E. Coli ning ultratovushli lizisi
- E. coli bakteriyalari mikrobiologiya va biotexnologiyada eng ko'p ishlatiladigan bakteriyalardir.
- Ultrasonik hujayra buzilishlari E. coli lizisi uchun ishonchli va takrorlanadigan natijalarni beradi.
- Kuchli, ammo aniq boshqariladigan kavitatsiya va kesish kuchlari to'liq buzilish va yuqori ekstraksiya hosildorligiga olib keladi (masalan, oqsillar, DNK).
Nima uchun E. coli ning ultratovushli hujayra buzilishi afzal qilingan usul?
Ultrasonik gomogenizatorlar yoki prob tipidagi ultrasonikatorlar E. coli lizisi uchun bir qancha afzalliklarni taklif qiladi, chunki kuchli ultratovush hujayra devorlari va membranalarini samarali ravishda buzadi. Prob tipidagi ultratovush apparatlari quyidagi sabablarga ko'ra E. coli lizisi uchun keng qo'llaniladi:
E.coli hujayralaridan oqsil olish samarali amalga oshiriladi ultratovushli probi UP200St
Prob tipidagi ultrasonikator E. coli lizisi uchun juda ko'p afzalliklarni taqdim etadi. Ultrasonik jarayon parametrlari ustidan ishonchli va aniq nazorat istalgan natijalarga erishish uchun quvvat, davomiylik va namunani qayta ishlash kabi operatsion parametrlarni optimallashtirish imkonini beradi.
E. coli EDL933 genomik DNKsining elektroforetik tahlillari 0 - 15 min ultratovushga duchor bo'ladi. L DNK zinapoyasini bildiradi.
(tadqiqot va tasvir: © Basselet va boshq. 2008)
Ultrasonik kavitatsiya yordamida hujayra buzilishi
Ultrasonik prob tipidagi homogenizatorlar taxminan bilan ishlaydi. soniyada 20 000 tsikl (20 kHz da) va suyuqlik yoki suspenziyalarda kavitatsiyaga olib keladi. Akustik kavitatsiya hujayralarni parchalaydigan vakuumga o'xshash bosim va yuqori haroratning mikroskopik joylari. Harorat bir necha ming daraja Selsiyga yetishi mumkin bo'lsa-da, kavitatsiya hajmi shunchalik kichikki, ular jarayonni sezilarli darajada qizdirmaydi. Ultratovush natijasida hosil bo'lgan akustik kavitatsiya va kesish kuchlari E.coli kabi bakterial hujayralarning hujayra membranasini teshadi yoki buzadi. Hielscher ultrasonikatorlari ultratovush intensivligi, amplitudasi, energiya kiritishi va harorat kabi jarayon parametrlarini aniq nazorat qilish imkonini beradi. Shunday qilib, ultratovushli lizis jarayoni hujayra turiga, hujayra madaniyatiga va jarayon maqsadiga mos ravishda sozlanishi mumkin.
- lizisni aniq nazorat qilish (intensivlik, amplituda, harorat)
- ishonchli, takrorlanadigan natijalar
- muayyan namunalarga optimal moslashish
- Haroratni nazorat qilish
- juda kichik va juda katta namunalar uchun (µL dan litrgacha)
- Sof mexanik ishlov berish
- foydalanuvchilar uchun qulay, xavfsiz ishlash
- laboratoriyadan ishlab chiqarishgacha chiziqli o'lchov
VialTweeter ultratovushli lizis uchun
Ultrasonik gomogenizator va boshqa liziz usullari
Kimyoviy va fermentativ lizis muammoli bo'lishi mumkin – chunki kimyoviy lizis oqsil tuzilmalarini o'zgartirishi va tozalash muammolarini keltirib chiqarishi mumkin va fermentativ lizis uzoq inkubatsiya vaqtlarini talab qiladi va takrorlanmaydi. – ultratovushli buzilish - bu murakkab, tezkor hujayra buzilishi usuli.
