Hielscher ultratovush texnologiyasi

E. bobini ultratovush erishi

  • E. coli bakteriyalar Mikrobiologiya va biotexnologiya eng keng tarqalgan ishlatiladigan bakteriyalar bor.
  • Ultratovush Uyali voqealari solishi E. coli parchalanishi uchun ishonchli va tekrarlanabilir natijalar beradi.
  • Qizg'in hali aniq boshqariladigan Kavitasyonun va ketish kuchlari to'liq izdan va yuqori qazib olish hosildorlikning (masalan oqsillar, DNK) olib.

Cavitation Uyali aloqa Disruption

E.coli bakteriyalar ishonchli ultratovush to'qima homojenizatörleridir yordamida liz qilinadi etiladi.Ultratovush tekshirish-turi homojenizatör qariyb bilan faoliyat ko'rsatmoqda. (20kHz da) soniyasiga 20,000 davrlarini va suyuqliklar yoki supsensions yilda teshikka olib kelishi. biridan hujayralarni yirtib vakuum-kabi bosim va yuqori haroratlarda akustik Kavitasyonun mikroskopik joylari. harorat bir necha ming daraja Selsiy erishish mumkin bo'lsa-da, Kavitasyonun hajmi ular sezilarli jarayonini issiqlik yo'q, shuning uchun kichik. ultratovush akustik Kavitasyonu hosil va ketish kuchlari teshmoq yoki E.coli hujayra membranasini sindirish – ultratovush homojenleştirici qurilma sozlamalari qarab.

Ultrasonic parchalanishiga afzalliklari

  • parchalash aniq nazorat qilish (tezlik, amplitudasi, harorat)
  • aniq misollarni optimal adaptasyon
  • harorat nazorat qilish
  • juda kichik, juda katta namunalari uchun (litr ul)
  • sof mexanik davolash
  • ishlab chiqarish uchun laboratoriya dan chiziqli ko'lamli-up
Xuddi shu jarayon sharoitlarda 10 shisha idishga bir vaqtning o'zida namuna tayyorlash uchun imkon beradi VialTweeter ultratovush qurilma. (Kattalashtirish uchun bosing!)

VialTweeter ultratovush parchalash uchun

Ma'lumot so'rovini




Bizning e'tibor bering Maxfiylik siyosati.


kimyoviy va enzymtic parchalanishiga muammoli bo'lishi mumkin ekan – oqsil tuzilmalari o'zgartirish va tozalash muammolar va fermentativ lizisini joriy mumkin kimyoviy parchalanishiga uzoq inkubatsiya marta talab va tekrarlanabilir emas, chunki – ultratovush uzilish murakkab, tez Uyali uzilish usuli hisoblanadi.
Ultrasonik lizis faqat mexanik kuchlarga asoslangan. Hech qanday kimyoviy moddalar qo'shilmaydi, sonikatsiya hujayralar devorini kesish kuchlari bilan buzadi. Kimyoviy liziz oqsil tuzilishini o'zgartirishi va tozalash muammolarini keltirib chiqarishi mumkin. Fermentatik buzilish uzoq inkubatsiya vaqtini talab qiladi va takrorlanmaydi. E.coli bakteriyalar hujayralarining ultratovush buzilishi tez, sodda, ishonchli va takrorlanuvchan. Shuning uchun Hielscher ultratovush tekshirgichlari butun dunyo bo'ylab biologik va biokimyoviy laboratoriyalarda namunalarni tayyorlash, ananlitika, in vitro diagonstika va ko'p qirrali tahlillar uchun ishlatiladi.

