E. bobini ultratovush erishi

  • E. coli bakteriyalar Mikrobiologiya va biotexnologiya eng keng tarqalgan ishlatiladigan bakteriyalar bor.
  • Ultratovush Uyali voqealari solishi E. coli parchalanishi uchun ishonchli va tekrarlanabilir natijalar beradi.
  • Qizg'in hali aniq boshqariladigan Kavitasyonun va ketish kuchlari to'liq izdan va yuqori qazib olish hosildorlikning (masalan oqsillar, DNK) olib.

Nima uchun E. coli ning ultratovushli hujayra buzilishi afzal qilingan usul?

Ultrasonik gomogenizatorlar yoki prob tipidagi ultrasonikatorlar E. coli lizisi uchun bir qancha afzalliklarni taklif qiladi, chunki kuchli ultratovush hujayra devorlari va membranalarini samarali ravishda buzadi. Prob tipidagi ultratovush apparatlari quyidagi sabablarga ko'ra E. coli lizisi uchun keng qo'llaniladi:

  • Hujayra devorlarining samarali buzilishi: E. coli peptidoglikandan tashkil topgan yarim qattiq hujayra devoriga ega bo'lib, uni an'anaviy liziz usullari yordamida sindirish qiyin. Prob tipidagi ultrasonikator hujayralarni o'rab turgan suyuqlikda kavitatsiya pufakchalarini yaratadigan kuchli ultratovush to'lqinlarini hosil qiladi. Ushbu pufakchalar yiqilganda, ular yuqori tezlikda suyuqlik oqimi va zarba to'lqinlarini hosil qiladi, bu esa hujayra devorlarining mexanik buzilishiga olib keladi va biomolekulalar kabi hujayra tarkibini samarali ravishda chiqaradi.
  • Kengaytirilgan penetratsiya: Prob / sonotrode tomonidan ishlab chiqarilgan ultratovush to'lqinlari namunaga chuqur kirib, ko'proq E. coli hujayralariga etib boradi va ularni teng ravishda davolashi mumkin. Bu lizizning namuna bo'ylab bir xil bo'lishini ta'minlashga yordam beradi, natijada hujayra buzilishi samaradorligi yuqori bo'ladi.
  • Qisqartirilgan ishlov berish vaqti: Prob tipidagi ultrasonikator tomonidan etkazib beriladigan energiya yuqori darajada konsentratsiyalangan va mahalliylashtirilgan bo'lib, hujayraning tez va samarali parchalanishiga olib keladi. Boncuk urish yoki fermentativ lizis kabi boshqa usullar bilan solishtirganda, sonikatsiya bir necha daqiqa yoki hatto soniya ichida E. coli lizisiga erishishi mumkin. Muzlatib eritish kabi ko'plab muqobil texnikalar bir necha bosqichli davolanishni talab qilsa-da, ultratovushli lizis hujayralarni bir jarayon bosqichida ochadi.
  • Harorat nazorat qilish: Zamonaviy ultrasonikatorlar harorat sensorlari va aqlli dasturiy ta'minot bilan jihozlangan bo'lib, ular maksimal jarayon haroratini o'rnatish imkonini beradi. Ultrasonikator harorat chegarasiga yetganda avtomatik ravishda pauza qiladi va belgilangan harorat nuqtasiga erishilganda sonikatsiya jarayonini boshlaydi. Namunalarni muzli hammomda sovutish namuna haroratini past darajada ushlab turish va issiqlik ta'sirida namuna degradatsiyasini oldini olishning oddiy usuli hisoblanadi.
  • Masshtablilik: Prob tipidagi ultrasonikatorlar turli o'lchamlarda mavjud, qo'lda ishlaydigan qurilmalardan yirik sanoat modellarigacha. Bu ularni laboratoriyada kichik hajmlarni qayta ishlash yoki kattaroq bioprocessing ilovalari, masalan, vaktsina ishlab chiqarish yoki molekulalarning biosintezi uchun kengaytirish uchun mos qiladi.
  • Ko'p qirralilik: Ultrasonikatorlar DNKni kesish, oqsillarni ekstraktsiya qilish, to'qimalarni homogenlashtirish, nanopartikullarning tarqalishi va emulsifikatsiyasi kabi hujayra lizisidan tashqari turli xil ilovalar uchun ishlatilishi mumkin. Shuning uchun, zond tipidagi ultratovush qurilmasiga sarmoya kiritish tadqiqot yoki sanoat sharoitida ko'p qirralilikni ta'minlaydi.
  • UP200St kabi prob tipidagi ultrasonikatorlar ishonchli to'qimalarni gomogenizatorlari va hujayra maydalagichlari bo'lib, shuning uchun genetikada namunalar tayyorlash uchun keng qo'llaniladi, masalan, E.coli lizisi uchun.