Ultrasonik lizis faqat mexanik kuchlarga asoslangan. Hech qanday kimyoviy moddalar qo'shilmaydi, sonikatsiya hujayra devorini kesish kuchlari bilan buzadi. Kimyoviy lizis oqsil tuzilishini o'zgartirishi va tozalash muammolarini keltirib chiqarishi mumkin. Enzimatik buzilish uzoq inkubatsiya vaqtlarini talab qiladi va takrorlanmaydi. E.coli bakteriya hujayralarining ultratovushli hujayra buzilishi tez, oddiy, ishonchli va takrorlanishi mumkin. Shuning uchun Hielscher ultrasonikatorlari butun dunyo bo'ylab biologik va biokimyoviy laboratoriyalarda namuna tayyorlash, pre-analitika, in-vitro diagonistikasi va manifold tahlillari uchun ishlatiladi.
Ultrasonik lizis uchun umumiy tavsiyalar
Sonication - bu juda kichik, o'rta va katta miqdordagi hujayra suspenziyalarini lizinglashning eng mashhur usuli. – pikolitrdan 100L/soatgacha (ultratovushli oqim xujayrasi yordamida). Hujayralar suyuqlik kesish va kavitatsiya orqali lizinglanadi. Sonikatsiya paytida DNK ham kesiladi, shuning uchun hujayra suspenziyasiga DNase qo'shish shart emas.
Ultrasonik E.coli lizis paytida haroratni nazorat qilish
Namunani oldindan sovutish va muzda sonikatsiya paytida namunani saqlash orqali namunaning termal degradatsiyasini osongina oldini olish mumkin.
Ideal holda, namunalar lizis paytida muzdek sovuq holda saqlanishi kerak, ammo ko'pchilik namunalar uchun harorat madaniyat yoki to'qima manbasi haroratidan yuqoriga ko'tarilmasa etarli bo'ladi. Shuning uchun suspenziyani muz ustida ushlab turish va 5-10 sekundlik bir nechta qisqa ultratovush impulslari va 10-30 sekundlik pauzalar bilan sonikatsiya qilish tavsiya etiladi. Pauzalar vaqtida past haroratni qayta tiklash uchun issiqlik tarqalishi mumkin. Kattaroq hujayra namunalari uchun sovutish ko'ylagi bo'lgan turli xil oqim hujayrali reaktorlar mavjud.
Muvaffaqiyatli ultratovushli liziz uchun batafsil maslahatlar va tavsiyalarni bu erda o'qing!
E. Coli lizatlarini ultratovush yordamida tayyorlash protokollari
Tadqiqotchilar E.coli hujayralarining buzilishi uchun Hielscher ultratovushli homogenizatorlardan foydalanadilar. Quyida turli xil E. coli bilan bog'liq ilovalar uchun Hielscher ultratovushli homogenizatorlaridan foydalangan holda E.coli lizisi uchun turli sinovdan o'tgan va tasdiqlangan protokollarni topishingiz mumkin.
