta 15-ml kulturaga boʻlindi. Ishlov berilmagan kultura manfiy nazorat sifatida xizmat qildi. Qolgan ikki kulturaning biriga 0,79 mM allitsin (128 μg ml-1), ikkinchisiga esa 1 mM diamid qoʻshildi. Kulturalar 15 min davomida inkubatsiya qilindi. Har bir kulturadan 5 ml sentrifugalash orqali yigʻildi (8 525 × g, 4°C, 10 min). Hujayralar 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, foydalanishdan oldin anaerob sharoitda saqlangan) bilan ikki marta yuvildi va sentrifugalandi (13 000 × g, 4°C, 10 min). Hujayralar 4°C da ultratovush bilan ishlov berib parchalanishidan oldin lizis buferida (6 mM guanidiniy HCl tutgan PBS, pH 7,4) qayta suspenziyalandi (VialTweeter ultratovush qurilmasi, Hielscher GmbH, Germaniya) (3 × 1 min). Hujayra qoldiqlari sentrifugalash orqali choʻktirildi (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant magnitli aralashtirgich tayoqchasi boʻlgan 3,5-ml QS-macro kyuvetaga (10 mm) koʻchirildi va 1 ml lizis buferi bilan aralashtirildi. Namunalarning optik yutilishi xona haroratida PSC-718 harorati boshqariladigan kyuveta tutqichi bilan jihozlangan Jasco V-650 spektrofotometri yordamida 412 nm da kuzatildi. 3 mM ditiobis(2-nitrobenzoy kislota) eritmasidan 100μl qoʻshildi. Optik yutilish toʻyinguncha kuzatildi. Tiol konsentratsiyasini hisoblashda ekstinksiya koeffitsiyenti ϵ₄₁₂ = 13 700 M^-1 cm^-1 tio-2-nitrobenzoy kislota (TNB) uchun qoʻllanildi. Hujayradagi tiol konsentratsiyalari E. coli hujayralarining 6,7 × 10^-15 litr hajmi va A600 = 0,5 hujayra zichligi asosida hisoblandi (bu kultura uchun 1 × 10⁸ hujayra ml^-1 ga teng). (Müller et al. 2016)

Ultratovushli hujayra parchalagich yordamida in vivo glutationni aniqlash

E.coli MG1655 MOPS minimal muhitida jami 200ml hajmda A600 qiymati 0,5 ga yetguncha oʻstirildi. Stress taʼsirini qoʻllash uchun kultura 50-ml kulturalarga boʻlindi. 0,79 mM allitsin, 1 mM diamid yoki dimetil sulfoksid (nazorat) bilan 15 min inkubatsiyadan soʻng hujayralar 4°C da 4 000g bilan 10 min davomida yigʻildi. Choʻkmalar 700µl KPE buferida qayta suspenziyalanishidan oldin hujayralar KPE buferi bilan ikki marta yuvildi. Oqsillarni olib tashlash uchun hujayralarni ultratovush bilan ishlov berib parchalashdan oldin 300l 10% (w/v) sulfosalitsil kislota qoʻshildi (3 x 1 min; VialTweeter ultratovush qurilmasi). Supernatantlar sentrifugalashdan soʻng yigʻildi (30 min, 13 000g, 4°C). 3 hajm KPE buferi qoʻshish orqali sulfosalitsil kislota konsentratsiyalari 1% gacha pasaytirildi. Umumiy glutation va GSSG miqdorlari yuqorida taʼriflanganidek oʻlchandi. Hujayradagi glutation konsentratsiyalari E. coli hujayralarining 6,7×10^-15 litr hajmi va A600 0,5 hujayra zichligi asosida hisoblandi (bu kultura uchun 1×10⁸ hujayra ml^-1 ga teng). GSH konsentratsiyalari umumiy glutationdan 2[GSSG] ni ayirish orqali hisoblandi. (Müller et al. 2016)

Ultratovushli gomogenizator yordamida E. coli da odam mAspAT oqsilining ekspressiyasi

Ekspressiya vektorini tashuvchi E. coli BL21 (DE3) ning bitta koloniyasi 100μg/mL ampitsillin tutgan 30 mL Luria-Bertani (LB) muhitiga joylashtirildi va soʻng 37ºC da optik zichlik (OD₆₀₀) 0,6 ga yetguncha oʻstirildi. Hujayralar 4 000 × g da 10 min sentrifugalash orqali yigʻildi va 100μg/mL ampitsillin tutgan 3L yangi LB muhitida qayta suspenziyalandi.
Shundan soʻng oqsil ekspressiyasi 16ºC da 20 h davomida 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) bilan induksiya qilindi. Hujayralar 8 000 × g da 15 min sentrifugalash orqali yigʻildi va A buferi (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) bilan yuvildi. 3 L kulturadan taxminan 45g (nam massa) hujayra olindi. Sentrifugalashdan soʻng hujayra choʻkmalari 40 mL (1 L kultura uchun) muzdek sovuq A ekstraksiya buferida qayta suspenziyalandi va Hielscher UP400St ultratovushli hujayra parchalagichi yordamida muzdek sovuq haroratda ultratovush bilan ishlov berib lizis qilindi. Eruvchan (supernatant) va choʻkkan (choʻkma) fraksiyalarni ajratish uchun hujayra lizati 12 000 rpm da 15 min davomida sentrifugalandi. (Jiang et al. 2015)