    E.coli hujayralaridan oqsil olish samarali amalga oshiriladi ultratovushli probi UP200St

    Prob tipidagi ultrasonikator E. coli lizisi uchun juda ko'p afzalliklarni taqdim etadi. Ultrasonik jarayon parametrlari ustidan ishonchli va aniq nazorat istalgan natijalarga erishish uchun quvvat, davomiylik va namunani qayta ishlash kabi operatsion parametrlarni optimallashtirish imkonini beradi.
     

    Ma'lumot so'rovini




    Bizning e'tibor bering Maxfiylik siyosati.


     

    Ushbu qo'llanmada laboratoriyalarda liziz, hujayra buzilishi, oqsil izolyatsiyasi, DNK va RNK parchalanishi, tahlil va tadqiqotlar kabi namuna tayyorlash vazifalaringiz uchun qaysi turdagi sonikator eng yaxshi ekanligini tushuntiradi. Ilovangiz, namuna hajmi, namuna raqami va o'tkazish qobiliyati uchun ideal sonikator turini tanlang. Hielscher Ultrasonics siz uchun ideal ultratovushli homogenizatorga ega!

    Fan va tahlilda hujayra buzilishi va oqsil olish uchun mukammal sonikatorni qanday topish mumkin

    Video eskizi

    Ultrasonik DNK parchalanishi ko'pincha keyingi avlod ketma-ketligi (NGS) da namuna tayyorlash bosqichi sifatida ishlatiladi.

    E. coli EDL933 genomik DNKsining elektroforetik tahlillari 0 - 15 min ultratovushga duchor bo'ladi. L DNK zinapoyasini bildiradi.
    (tadqiqot va tasvir: © Basselet va boshq. 2008)

    Ultrasonik kavitatsiya yordamida hujayra buzilishi

    Ultrasonik prob tipidagi homogenizatorlar taxminan bilan ishlaydi. soniyada 20 000 tsikl (20 kHz da) va suyuqlik yoki suspenziyalarda kavitatsiyaga olib keladi. Akustik kavitatsiya hujayralarni parchalaydigan vakuumga o'xshash bosim va yuqori haroratning mikroskopik joylari. Harorat bir necha ming daraja Selsiyga yetishi mumkin bo'lsa-da, kavitatsiya hajmi shunchalik kichikki, ular jarayonni sezilarli darajada qizdirmaydi. Ultratovush natijasida hosil bo'lgan akustik kavitatsiya va kesish kuchlari E.coli kabi bakterial hujayralarning hujayra membranasini teshadi yoki buzadi. Hielscher ultrasonikatorlari ultratovush intensivligi, amplitudasi, energiya kiritishi va harorat kabi jarayon parametrlarini aniq nazorat qilish imkonini beradi. Shunday qilib, ultratovushli lizis jarayoni hujayra turiga, hujayra madaniyatiga va jarayon maqsadiga mos ravishda sozlanishi mumkin.
     

    Ultrasonic parchalanishiga afzalliklari

    • parchalash aniq nazorat qilish (tezlik, amplitudasi, harorat)
    • ishonchli, takrorlanadigan natijalar
    • aniq misollarni optimal adaptasyon
    • harorat nazorat qilish
    • juda kichik, juda katta namunalari uchun (litr ul)
    • Sof mexanik davolash
    • foydalanuvchilar uchun qulay, xavfsiz ishlash
    • ishlab chiqarish uchun laboratoriya dan chiziqli ko'lamli-up
    Xuddi shu jarayon sharoitlarda 10 shisha idishga bir vaqtning o'zida namuna tayyorlash uchun imkon beradi VialTweeter ultratovush qurilma. (Kattalashtirish uchun bosing!)

    VialTweeter ultratovush parchalash uchun

    Ma'lumot so'rovini




    Bizning e'tibor bering Maxfiylik siyosati.