Hujayra o'sishi, o'zaro bog'lanishi va ultratovush yordamida E. coli hujayra ekstraktlarini tayyorlash
SeqA va RNK polimeraza uchun ChIP-Chip E. coli MG1655 yoki MG1655 DseqA 37°C da OD ga yetishtirildi.600 50 ml LB (+ 0,2% glyukoza) dan taxminan 0,15 ml muhitga 27 mkl formaldegid (37%) qo'shilishidan oldin (yakuniy konsentratsiya 1%). O'zaro bog'lanish sekin chayqatishda (100 rpm) xona haroratida 20 daqiqa davomida amalga oshirildi, so'ngra 10 ml 2,5 M glisin (oxirgi konsentratsiya 0,5 M) bilan söndürüldü. Issiqlik zarbasi tajribalari uchun E. coli MG1655 65 ml LB muhitida 30 ° C haroratda ODgacha o'stirildi.600 taxminan 0,3. Keyinchalik 30 ml madaniyat 43 ° C da oldindan qizdirilgan kolbaga o'tkazildi va qolgan qismi 30 ° C da saqlanadi. O'zaro bog'lanish va söndürme yuqorida tavsiflanganidek bo'ldi, bundan tashqari hujayralar xona haroratida sekin silkitishdan oldin 5 daqiqa davomida 30 yoki 43 ° C da saqlangan. Hujayralar santrifüj orqali yig'ildi va ikki marta sovuq TBS (pH7.5) bilan yuvildi. 1 ml lizis buferida (10 mM Tris (pH 8.0), 20% saxaroza, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizozim) qayta suspenziyadan so'ng va 37 ° C da 30 daqiqa davomida inkubatsiyadan so'ng 4 ml IP qo'shiladi. bufer, hujayralar 12 marta 30 bilan muz ustida sonikatsiya qilindi 100% quvvat sozlamasida Hielscher ultratovushli protsessor UP400St yordamida sek va 30 soniya tanaffuslar. 9000 g da 10 daqiqa davomida santrifüj qilingandan so'ng, supernatantning 800 mkl alikotlari -20 ° C da saqlanadi. (Waldminghaus 2010)
Ultrasonik prob bilan fermentlarni ortiqcha ishlab chiqarish va tozalash
Dekahistidin (His10)-belgilangan oqsillarni ortiqcha ishlab chiqarish uchun E. coli BL21 (DE3) pET19b konstruktsiyalari bilan o'zgartirildi. Bir kechada prekultura sentrifugalash yo'li bilan yig'ib olindi va 1% ekspressiya madaniyatini emlash uchun ishlatilgan. PET19mgtB ni tashuvchi hujayralar 600 nm (OD600) 0,7 optik zichlikka qadar 22 ° C da o'stirildi. Madaniyat 17 ° C ga o'tkazildi va 100 mkM IPTG tomonidan induktsiya qilindi. 16 soatdan keyin madaniyat 4 ° C da 7500 × g da santrifüjlash orqali yig'ib olindi. Hujayralar pH 7,4 da 0,3 M NaCl bilan 50 mM fosfat-buferli sho'r suvda (PBS) qayta suspenziya qilindi va Hielscher ultrasonicator UP200St da 0,5 va amp75tude bir tsiklda S2 mikro-uchli sonotrode bilan ultratovush orqali buzildi.
Dekahistidin bilan belgilangan GtfC ning haddan tashqari ishlab chiqarilishi OD da 37 ° C da qo'zg'atilgan.600 100 mkM IPTG bilan 0,6. Keyin hujayralar 4 soat davomida inkubatsiya qilindi, yig'ib olinadi va MgtB uchun yuqorida aytib o'tilganidek, lizing qilindi.
Xom hujayra ekstraktlari hujayra qoldiqlarini cho'ktirish uchun 15000 × g va 4 ° C da santrifüj qilindi. Aniqlangan ekstraktlar ÄKTAprime Plus tizimidan foydalangan holda 1 ml HisTrap FF Crude ustunlariga yuklangan. Fermentlar ishlab chiqaruvchining His-belgilangan oqsillarni gradient elyusiyasi bo'yicha protokoliga muvofiq tozalandi. Elutlangan protein eritmalari 4 ° C da 0,3 M NaCl bilan 50 mM PBS, pH 7,4, 1000 hajmga qarshi ikki marta dializ qilindi. Tozalash 12% SDS-PAGE tomonidan tahlil qilindi. Protein konsentratsiyasi Roti-Quant yordamida Bredford usuli bilan aniqlandi. (Rabausch va boshq. 2013)
E. coli bakteriyalaridan oqsillarni ultratovush yordamida olish
Qiziqarli o'lja oqsili (bu holda, Arabidopsis thaliana MTV1) GST yorlig'iga birlashtiriladi va BL21 Escherichia coli (E. coli) hujayralarida ifodalanadi.
- GST-MTV1 va GST (50 ml bakterial madaniyatga to'g'ri keladi) ning bitta pelletini oling va har birini 2,5 ml muzli ekstraksiya buferida qayta suspenziya qiling.