Umumiy tavsiyalar

oqimi reaktori bilan UP400St ultrasonicatorSonikasyon hujayra süspansiyonları juda kichik, o'rta va katta miqdorda lysing uchun eng mashhur ibora – 100L / soat gacha piko-litr dan (bir ultratovush oqim xujayrasi yordamida). Hujayralar suyuq chiqib ketish va kavitasyon tomonidan liz qilinadi etiladi. DNK ham sonikasyon paytida kesilishi, shuning uchun hujayra to'xtatib DNaz qo'shish kerak emas.
Harorat nazorat qilish:
namunasi oldindan sovutish va muz ustida sonikasyon paytida namunasi tutib, namunadagi issiqlik degradatsiyasi osonlik oldini olish mumkin namuna.
Ideal holda liziz paytida namunalar muz bilan sovuq bo'lishi kerak, ammo ko'plab namunalar uchun harorat madaniyat yoki to'qima manbaidan yuqori bo'lmasa etarli bo'ladi. Shu sababli, suspenziyani muzda saqlash va bir necha qisqa ultratovushli impulslar bilan sonikalash tavsiya etiladi va 5-10 soniya davomida to'xtab qoladi va 10-30 soniya to'xtaydi. Uzoq vaqt davomida issiqlik past haroratni qayta tiklash uchun issiqlik tarqalishi mumkin. Keyinchalik katta hujayra namunalari uchun sovutadigan ko'ylagi bo'lgan turli xil oqim hujayra reaktorlari mavjud.

E. bobini lizatları tayyorlash uchun protokollar

Expression tahlil qilish va qayta birlashtiruvchi protein tozalash

E. coli shar bir ultratovush tizimi bilan sonikleştirilmiştir UP100H (Hielscher). Shu maqsadda, hujayra pelletini sovutilgan lizis tamponu (50 mm Tris-HCl pH = 7,5, 100 mm NaCl, 5 mm DTT, 1 mm PMSF) ichida yana osildi va 10 daqiqa davomida muz ustida qotdi. So'ngra, hujayra ishlab chiqarish sovutish uchun 30 s oralig'ida tomonidan ta'qib 10 s 10 qisqa portlashlar bilan soniklendi edi. Nihoyat, hujayra ortig'i 14000 rpm 15 daqiqa davomida 4 ° C da ultrasantrifüjleme tomonidan olib tashlangan. rpr so'z tasdiqlash uchun, süpernatan 12% poliakrilamid jeli ustida ishlaydigan bo'ldi va SDS sahifali va G'arb blot tomonidan tahlil qilindi. rpr ning tozalash Na yordamida bajarilgan2+-NTA qizil rangli ishlab chiqaruvchining qo'llanma ko'ra (Invitrogen, AQSh). Ushbu bosqichda, ona tozalash usuli ishlatilgan. tozalangan oqsil sofligi 12% poliakrilamid jeli va keyingi Coomassie ko'k dog kuni elektroforez yordamida muhokama qilindi. Toblangan oqsil konsentratsiyasi Micro BCA protein sinov uchun to'plam (Pirs, AQSh) bilan topgan. (Azarnezhad va boshq. 2016)

parchalash, hujayra uzilishi va DNK chiqib ketish uchun ultratovush Uyali to'pi UP100H (100W).

ultratovush Gomogenizator UP100H (100W)