    Ultrasonik gomogenizator va boshqa liziz usullari

    Kimyoviy va fermentativ lizis muammoli bo'lishi mumkin – oqsil tuzilmalari o'zgartirish va tozalash muammolar va fermentativ lizisini joriy mumkin kimyoviy parchalanishiga uzoq inkubatsiya marta talab va tekrarlanabilir emas, chunki – ultratovush uzilish murakkab, tez Uyali uzilish usuli hisoblanadi.
    Ultrasonik lizis faqat mexanik kuchlarga asoslangan. Hech qanday kimyoviy moddalar qo'shilmaydi, sonikatsiya hujayra devorini kesish kuchlari bilan buzadi. Kimyoviy lizis oqsil tuzilishini o'zgartirishi va tozalash muammolarini keltirib chiqarishi mumkin. Enzimatik buzilish uzoq inkubatsiya vaqtlarini talab qiladi va takrorlanmaydi. E.coli bakteriya hujayralarining ultratovushli hujayra buzilishi tez, oddiy, ishonchli va takrorlanishi mumkin. Shuning uchun Hielscher ultrasonikatorlari butun dunyo bo'ylab biologik va biokimyoviy laboratoriyalarda namuna tayyorlash, pre-analitika, in-vitro diagonistikasi va manifold tahlillari uchun ishlatiladi.

    Ultrasonik lizis uchun umumiy tavsiyalar

    Sonikasyon hujayra süspansiyonları juda kichik, o'rta va katta miqdorda lysing uchun eng mashhur ibora – 100L / soat gacha piko-litr dan (bir ultratovush oqim xujayrasi yordamida). Hujayralar suyuq chiqib ketish va kavitasyon tomonidan liz qilinadi etiladi. DNK ham sonikasyon paytida kesilishi, shuning uchun hujayra to'xtatib DNaz qo'shish kerak emas.
     

    Ultrasonik E.coli lizis paytida haroratni nazorat qilish
    UP100H (100W) ultratovushli hujayra buzilishi va o'simlik birikmalarini ekstraktsiya qilish uchun.namunasi oldindan sovutish va muz ustida sonikasyon paytida namunasi tutib, namunadagi issiqlik degradatsiyasi osonlik oldini olish mumkin namuna.
    Ideal holda, namunalar lizis paytida muzdek sovuq holda saqlanishi kerak, ammo ko'pchilik namunalar uchun harorat madaniyat yoki to'qima manbai haroratidan yuqori bo'lmasa etarli bo'ladi. Shuning uchun suspenziyani muz ustida ushlab turish va 5-10 sekundlik bir necha qisqa ultratovush impulslari va 10-30 sekundlik pauzalar bilan sonikatsiya qilish tavsiya etiladi. To'xtash vaqtida past haroratni qayta tiklash uchun issiqlik tarqalishi mumkin. Kattaroq hujayra namunalari uchun sovutish ko'ylagi bo'lgan turli xil oqim hujayrali reaktorlar mavjud.
    Muvaffaqiyatli ultratovushli liziz uchun batafsil maslahatlar va tavsiyalarni bu erda o'qing!

    E. Coli lizatlarini ultratovush yordamida tayyorlash protokollari

    Tadqiqotchilar E.coli hujayralarining buzilishi uchun Hielscher ultratovushli homogenizatorlardan foydalanadilar. Quyida turli xil E. coli bilan bog'liq ilovalar uchun Hielscher ultratovushli homogenizatorlaridan foydalangan holda E.coli lizisi uchun turli sinovdan o'tgan va tasdiqlangan protokollarni topishingiz mumkin.
     

    Ushbu videoklip Hielscher ultratovushli gomogenizator UP100H, laboratoriyalarda namuna tayyorlash uchun keng qo'llaniladigan ultratovush qurilmasini ko'rsatadi.

    Ultrasonik gomogenizator UP100H

    Video eskizi

    Hujayra o'sishi, o'zaro bog'lanishi va ultratovush yordamida E. coli hujayra ekstraktlarini tayyorlash