- UP100H ultrasonikatoridan (taxminan 2-5 ml hajmdagi kichik hajmlar uchun MS3 mikrotip-sonotrodi bilan jihozlangan) foydalaning, bakterial hujayralarni parchalanmaguncha buzing, bu shaffoflikning pasayishi va yopishqoqlikning oshishi bilan ko'rsatiladi. Bu muz ustida amalga oshirilishi kerak va vaqti-vaqti bilan sonikatsiya qilish tavsiya etiladi (masalan, 10 soniya sonikatsiya, keyin muzda 10 soniya pauza va hokazo). Juda yuqori intensivlik bilan sonikatsiya qilmaslik uchun ehtiyot bo'lish kerak. Agar ko'piklanish yoki oq cho'kma hosil bo'lishi aniqlansa, intensivlikni kamaytirish kerak.
- Lizislangan bakteriya eritmasini 1,5 ml mikrotsentrifuga naychalariga o'tkazing va 4 ° C, 16 000 xg 20 daqiqa davomida santrifüj qiling.
UP400St kabi prob tipidagi ultrasonikatorlar E.coli ning samarali lizisi uchun akustik kavitatsiyaning ishlash printsipidan foydalaning.
Sonication yordamida rekombinant oqsilni ifodalash tahlili va tozalash
E. coli pelleti Hielscher ultratovush apparati UP100H bilan ultratovush qilindi. Shu maqsadda hujayra pelleti sovutilgan lizis tamponida (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) qayta suspenziya qilindi va 10 daqiqa davomida muzda sovutildi. Keyin hujayra suspenziyasi 10 sekundlik 10 ta qisqa portlashlar, so'ngra sovutish uchun 30 soniyalik interval bilan sonikatsiya qilindi. Nihoyat, hujayra qoldiqlari 14000 aylanish tezligida 15 daqiqa davomida 4 ° C da ultratsentrifugalash orqali olib tashlandi. rPR ifodasini tasdiqlash uchun supernatant 12% poliakrilamid jelida ishlatildi va SDS-PAGE va Western blotting orqali tahlil qilindi. rPRni tozalash ishlab chiqaruvchi qo'llanmasiga muvofiq Ni2 + -NTA qatroni (Invitrogen, AQSh) yordamida amalga oshirildi. Ushbu bosqichda tabiiy tozalash usuli qo'llaniladi. Tozalangan oqsilning tozaligi 12% poliakrilamid jelida elektroforez yordamida va keyinchalik Coomassie ko'k rangda bo'yalgan holda baholandi. Tozalangan oqsil kontsentratsiyasi Micro BCA protein tahlili to'plami (PIERCE, AQSh) bilan o'lchandi. (Azarnezhad va boshq. 2016)
E. coli lizis uchun ultratovushli homogenizatorlar
Hielscher Ultrasonics E. coli bakteriyalari va boshqa hujayra turlari, to'qimalari va hujayra madaniyatlarining ishonchli va samarali lizisi uchun yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqadi, ishlab chiqaradi va etkazib beradi.
Ultrasonik zondlarning keng portfeli, shuningdek, bilvosita sonikatsiya tizimlari sizga hujayra buzilishi va ekstraktsiyasi uchun ideal ultratovushli to'qimalar homogenizatorini taklif qilish imkonini beradi.
Dizayn, ishlab chiqarish va konsalting – Germaniyada ishlab chiqarilgan sifat
Hielscher ultrasonikatorlari eng yuqori sifat va dizayn standartlari bilan mashhur. Aqlli dasturiy ta'minot, intuitiv menyu, dasturlashtiriladigan sozlamalar va avtomatik ma'lumotlarni protokollash Hielscher ultrasonikatorlarining bir nechta xususiyatlari. Barqarorlik va qulay foydalanish ultratovush apparatlarimizni tadqiqot va biotexnologik ob'ektlarga muammosiz integratsiyalashuviga imkon beradi. Hatto qo'pol sharoitlar va talabchan muhitlar Hielscher ultrasonicators tomonidan osonlik bilan ishlov beriladi.
Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatiga ega kompaniya bo'lib, eng zamonaviy texnologiya va foydalanuvchilarga qulaylik bilan ajralib turadigan yuqori samarali ultratovush apparatlariga alohida e'tibor beradi. Albatta, Hielscher ultrasonikatorlari Idoralar talablariga javob beradi va UL, CSA va RoHs talablariga javob beradi.
Quyidagi jadvalda ultrasonikatorlarimizning taxminiy qayta ishlash quvvati ko'rsatilgan:
| To'plam hajmi | Oqim darajasi | Tavsiya etilgan qurilmalar |
|---|---|---|
| ko'p quduqli / mikrotitrli plitalar | na | UIP400MTP |
| Flakonlar yoki stakan uchun CupHorn | na | Ultrasonik kubok |
| ultratovushli mikro-oqimli reaktor | na | GDmini2 |
| 0,5 dan 1,5 ml gacha bo'lgan 10 flakongacha | na | VialTweeter |
| 0,5 dan 1,5 ml gacha | na | VialTweeter |
| 1 dan 500 ml gacha | 10 dan 200 ml / min | UP100H |
| 10 dan 2000 ml gacha | 20 dan 400 ml / min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 dan 20 L gacha | 0.2 dan 4L/min gacha | UIP2000hdT |
| 10 dan 100 l gacha | 2 dan 10 l / min | UIP4000 |
| na | 10 dan 100 l / min | UIP16000 |
| na | kattaroq | ning klasteri UIP16000 |
Biz bilan bog'lanish! / Bizdan so'rang!
Ultrasonik E. coli lizis uchun qo'shimcha protokollar
Ultrasonik VialTweeter yordamida E. colidagi allitsin bilan o'zgartirilgan oqsillar
Sulfhidril tarkibini 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoy kislotasi) (DTNB) tahlili bilan aniqlash
MOPS minimal muhitini (1:100) emlash uchun E. coli MG1655 tungi madaniyati ishlatilgan. A600 0,4 ga erishilgunga qadar madaniyat aerobik tarzda o'stirildi. Madaniyat stressni davolash uchun uchta 15 ml kulturaga bo'lingan. Davolanmagan madaniyat salbiy nazorat bo'lib xizmat qildi. Qolgan ikkita kulturadan biriga 0,79 mM allitsin (128 mkg ml-1) yoki 1 mM diamid qo'shildi. Madaniyatlar 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Har bir madaniyatdan 5 ml tsentrifugalash orqali yig'ib olindi (8,525 × g, 4 ° C, 10 min). Hujayralar ikki marta 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, foydalanishdan oldin anaerobik saqlanadi) bilan yuvilgan va santrifüj qilingan (13,000 × g, 4 ° C). Hujayralar ultratovush orqali 4 ° C da buzilishidan oldin lizis buferida (6 mM guanidinium HCl, pH 7.4 bilan PBS) qayta suspenziya qilindi (VialTweeter ultrasonikator, Hielscher GmbH, Germaniya) (3 × 1 min). Hujayra qoldiqlari santrifüjlash (13000 × g, 4 ° C, 15 min) yo'li bilan pelletlangan. Supernatant magnit aralashtirgichli 3,5 ml QS-makrokyuvetaga (10 mm) o'tkazildi va 1 ml lizis buferi bilan aralashtirildi. Namunalarning yo'q bo'lib ketishi xona haroratida PSC-718 harorat bilan boshqariladigan hujayra ushlagichi bilan jihozlangan Jasco V-650 spektrofotometri bilan 412 nm da kuzatildi. 100 mkl 3 mM ditiobis (2-nitrobenzoy kislotasi) eritmasi qo'shildi. Yo'q bo'lib ketish to'yinganlik darajasiga yetguncha kuzatildi. Tiol konsentratsiyasini hisoblash so'nish koeffitsienti s yordamida amalga oshirildi412 = 13 700 M-1 sm-1 tio-2-nitrobenzoy kislotasi (TNB) uchun. Hujayradagi tiol kontsentratsiyasi 6,7 × 10 bo'lgan E. coli hujayralari hajmiga qarab hisoblangan.-15 litr va hujayra zichligi A600 = 0,5 (1 × 10 ga teng)8 hujayralar ml-1 madaniyat). (Myuller va boshq. 2016)