Tegishli mavzular

Bilishga arziydigan maʼlumotlar

E.coli

Escherichia coli (E. coli) – Escherichia turkumiga mansub gram-manfiy, fakultativ anaerob, tayoqchasimon, koliform bakteriya boʻlib, odatda issiq qonli organizmlar (endotermlar) ichagining quyi qismida uchraydi. Turli xususiyatlarga ega koʻplab E. coli shtammlari (yoki kichik turlari) mavjud. E. coli shtammlarining aksariyati odamlar uchun zararsiz, masalan, laboratoriyalarda tadqiqotlar uchun keng qoʻllaniladigan B va K-12 shtammlari. Biroq ayrim shtammlar zararli boʻlib, jiddiy kasalliklarni keltirib chiqarishi mumkin.
E. coli zamonaviy biologik muhandislik va sanoat mikrobiologiyasida muhim rol oʻynaydi, chunki bu bakteriya bilan ishlash oson. E. coli koʻpincha qoʻllaniladigan odatiy laboratoriya vazifalari jumlasiga, masalan, rekombinant dezoksiribonuklein kislota (DNK) yaratish yoki undan model organizm sifatida foydalanish kiradi.
E. coli geterologik oqsillarni ishlab chiqarish uchun juda koʻp maqsadli xoʻjayin organizmdir va E. coli da rekombinant oqsillarni ishlab chiqarish uchun turli oqsil ekspressiyasi tizimlari mavjud. Oqsilning yuqori darajadagi ekspressiyasini taʼminlaydigan plazmidlar yordamida bakteriyaga genlarni kiritish mumkin, bu esa sanoat fermentatsiyasi jarayonlarida bunday oqsillarni katta miqdorda ishlab chiqarish imkonini beradi.
E.coli insulin ishlab chiqarish uchun hujayra fabrikalari sifatida qoʻllaniladi. Boshqa qoʻllanishlar modifikatsiyalangan E. coli hujayralaridan vaksinalar va immobilizatsiyalangan fermentlarni ishlab chiqish va ishlab chiqarish, bioyoqilgʻi ishlab chiqarish hamda bioremediatsiya uchun foydalanishni oʻz ichiga oladi.
K-12 shtammi E. coli ning ishqoriy fosfataza (ALP) fermentini ortiqcha miqdorda ekspressiya qiladigan mutant shaklidir. Bu mutatsiya fermentni doimiy ravishda kodlaydigan gendagi nuqson tufayli yuzaga keladi. Agar gen hech qanday tormozlanishsiz mahsulot hosil qilsa, bu konstitutiv faollik deb ataladi. Ushbu muayyan mutant shakl ALP fermentini ajratib olish va tozalash uchun ishlatiladi.
E. coli bakteriyalari hujayra fabrikalari sifatida ham keng qoʻllaniladi. Muhandislik yoʻli bilan oʻzgartirilgan mikroblar (masalan, bakteriyalar) va oʻsimlik hujayralaridan hujayra fabrikalari deb ataladigan tizimlar sifatida foydalanish mumkin. Ushbu genetik modifikatsiyalangan hujayralar, masalan, farmatsevtika, oziq-ovqat va kimyo sanoatida qoʻllaniladigan molekulalar, kimyoviy moddalar, polimerlar, oqsillar va boshqa moddalarni ishlab chiqaradi. Bunday biomuhandislik yoʻli bilan yaratilgan hujayralar ichida ishlab chiqarilgan molekulalarni ajratib chiqarish uchun ultratovushli lizis hujayra devorlarini parchalash va maqsadli moddalarni atrofdagi suyuqlikka oʻtkazishning keng tarqalgan usulidir. Biomuhandislik yoʻli bilan yaratilgan hujayralar lizisi haqida koʻproq oʻqing!

DNKni ultratovushli siljish kuchlari yordamida parchalash

Ultratovushli siljish kuchlari hujayra ichidan molekulalar, organellalar va oqsillarni ajratib chiqarish, shuningdek, DNK zanjirlarini boʻlaklarga parchalash uchun keng qoʻllaniladigan usuldir. Akustik kavitatsiya hujayralardan DNKni ekstraksiya qilish va uzunligi taxminan 600 – 800 bp boʻlgan fragmentlarni hosil qilish uchun hujayra devorlari va membranalarini parchalaydi; bu uzunlik tahlil uchun idealdir.
DNK fragmentatsiyasi uchun ultratovushli gomogenizatorlar haqida koʻproq bilish uchun shu yerni bosing!

Adabiyotlar / Manbalar

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Yuqori unumli ultratovush texnologiyasi! Hielscher mahsulotlari assortimenti ixcham laboratoriya ultratovush qurilmalaridan stol usti qurilmalari orqali toʻliq sanoat ultratovush tizimlarigacha boʻlgan butun koʻlamni qamrab oladi.

Hielscher Ultrasonics yuqori unumli ultratovushli gomogenizatorlarni laboratoriya oʻlchamidan sanoat oʻlchamigacha ishlab chiqaradi.