    SeqA va RNK polimeraza chip-Chip E. coli MG1655 yoki MG1655 ΔseqA uchun achigan uchun 37 ° S da yetishtirilgan edi600 50 ml lib (+ 0.2% glyukoza) ichida 0,15 dan taxminan 0,1 ml miqdorida mili atrofidagi 27 ml formaldegid (37%) qo'shildi (yakuniy konsentratsiya 1%). Cho'kma aloqasi 20 daqiqa mobaynida xona haroratida sekin chayqalishda (100 rpm) va 10 ml 2,5 M glisin bilan (yakuniy konsentratsiyasi 0,5 M) suspenziya qilish paytida bajarilgan. Issiqlikdan zarba berish tajribalari uchun E. coli MG1655 65 ml LB muhitida 30 o C da OD600 taxminan 0,3. Keyinchalik 30 ml madaniyat 43 ° C da oldindan qizdirilgan kolbaga o'tkazildi va qolgan qismi 30 ° C da saqlanadi. O'zaro bog'lanish va söndürme yuqorida ta'riflanganidek bo'ldi, bundan tashqari hujayralar xona haroratida sekin silkitishdan oldin 5 daqiqa davomida 30 yoki 43 ° C da saqlangan. Hujayralar santrifüj orqali yig'ildi va ikki marta sovuq TBS (pH7.5) bilan yuvildi. 1 ml lizis buferida (10 mM Tris (pH 8.0), 20% saxaroza, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizozim) qayta suspenziyadan so'ng va 37 ° C da 30 daqiqa davomida inkubatsiyadan so'ng 4 ml IP qo'shiladi. bufer, hujayralar 100% quvvat sozlamasida Hielscher ultratovushli protsessor UP400St yordamida 12 marta 30 soniya va 30 soniya tanaffuslar bilan muz ustida sonikatsiya qilindi. 9000 g da 10 daqiqa davomida santrifüj qilingandan so'ng, supernatantning 800 mkl alikotlari -20 ° C da saqlanadi. (Waldminghaus 2010)
     

    Ultrasonik prob bilan fermentlarni ortiqcha ishlab chiqarish va tozalash

    Ultrasonicator UP100H ko'pincha hujayra madaniyati plitalarining namunalarini tayyorlash uchun ishlatiladigan laboratoriya gomogenizatoridir.Dekahistidin (His10)-belgilangan oqsillarni ortiqcha ishlab chiqarish uchun E. coli BL21 (DE3) pET19b konstruktsiyalari bilan o'zgartirildi. Bir kechada prekultura sentrifugalash yo'li bilan yig'ib olindi va 1% ekspressiya madaniyatini emlash uchun ishlatilgan. PET19mgtB ni tashuvchi hujayralar 600 nm (OD600) 0,7 optik zichlikka qadar 22 ° C da o'stirildi. Madaniyat 17 ° C ga o'tkazildi va 100 mkM IPTG tomonidan induktsiya qilindi. 16 soatdan keyin madaniyat 4 ° C da 7500 × g da santrifüjlash orqali yig'ib olindi. Hujayralar pH 7,4 da 0,3 M NaCl bilan 50 mM fosfat-buferli sho'r suvda (PBS) qayta suspenziya qilindi va Hielscher ultrasonicator UP200St da 0,5 va amp75tude bir tsiklda S2 mikro-uchli sonotrode bilan ultratovush orqali buzildi.
    decahistidine-belgilangan GtfC haddan achigan 37 ° C da majbur bo'ldi600 100 uM IPTG bilan 0.6. Hujayralar keyin, 4 soat davomida inkübe hosil va MgtB uchun yuqorida aytilganidek vayron qilindi.
    Xom hujayra ekstraktlari hujayra qoldiqlarini cho'ktirish uchun 15000 × g va 4 ° C da santrifüj qilindi. Aniqlangan ekstraktlar ÄKTAprime Plus tizimidan foydalangan holda 1 ml HisTrap FF Crude ustunlariga yuklangan. Fermentlar ishlab chiqaruvchining His-belgilangan oqsillarni gradient elyusiyasi bo'yicha protokoliga muvofiq tozalandi. Elutlangan protein eritmalari 4 ° C da 0,3 M NaCl bilan 50 mM PBS, pH 7,4, 1000 hajmga qarshi ikki marta dializ qilindi. Tozalash 12% SDS-PAGE tomonidan tahlil qilindi. Protein konsentratsiyasi Roti-Quant yordamida Bredford usuli bilan aniqlandi. (Rabausch va boshq. 2013)
     

    E. coli bakteriyalaridan oqsillarni ultratovush yordamida olish
    qiziqtirgan bir o'lja oqsili (bu holda, Arabidopsis thaliana MTV1) bir GST teg birlashtirish va BL21 ichak tayoqchasi (E. coli), hujayralarni ifoda.