Ultrasonik hujayra maydalagich yordamida in Vivo glutationni aniqlash
E.coli MG1655 MOPS minimal muhitida 200 ml umumiy hajmda, A600 0,5 ga yetguncha yetishtirildi. Madaniyat stressni davolash uchun 50 ml kulturalarga bo'lingan. 0,79 mM allitsin, 1 mM diamid yoki dimetil sulfoksid (nazorat) bilan 15 daqiqa inkubatsiyadan so'ng hujayralar 4000 g da 4 ° C da 10 daqiqa davomida yig'ib olindi. 700 µl KPE buferida pelletlarni qayta suspenziya qilishdan oldin hujayralar KPE buferi bilan ikki marta yuvildi. Deproteinatsiya qilish uchun hujayralarni ultratovush orqali buzishdan oldin (3 x 1 min; VialTweeter ultratovush apparati). Supernatantlar santrifüjdan so'ng yig'ildi (30 min, 13000 g, 4 ° C). 3 hajmli KPE buferi qo'shilishi bilan sulfosalitsil kislotasi kontsentratsiyasi 1% gacha kamaydi. Umumiy glutation va GSSG o'lchovlari yuqorida aytib o'tilganidek amalga oshirildi. Hujayradagi glutation kontsentratsiyasi E. coli hujayralarining 6,7 hajmiga qarab hisoblab chiqilgan.×10-15 litr va hujayra zichligi A600 0,5 (1 ga ekvivalent).×108 hujayralar ml-1 madaniyat). GSH kontsentratsiyasi umumiy glutationdan 2[GSSG] ayirish yo'li bilan hisoblangan. (Myuller va boshq. 2016)
Ultrasonik gomogenizator yordamida E. coli da inson mAspAT ifodasi
E. coli BL21 (DE3) ning yagona koloniyasi 30 ml Luria-Bertani (LB) muhitida 100 mkg/ml ampitsillinni o‘z ichiga olgan, so‘ngra optik zichlikka (OD) qadar 37ºC da yetishtiriladi.600) 0,6 ga yetdi. Hujayralar 10 daqiqa davomida 4000 × g santrifüjlash orqali yig'ib olindi va 100 mkg / ml ampitsillin o'z ichiga olgan 3 L yangi LB muhitida qayta suspenziya qilindi.
Keyinchalik, 16ºC da 20 soat davomida 1 mM izopropil b-ᴅ-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) bilan protein ekspressiyasi indüklendi. Hujayralar 15 daqiqa davomida 8000 × g da santrifüjlash orqali yig'ib olindi va bufer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) bilan yuvildi. Taxminan 45 g (ho'l vazn) hujayralar 3 L madaniyatdan olingan. Santrifüjdan so'ng, hujayra granulalari 40 ml (1 L madaniyat uchun) muzli sovuq ekstraksiya tamponida qayta suspenziya qilindi va Hielscher ultratovushli hujayra maydalagich UP400St yordamida muzli sovuq haroratda ultratovush orqali lizing qilindi. Hujayra lizisi eruvchan (supernatant) va cho'kma (pellet) fraktsiyalarini ajratish uchun 12000 rpm da 15 daqiqa davomida santrifüj qilindi. (Jiang va boshq. 2015)
Bilishga arziydigan faktlar
E.coli
Ichak tayoqchasi (E. coli) grammanfiy, fakultativ anaerob, tayoqsimon, ichak tayoqchasi boʻlib, koʻpincha issiq qonli organizmlarning (endotermiya) pastki ichaklarida uchraydi. Turli xil xususiyatlarga ega bo'lgan ko'p sonli E. coli shtammlari (yoki pastki tiplari) mavjud. Aksariyat E. coli shtammlari odamlar uchun zararsizdir, masalan, B va K-12 shtammlari laboratoriyalarda tadqiqot qoʻllash uchun keng qoʻllaniladi. Biroq, ba'zi shtammlar zararli va jiddiy kasalliklarga olib kelishi mumkin.