Hujayra o'sishi, o'zaro bog'lanishlari va E. bobini hujayra tayyorlash

SeqA va RNK polimeraza chip-Chip E. coli MG1655 yoki MG1655 ΔseqA uchun achigan uchun 37 ° S da yetishtirilgan edi600 50 ml lib (+ 0.2% glyukoza) ichida 0,15 dan taxminan 0,1 ml miqdorida mili atrofidagi 27 ml formaldegid (37%) qo'shildi (yakuniy konsentratsiya 1%). Cho'kma aloqasi 20 daqiqa mobaynida xona haroratida sekin chayqalishda (100 rpm) va 10 ml 2,5 M glisin bilan (yakuniy konsentratsiyasi 0,5 M) suspenziya qilish paytida bajarilgan. Issiqlikdan zarba berish tajribalari uchun E. coli MG1655 65 ml LB muhitida 30 o C da OD600 taxminan 0,3 ga teng. Keyinchalik 30 ml madaniyat oldindan isitiladigan shisha idishga 43 ° C darajasiga o'tkazildi va qolgan 30 ° C darajasida saqlandi. O'zaro aloqa va suspenziya yuqorida ta'riflanganidek, hujayralar xona haroratida sekin siqilishdan oldin 5 minut davomida 30 yoki 43 ° C da saqlangan. Hujayralar santrifüj bilan yig'ilgan va sovuq TBS (pH7.5) bilan ikki marta yuvilgan. 1 ml liziz tamponida (10 mM Tris (pH 8.0), 20% sukroz, 50 mm NaCI, 10 mm EDTA, 10 mg / ml lizozim) qayta tiklash va 30 daqiqa mobaynida 37 ° C'de kuluçkalamadan keyin 4 ml IP bufer, hujayralar 12 marta 30 soniya va 30 sek oralig'ida muzda sonikatsiyalashgan UP400St ultratovush protsessor 100% kuch bilan (Hielscher ultratovush GmbH). 9000 g da 10 min Santrifüjlemeden so'ng, süpernatan 800 ul aliquotes -20 ° S da saqlanadi. (2010 Waldminghaus)

Haddan tashqari va fermentlar tozalash.

decahistidine (His10) -tagged oqsillarni haddan uchun, E. bobini BL21 (DE3) pET19b tuzilmalari bilan transforme qilindi. Bir kechada preculture santrifüjleme edi, va 1% bir ifoda madaniyatini payvand qilish ishlatilgan. pET19mgtB ko'tarib Hujayralar OD (600 nm da optik zichligi qadar 22 ° C da yetishtirilgan edi600) 0,7. Madaniyat 17 ° C o'tkazilgan va 100 uM IPTG bilan qo'zg'atilgan edi. 16 soatdan keyin, madaniyat, 4 ° C da 7500 × g santrifüjleme edi. Hujayralar bir S2 micro-uchi sonotrode bilan ultrasonikleştirme tomonidan pH 7,4 da 0,3 M NaCl bilan 50 mm fosfat-tamponlu bilan qo'yvoring (PBS) ichida yana osildi va xalaqit qilindi UP200St 0,5 tsikli va 75% bir amplitudali da ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Germaniya).
decahistidine-belgilangan GtfC haddan achigan 37 ° C da majbur bo'ldi600 100 uM IPTG bilan 0.6. Hujayralar keyin, 4 soat davomida inkübe hosil va MgtB uchun yuqorida aytilganidek vayron qilindi.
Xom hujayra hujayra binoning birikib 15.000 × g va 4 ° C da santrifüjlendi qilindi. aniqlanishi ekstraktlari bir ÄKTAprime Plus tizimi (ge Healthcare) yordamida 1-ml HisTrap FF Xom ustunlar o'rnatilgan edi. fermentlar Uning-tagged oqsillarni gradient yuvishi uchun ishlab chiqaruvchining protokolüne ko'ra tozalangan edi. Elüt oqsil yechimlari 4 ° C da 0,3 M NaCl bilan 50 mm, PBS, pH 7,4, 1000 hajmlarini qarshi ikki marta diyaliz qilindi. tozalash, 12% SDS sahifali tomonidan tahlil qilindi. oqsil konsentratsiyasi Roti-Kvant (Karl Roth GmbH, Karsruhe, Germaniya) yordamida Bradford usuli bilan aniqlandi. (Rabausch va boshq. 2013)