    1. GST-MTV1 va GST (50 ml bakterial madaniyatga to'g'ri keladi) ning bitta pelletini oling va har birini 2,5 ml muzli sovuq ekstraksiya buferida qayta suspenziya qiling.
    2. UP100H ultrasonikatoridan (taxminan 2-5 ml hajmdagi kichik hajmlar uchun MS3 mikrotip-sonotrodi bilan jihozlangan) foydalaning, bakterial hujayralarni parchalanmaguncha buzing, bu shaffoflikning pasayishi va yopishqoqlikning oshishi bilan ko'rsatiladi. Bu muz ustida amalga oshirilishi kerak va vaqti-vaqti bilan sonikatsiya qilish tavsiya etiladi (masalan, 10 soniya sonikatsiya, keyin muzda 10 soniya pauza va hokazo). Juda yuqori intensivlik bilan sonikatsiya qilmaslik uchun ehtiyot bo'lish kerak. Agar ko'piklanish yoki oq cho'kma hosil bo'lishi aniqlansa, intensivlikni kamaytirish kerak.
    3. Lizislangan bakteriya eritmasini 1,5 ml mikrotsentrifuga naychalariga o'tkazing va 4 ° C, 16 000 xg 20 daqiqa davomida santrifüj qiling.

     

    Ultrasonik zondlar hujayrani buzish va E.coli dan molekulalar va DNKni olish uchun akustik kavitatsiya kuchlaridan foydalanadi.

    UP400St kabi prob tipidagi ultrasonikatorlar E.coli ning samarali lizisi uchun akustik kavitatsiyaning ishlash printsipidan foydalaning.

    Sonication yordamida rekombinant oqsilni ifodalash tahlili va tozalash

    E. coli pelleti Hielscher ultratovush apparati UP100H bilan ultratovush qilindi. Shu maqsadda hujayra pelleti sovutilgan lizis tamponida (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) qayta suspenziya qilindi va 10 daqiqa davomida muzda sovutildi. Keyin hujayra suspenziyasi 10 sekundlik 10 ta qisqa portlashlar, so'ngra sovutish uchun 30 soniyalik interval bilan sonikatsiya qilindi. Nihoyat, hujayra qoldiqlari 14000 aylanish tezligida 15 daqiqa davomida 4 ° C da ultratsentrifugalash orqali olib tashlandi. rPR ifodasini tasdiqlash uchun supernatant 12% poliakrilamid jelida ishlatildi va SDS-PAGE va Western blotting orqali tahlil qilindi. rPRni tozalash ishlab chiqaruvchi qo'llanmasiga muvofiq Ni2 + -NTA qatroni (Invitrogen, AQSh) yordamida amalga oshirildi. Ushbu bosqichda tabiiy tozalash usuli qo'llaniladi. Tozalangan oqsilning tozaligi 12% poliakrilamid jelida elektroforez yordamida va keyinchalik Coomassie ko'k rangda bo'yalgan holda baholandi. Tozalangan oqsil kontsentratsiyasi Micro BCA protein tahlili to'plami (PIERCE, AQSh) bilan o'lchandi. (Azarnezhad va boshq. 2016)
     

    Ushbu videoda laboratoriya namunalarini tarqatish, homogenlashtirish, ekstraksiya qilish yoki gazsizlantirish uchun 200 vattli ultratovushli kupa ko'rsatilgan.

    Ultrasonik kubok (200 vatt)

    Video eskizi

    E. coli lizis uchun ultratovushli homogenizatorlar

    Hielscher Ultrasonics E. coli bakteriyalari va boshqa hujayra turlari, to'qimalari va hujayra madaniyatlarining ishonchli va samarali lizisi uchun yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqadi, ishlab chiqaradi va etkazib beradi.
    Ultrasonik zondlarning keng portfeli, shuningdek, bilvosita sonikatsiya tizimlari sizga hujayra buzilishi va ekstraktsiyasi uchun ideal ultratovushli to'qimalar homogenizatorini taklif qilish imkonini beradi.

    Dizayn, ishlab chiqarish va konsalting – Germaniyada ishlab chiqarilgan sifat

    Hielscher ultrasonikatorlari brauzer nazorati orqali masofadan boshqarilishi mumkin. Sonication parametrlari kuzatilishi va jarayon talablariga aniq moslashtirilishi mumkin.Hielscher ultrasonikatorlari eng yuqori sifat va dizayn standartlari bilan mashhur. Aqlli dasturiy ta'minot, intuitiv menyu, dasturlashtiriladigan sozlamalar va avtomatik ma'lumotlarni protokollash Hielscher ultrasonikatorlarining bir nechta xususiyatlaridan iborat. Barqarorlik va qulay foydalanish ultratovush apparatlarimizni tadqiqot va biotexnologik ob'ektlarga muammosiz integratsiyalashuviga imkon beradi. Hatto qo'pol sharoitlar va talabchan muhitlar Hielscher ultrasonicators tomonidan osonlik bilan ishlov beriladi.

    Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatiga ega kompaniya bo'lib, eng zamonaviy texnologiya va foydalanuvchilarga qulaylik bilan ajralib turadigan yuqori samarali ultratovush apparatlariga alohida e'tibor beradi. Albatta, Hielscher ultrasonikatorlari Idoralar talablariga javob beradi va UL, CSA va RoHs talablariga javob beradi.

    Quyidagi jadval sizga bizning ultrasonicators taxminiy qayta ishlash quvvatiga ega ekanligidan dalolat beradi:

    Buyurtma miqdori Oqim darajasi Tavsiya Qurilmalar
    ko'p quduqli / mikrotitrli plitalar ga UIP400MTP
    Flakonlar yoki stakan uchun CupHorn ga ultratovush cuphorn
    ultratovushli mikro-oqimli reaktor ga GDmini2
    0,5 dan 1,5 ml gacha bo'lgan 10 flakongacha ga VialTweeter
    01.5mL uchun .5 ga VialTweeter
    1 500ml uchun 10 200ml / min uchun UP100H
    10 2000mL uchun 20 400ml / min uchun Uf200 ः t, UP400St
    0.1 20L 04L / min uchun .2 UIP2000hdT
    10 100L uchun 10L 2 / min UIP4000
    ga 10 100L / min uchun UIP16000
    ga katta Klaster UIP16000

    Biz bilan bog'lanish! Bizdan so'rang!

    Qo'shimcha ma'lumotni so'rang

    Ultrasonik to'qimalarni gomogenizatorlari va hujayra maydalagichlari, lizis ilovalari va narxlari haqida qo'shimcha ma'lumot so'rash uchun quyidagi shakldan foydalaning. Biz sizning jarayoningizni siz bilan muhokama qilishdan va sizning talablaringizni qondiradigan ultratovushli gomogenizatorni taklif qilishdan mamnun bo'lamiz!









    Iltimos, bizning e'tibor bering Maxfiylik siyosati.


    Videoda UIP400MTP ultratovush namunalarini tayyorlash tizimi ko'rsatilgan, bu yuqori intensivlikdagi ultratovush yordamida har qanday standart ko'p quduqli plitalarning ishonchli namunalarini tayyorlash imkonini beradi. UIP400MTP ning odatiy ilovalari hujayra lizisini, DNK, RNK va xromatinni kesish, shuningdek, oqsillarni ajratib olishni o'z ichiga oladi.

    Ultrasonikator UIP400MTP ko'p quduqli plastinka sonikatsiyasi uchun

    Video eskizi

    Ultrasonik E. coli lizis uchun qo'shimcha protokollar

    Ultrasonik VialTweeter yordamida E. colidagi allitsin bilan o'zgartirilgan oqsillar

    UP200ST ultratovush protsessorida VialTweeter5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoik kislotasi) (DTNB) degan bilan sülfhidril Mundarija aniqlash
    MOPS minimal muhitini (1:100) emlash uchun E. coli MG1655 tungi madaniyati ishlatilgan. A600 0,4 ga erishilgunga qadar madaniyat aerobik tarzda o'stirildi. Madaniyat stressni davolash uchun uchta 15 ml kulturaga bo'lingan. Davolanmagan madaniyat salbiy nazorat bo'lib xizmat qildi. Qolgan ikkita kulturadan biriga 0,79 mM allitsin (128 mkg ml-1) yoki 1 mM diamid qo'shildi. Madaniyatlar 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Har bir madaniyatdan 5 ml tsentrifugalash orqali yig'ib olindi (8,525 × g, 4 ° C, 10 min). Hujayralar ikki marta 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, foydalanishdan oldin anaerobik holda saqlanadi) bilan yuvilgan va santrifüj qilingan (13,000 × g, 4 ° C). Hujayralar ultratovush orqali 4 ° C da buzilishidan oldin lizis buferida (6 mM guanidinium HCl, pH 7.4 bilan PBS) qayta suspenziya qilindi (VialTweeter ultrasonikator, Hielscher GmbH, Germaniya) (3 × 1 min). Hujayra qoldiqlari santrifüjlash (13000 × g, 4 ° C, 15 min) yo'li bilan pelletlangan. Supernatant magnit aralashtirgichli 3,5 ml QS-makrokyuvetaga (10 mm) o'tkazildi va 1 ml lizis buferi bilan aralashtirildi. Namunalarning yo'q bo'lib ketishi xona haroratida PSC-718 harorat bilan boshqariladigan hujayra ushlagichi bilan jihozlangan Jasco V-650 spektrofotometri bilan 412 nm da kuzatildi. 100 mkl 3 mM ditiobis (2-nitrobenzoy kislotasi) eritmasi qo'shildi. Yo'q bo'lib ketish to'yinganlik darajasiga yetguncha kuzatildi. Tiol konsentratsiyasini hisoblash so'nish koeffitsienti s yordamida amalga oshirildi412 = 13.700 M-1 sm-1 tiyo-2-nitrobenzoik kislotasi (TNB) uchun. Uyali tiyol kontsentratsiyasi 6,7 × 10 E. bobini xujayralari bir hajmi asosida hisoblab chiqilgan-15 litr va hujayra zichligi A600 = 0,5 (1 × 10 ga teng)8 hujayralar ml-1 Madaniyat). (Myuller va boshq. 2016)
     