E. coli zamonaviy biologik muhandislik va sanoat mikrobiologiyasida muhim rol o'ynaydi, chunki bakteriyalarni boshqarish oson. Ko'pincha E. coli dan foydalanishni o'z ichiga olgan keng tarqalgan laboratoriya ilovalari, masalan, rekombinant deoksiribonuklein kislotasini (DNK) yaratish yoki namunaviy organizm sifatida harakat qilish.
E. coli geterologik oqsillarni ishlab chiqarish uchun juda ko'p qirrali xost bo'lib, E. coli'da rekombinant oqsillarni ishlab chiqarish uchun ko'p qirrali oqsillarni ifodalash tizimlari mavjud. Proteinning yuqori darajada ifodalanishiga imkon beruvchi plazmidlar yordamida genlar bakteriyalarga kiritilishi mumkin, bu esa sanoat fermentatsiyasi jarayonida bunday oqsillarni yuqori miqdorda ishlab chiqarish imkonini beradi.
E.coli insulin ishlab chiqarish uchun hujayra zavodlari sifatida ishlatiladi. Keyingi qo'llanmalar modifikatsiyalangan E. coli hujayralaridan vaktsinalar va immobilizatsiyalangan fermentlarni ishlab chiqish va ishlab chiqarish, bioyoqilg'i ishlab chiqarish, shuningdek bioremediatsiya uchun foydalanishni o'z ichiga oladi.
K-12 shtammi E. coli ning mutant shakli boʻlib, ishqoriy fosfataza (ALP) fermentini haddan tashqari ifodalaydi. Ushbu mutatsiya fermentni doimiy ravishda kodlaydigan gendagi nuqson tufayli yuzaga keladi. Agar gen hech qanday inhibisyonsiz mahsulot ishlab chiqarsa, bu konstitutsiyaviy faollik deb nomlanadi. Ushbu mutant shakli ALP fermentini izolyatsiya qilish va tozalash uchun ishlatiladi.
E. coli bakteriyalari hujayra zavodlari sifatida ham keng qo'llaniladi. Hujayra fabrikalari sifatida ishlab chiqilgan mikroblar (masalan, bakteriyalar) va o'simlik hujayralaridan foydalanish mumkin. Ushbu genetik modifikatsiyalangan hujayralar molekulalar, kimyoviy moddalar, polimerlar, oqsillar va boshqa moddalarni ishlab chiqaradi, masalan, farmatsevtika, oziq-ovqat va kimyo sanoatida qo'llaniladi. Bunday biomuhandislik hujayralarining ichki qismida hosil bo'lgan molekulalarni chiqarish uchun ultratovushli liziz hujayra devorlarini buzish va maqsadli moddalarni atrofdagi suyuqlikka o'tkazishning keng tarqalgan usuli hisoblanadi. Biologik muhandislik hujayralarining lizisi haqida ko'proq o'qing!
Ultrasonik DNKni kesish
Ultrasonik kesish kuchlari hujayra ichidagi molekulalarni, organellalarni va oqsillarni chiqarish, shuningdek, DNK iplarini bo'laklarga bo'lish uchun keng tarqalgan usuldir. Akustik kavitatsiya hujayra devorlari va membranalarini sindirib, hujayralardan DNKni ajratib oladi va taxminan 600 ta bo'laklarni hosil qiladi. – 800 bp uzunlikda, bu tahlil qilish uchun ideal.
DNK parchalanishi uchun ultratovushli gomogenizatorlar haqida ko'proq ma'lumot olish uchun shu yerni bosing!
Adabiyot / Adabiyotlar
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics kompaniyasi yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqaradi laboratoriya uchun sanoat hajmi.