E. coli Bakterilerinin protein ekstraksiya
qiziqtirgan bir o'lja oqsili (bu holda, Arabidopsis thaliana MTV1) bir GST teg birlashtirish va BL21 ichak tayoqchasi (E. coli), hujayralarni ifoda.
1. (50 ml bakteriyalar madaniyati mos) GST-MTV1 va GST biri Palaf oling va 2,5 ml muz sovuq qazib olish tampon bilan har bir qayta ishlab chiqarish.
2. ultrasonicator foydalaning UP100H Ular, liz qilinadi etiladi kamayadi xiralik va ortdi yopishqoqligi bilan ko'rsatilgan qaysi qadar bakterial hujayralar buzish uchun (kichik hajmi uchun MS3 mikrotip-sonotrode (2-5mL) bilan jihozlangan). Bu muz ustida amalga oshirilishi kerak, va u (masalan, 10 sek sonicating hokazo 10 muz ustida s va ortidan) vaqti-vaqti bilan tovush to'lqinlarining ta'sir qilish tavsiya etiladi. Care juda yuqori intensivligi bilan tovush to'lqinlarining ta'sir qilish emas, balki qabul qilish kerak. ko'pik yoki oq çökelti shakllanishi aniqlangan bo'lsa, tezlik tushib qolishi kerak.
3. 4 ° C 20 daqiqa davomida, 16.000 x g da liz qilinadi bakteriyalar 1,5 ml mikrosantrifüj qulflash uchun hal va santrifüj o'tkazing.

E. bobini Allicin-tahrirlangan Oqsillar

VialTweeter kichik namunasi homojenizasyona uchun qulay ultrasonicator bo'ladi5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoik kislotasi) (DTNB) degan bilan sülfhidril Mundarija aniqlash
An E. coli MG1655 kechada madaniyat MOPS minimal muhit (: 100 1) ishontirish uchun ishlatilgan. 0.4 bir A600 yetib kelguncha madaniyat aerobik o'sgan edi. Madaniyat stress davolash uchun uch 15-ml madaniyati bo'linib edi. An tozalanmagan madaniyat salbiy nazorat sifatida xizmat qilgan. 0,79 mm allicin (128 ug ml-1) Yoki 1 mm diamit qolgan ikki madaniyat har biriga qo'shildi. Madaniyatlar 15 daqiqa davomida kuluçkaya qilindi. Har bir madaniyat, 5 ml santrifüj (8,525 × g, 4 ° C, 10 min) tomonidan hosil qilingan. Hujayralar PBS (137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 10 mm Na 1 ml bilan ikki marta yuvindi2HPO4, 2 mm KH2pO4, PH 7,4) 13000 × g, 4 ° C, 10 min (anaerobik oldin foydalanish saqlanadi) va tsentrifugalanadi. Hujayralar ultrasonikleştirme 4 ° C da oldin buzilishi uchun (6 mm guanidinium HCI, pH 7.4 PBS) lizis tamponunda qayta süspanse qilindi (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Germaniya) (3 × 1 min). Uyali aloqa binoning santrifüjleme (13000 × g, 4 ° C, 15 min) tomonidan urug edi. Süpernatan magnit aralashtirish paneli bilan 3,5-ml QS-Ibratli Küvetin (10 mm) o'tkazilishi va lizis tamponu 1 ml bilan aralashib edi. namunalarini o'chirish xona haroratida PSC-718 harorat-nazorat Uyali egasiga (Jasco) bilan jihozlangan Jasco V-650 spektrofotometre bilan 412 nm da kuzatib qilindi. 3 mm dithiobis (2-nitrobenzoik kislotasi) eritmasi quduqqa 100mL qo'shildi. Bu to'yinganlik etib o'chirish monitoring qilindi. tiyol konsentratsiyasining hisoblash o'chirish koeffitsienti e yordamida amalga oshirildi412 = 13.700 M-1 sm-1 tiyo-2-nitrobenzoik kislotasi (TNB) uchun. Uyali tiyol kontsentratsiyasi 6,7 × 10 E. bobini xujayralari bir hajmi asosida hisoblab chiqilgan-15 litr va A hujayra zichligi600 = 0,5 (ekvivalent 1 × 108 hujayralar ml-1 Madaniyat). (Myuller va boshq. 2016)