    Ultrasonik hujayra maydalagich yordamida in Vivo glutationni aniqlash

    E.coli MG1655 MOPS minimal muhitida 200 ml umumiy hajmda, A600 0,5 ga yetguncha yetishtirildi. Madaniyat stressni davolash uchun 50 ml kulturalarga bo'lingan. 0,79 mM allitsin, 1 mM diamid yoki dimetil sulfoksid (nazorat) bilan 15 daqiqa inkubatsiyadan so'ng hujayralar 4000 g da 4 ° C da 10 daqiqa davomida yig'ib olindi. 700 µl KPE buferida pelletlarni qayta suspenziya qilishdan oldin hujayralar KPE buferi bilan ikki marta yuvildi. Deproteinatsiya qilish uchun hujayralarni ultratovush orqali buzishdan oldin (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Tantlar (30 min, 13,000g, 4 ° C) santrifüjden keyin to'plangan. Sulfosalicylic kislotasi konsentrasiyalari KPE buferi 3 hajmlari qo'shimcha 1% pasaydi qilindi. umumiy glutatyon va GSSG o'lchov yuqorida aytilganidek amalga oshirildi. Uyali glutatyon konsentrasiyalari E. bir hajmi asosida hisoblangan 6,7 xujayralari E.coli×10-15 litr va hujayra zichligi A600 0,5 (1 ga ekvivalent).×108 hujayralar ml-1 Madaniyat). GSH kontsentratsiyasi umumiy glutatyon 2 [GSSG] eksilmesi aniqlandi. (Myuller va boshq. 2016)

    Ultrasonik gomogenizator yordamida E. coli da inson mAspAT ifodasi

    hujayra ichidagi masala qazib olish bo'yicha ultratovush Uyali to'pi UP400St (400W) (masalan oqsillar, organelleri, DNK, RNK va boshqalar)optik zichligi qadar 37ºC da yetishtiriladi yagona Luria-Bertani (LB) o'rta o'z ichiga 100mg / ml ampitsillin 30 ml bilan ifoda vektor bilan, kek, E. bobini BL21 ning mustamlaka (DE3), so'ngra (OD600) 0.6 etdi. hujayralar 10 daqiqa davomida 4000 × g santrifüjleme va 100mg / ml ampisilin o'z ichiga 3L yangi LB o'rta qayta ishlab chiqarish holiga qilindi.
    Keyinchalik, 16ºC da 20 soat davomida 1 mM izopropil b-ᴅ-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) bilan protein ekspressiyasi indüklendi. Hujayralar 15 daqiqa davomida 8000 × g da santrifüjlash orqali yig'ib olindi va bufer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) bilan yuvildi. Taxminan 45 g (ho'l vazn) hujayralar 3 L madaniyatdan olingan. Santrifüjdan so'ng hujayra granulalari 40 ml (1 L madaniyat uchun) muzli sovuq ekstraksiya tamponida qayta suspenziya qilindi va Hielscher ultratovushli hujayra maydalagich UP400St yordamida muzdek sovuq haroratda ultratovush yo'li bilan lizing qilindi. Hujayra lizisi eruvchan (supernatant) va cho'kma (pellet) fraktsiyalarini ajratish uchun 12000 rpm tezlikda 15 daqiqa davomida santrifüj qilindi. (Jiang va boshq. 2015)
     



    Bilishingiz kerak bo'lgan dalillar

    E.coli

    E.coli (E. coli) bir gramm-manfiy, fakültatif anaerobik, rod shaklidagi, tez-tez qaynoq organizmlarning (endotherms) quyi ichak topilgan xil Escherichia Coliform bakteriya. E. katta soni turli xususiyatlarga ega bo'lgan shtammlari (yoki pastki) E.coli bor. Eng E. coli shtammlari masalan, insonlar, uchun zararsizdir laboratoriyalarida tadqiqot ilovalar uchun tez-tez ishlatiladi B va K-12 shtammlari. Biroq, ba'zi shtammlari zararli va og'ir kasallik sabab bo'lishi mumkin.
    bakteriyalar manipulyatsiya qilish oson, chunki E. coli zamonaviy biologik muhandislik va sanoat Mikrobiologiya muhim ahamiyat kasb etadi. E. coli, masalan, tez-tez foydalanish jalb Common laboratoriya ilovalar Rekombinat deoksiribonükleik kislota (DNK) yaratish yoki model organizm sifatida harakat.
    E. bobini heterolog oqsillarni ishlab chiqarish uchun juda ko'p qirrali uy egasi, va manifold protein ifoda tizimlari, E. bobini Rekombinat oqsillarni ishlab chiqarish uchun foydalanish mumkin. oqsil yuqori darajada ifoda ruxsat plazmidlerini foydalanish, genlar sanoat fermentatsiya jarayonlarida yuqori miqdorda bunday oqsillar ishlab chiqarish imkonini beradi bakteriyalar, joriy mumkin.
    E.coli insulin ishlab chiqarish uchun hujayra zavodlari sifatida ishlatiladi. Keyingi dasturlarga modifikatsiyalangan E. coli hujayralaridan vaktsinalar va immobilizatsiyalangan fermentlarni ishlab chiqish va ishlab chiqarish, bioyoqilg'i ishlab chiqarish, shuningdek bioremediatsiya uchun foydalanish kiradi.
    kibirli K-12 E. bir mutant shakli dimer gidroksidi fosfataz (Alp) ustidan-ifoda, deb E.coli hisoblanadi. Bu o'zgarish tufayli bu ferment uchun doimo kodlari genlarni ham egridir uchun sodir bo'ladi. bir gen har qanday inhibisyonunun holda mahsulotni ishlab chiqaradi, agar bu, asoschilari faoliyatini sifatida tanilgan. Bu o'ziga xos mutant shakli izolyatsiya va tozalash Alp ferment uchun ishlatiladi.
    E. coli bakteriyalari hujayra zavodlari sifatida ham keng qo'llaniladi. Hujayra fabrikalari sifatida ishlab chiqilgan mikroblar (masalan, bakteriyalar) va o'simlik hujayralaridan foydalanish mumkin. Ushbu genetik jihatdan o'zgartirilgan hujayralar molekulalar, kimyoviy moddalar, polimerlar, oqsillar va boshqa moddalarni ishlab chiqaradi, masalan, farmatsevtika, oziq-ovqat va kimyo sanoatida qo'llaniladi. Bunday biomuhandislik hujayralarining ichki qismida hosil bo'lgan molekulalarni chiqarish uchun ultratovushli liziz hujayra devorlarini buzish va maqsadli moddalarni atrofdagi suyuqlikka o'tkazishning keng tarqalgan usuli hisoblanadi. Bioinjeneriya qilingan hujayralar lizisi haqida ko'proq o'qing!

    Ultratovush DNK Qirqim

    Ultrasonik kesish kuchlari hujayra ichidagi molekulalarni, organellalarni va oqsillarni chiqarish, shuningdek, DNK iplarini bo'laklarga bo'lish uchun keng tarqalgan usuldir. Akustik kavitatsiya hujayra devorlari va membranalarini sindirib, hujayralardan DNKni ajratib oladi va taxminan 600 ta bo'laklarni hosil qiladi. – tahlil qilish uchun ideal bo'lgan uzunligi 800 BP.
    DNK bo'linishi uchun ultratovush homojenizatörlerinde haqida ko'proq bilib olish uchun shu yerni bosing!

    Adabiyotlar / Adabiyotlar


    Yuqori samarali ultratovush! Hielscher mahsulot assortimenti ixcham laboratoriya ultratovush qurilmasidan to'liq sanoat ultratovush tizimlarigacha bo'lgan to'liq spektrni qamrab oladi.

    Hielscher Ultrasonics kompaniyasi yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqaradi laboratoriya uchun sanoat hajmi.


    Jarayoningizni muhokama qilishdan mamnun bo'lamiz.

    Keling, aloqaga chiqamiz.