Vivo glutatyon aniqlash yilda

E.coli MG1655 bir A qadar 200ml umumiy hajmida MOPS minimal o'rta yetishtirilgan edi600 0,5 erishilgan edi. Madaniyat stress davolash uchun 50-ml madaniyati bo'linib edi. 0,79 mm allicin, 1 mm diamit yoki dimetil sülfoksit (nazorat) bilan inkubatsiya 15 daqiqa keyin hujayralar 10 daqiqa davomida 4 ° C da 4,000g hosil qilindi. Hujayralar oldin KPE buferi 700μl yilda granulalari qayta süspansiyonun uchun KPE bufer bilan ikki marta yuvindi. deproteination uchun, 10% 300l (w / v) sulfosalicylic kislotasi oldin ultrasonikleştirme (3 x 1 min tomonidan hujayralari buzilishi qo'shilgan edi; VialTweeter ultrasonicator). Tantlar (30 min, 13,000g, 4 ° C) santrifüjden keyin to'plangan. Sulfosalicylic kislotasi konsentrasiyalari KPE buferi 3 hajmlari qo'shimcha 1% pasaydi qilindi. umumiy glutatyon va GSSG o'lchov yuqorida aytilganidek amalga oshirildi. Uyali glutatyon konsentrasiyalari E. bir hajmi asosida hisoblangan 6,7 xujayralari E.coli×10-15 litr va A hujayra zichligi600 01 .5 (teng×108 hujayralar ml-1 Madaniyat). GSH kontsentratsiyasi umumiy glutatyon 2 [GSSG] eksilmesi aniqlandi. (Myuller va boshq. 2016)

Uyali aloqa erishi va biologik materiallar qazib olish bo'yicha ultratovush to'pi (Kattalashtirish uchun bosing!)

Tekshirish-turi ultrasonicator UP400St

E. bobini Inson mAspAT ifodasi

hujayra ichidagi masala qazib olish bo'yicha ultratovush Uyali to'pi UP400St (400W) (masalan oqsillar, organelleri, DNK, RNK va boshqalar)optik zichligi qadar 37ºC da yetishtiriladi yagona Luria-Bertani (LB) o'rta o'z ichiga 100mg / ml ampitsillin 30 ml bilan ifoda vektor bilan, kek, E. bobini BL21 ning mustamlaka (DE3), so'ngra (OD600) 0.6 etdi. hujayralar 10 daqiqa davomida 4000 × g santrifüjleme va 100mg / ml ampisilin o'z ichiga 3L yangi LB o'rta qayta ishlab chiqarish holiga qilindi.
Keyinchalik, protein ifodasi 16ºC da 20 soat davomida 1 mm, izopropil β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) bilan majbur bo'ldi. hujayralar 15 daqiqa davomida 8000 × g santrifüjleme va bufer A (20 mm NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7.4) bilan yuvindi. Yaqinlashtirilgan 45g (ho'l og'irligi) hujayralar 3 L madaniyat olingan. Santrifüjlemeden so'ng, hujayra topakları muzdek qazib olish bufer A (1 L madaniyat uchun) 40 ml yilda osildi va foydalanish muzdek sovuq haroratda ultrasonikleştirme tomonidan liz qilinadi UP400St hujjat (Doktor Hielscher GmbH, Germaniya). hujayra parchalanishiga eriydigan (süpernatanın) va tubining (shar) kasrlarni ajratish uchun 15 daqiqa davomida 12,000 rpm'de santrifüjlenen. (Jiang va boshq. 2015)

Quyidagi jadval sizga bizning ultrasonicators taxminiy qayta ishlash quvvatiga ega ekanligidan dalolat beradi:

Buyurtma miqdori Oqim darajasi Tavsiya Qurilmalar
01.5mL uchun .5 ga VialTweeter
1 500ml uchun 10 200ml / min uchun UP100H
10 2000mL uchun 20 400ml / min uchun Uf200 ः t, UP400St
0.1 20L 04L / min uchun .2 UIP2000hdT
10 100L uchun 10L 2 / min UIP4000
ga 10 100L / min uchun UIP16000
ga katta Klaster UIP16000

Biz bilan bog'lanish! Bizdan so'rang!

Ultrasonik homojenizasyon haqida qo'shimcha ma'lumot talab qilish bo'lsangiz, iltimos, quyidagi shaklni foydalaning. Sizga talablarga javob beradigan ultratovushli tizimni taklif qilishdan mamnun bo'lamiz.









Iltimos, bizning e'tibor bering Maxfiylik siyosati.


Adabiyotlar / manbalar



Bilishingiz kerak bo'lgan dalillar

E.coli

E.coli (E. coli) bir gramm-manfiy, fakültatif anaerobik, rod shaklidagi, tez-tez qaynoq organizmlarning (endotherms) quyi ichak topilgan xil Escherichia Coliform bakteriya. E. katta soni turli xususiyatlarga ega bo'lgan shtammlari (yoki pastki) E.coli bor. Eng E. coli shtammlari masalan, insonlar, uchun zararsizdir laboratoriyalarida tadqiqot ilovalar uchun tez-tez ishlatiladi B va K-12 shtammlari. Biroq, ba'zi shtammlari zararli va og'ir kasallik sabab bo'lishi mumkin.
bakteriyalar manipulyatsiya qilish oson, chunki E. coli zamonaviy biologik muhandislik va sanoat Mikrobiologiya muhim ahamiyat kasb etadi. E. coli, masalan, tez-tez foydalanish jalb Common laboratoriya ilovalar Rekombinat deoksiribonükleik kislota (DNK) yaratish yoki model organizm sifatida harakat.
E. bobini heterolog oqsillarni ishlab chiqarish uchun juda ko'p qirrali uy egasi, va manifold protein ifoda tizimlari, E. bobini Rekombinat oqsillarni ishlab chiqarish uchun foydalanish mumkin. oqsil yuqori darajada ifoda ruxsat plazmidlerini foydalanish, genlar sanoat fermentatsiya jarayonlarida yuqori miqdorda bunday oqsillar ishlab chiqarish imkonini beradi bakteriyalar, joriy mumkin.
E.coli insulin ishlab chiqarish, hujayra fabrikalarda sifatida ishlatiladi. Yanada ilovalar ishlab chiqish va biyoyakıt ishlab chiqarish, shuningdek, Biyoremidasyon uchun uyg'otadi va harakatsiz fermentlarni, ishlab chiqarish, o'zgartirish E. bobini hujayralarida foydalanishni o'z ichiga oladi.
kibirli K-12 E. bir mutant shakli dimer gidroksidi fosfataz (Alp) ustidan-ifoda, deb E.coli hisoblanadi. Bu o'zgarish tufayli bu ferment uchun doimo kodlari genlarni ham egridir uchun sodir bo'ladi. bir gen har qanday inhibisyonunun holda mahsulotni ishlab chiqaradi, agar bu, asoschilari faoliyatini sifatida tanilgan. Bu o'ziga xos mutant shakli izolyatsiya va tozalash Alp ferment uchun ishlatiladi.

Ultratovush DNK Qirqim

Ultratovush kesish kuchlari hujayradan ajratib va ​​bo'laklarga DNK sindirish uchun bir tez-tez ishlatiladigan usul bo'ladi. Akustik Kavitasyonun hujayra devorlari va pardalar hujayralari DNK chiqarib va ​​taxminan 600, uning qismlari ishlab chiqarish uchun buzadi – tahlil qilish uchun ideal bo'lgan uzunligi 800 BP.
DNK bo'linishi uchun ultratovush homojenizatörlerinde haqida ko'proq bilib olish uchun shu yerni bosing!