Ultrasonik usul bilan BL21 hujayralarining hujayra lizisi
Oqsillarni ifodalash uchun BL21 hujayralari
BL21 xujayrasi T7 RNK polimeraza-IPTG indüksiyon tizimidan foydalangan holda transformatsiya va yuqori darajadagi protein ekspresyonu uchun mos bo'lgan kimyoviy jihatdan vakolatli E. coli bakterial shtammidir. BL21 hujayralari T7 promouteri nazorati ostida bo'lgan har qanday genning yuqori samaradorlikdagi oqsil ekspresiyasini ta'minlaydi. E. coli shtamm BL21 (DE3) T7 RNK-polimeraza asosidagi oqsil ishlab chiqarish shtammidir va T7 promotorga asoslangan ekspresyon vektorlari bilan birlashtirilgan va rekombinant oqsillarni ishlab chiqarish uchun laboratoriyalarda va sanoatda keng qo'llaniladi. BL21 (DE3) da rekombinant oqsilni kodlovchi gen ekspressioni xromosomal kodlangan T7 RNK-polimeraza (T7 RNAP) tomonidan transkripsiya qilinadi, bu an'anaviy E. coli RNAP ga qaraganda sakkiz marta tezroq yoziladi. Bu BL21 (DE3) shtammini yuqori samaradorlikka ega qiladi va uni eng maqbul oqsil ekspression hujayralari tizimlaridan biriga aylantiradi.
BL21 hujayralaridan ultratovushli liziz va oqsil olish protokoli
BL21 hujayralarining hujayra lizisi asosan ultratovush yordamida natriy lauroyl sarkosinati (sarkosil deb ham ataladi) bilan birgalikda lizis buferi yordamida amalga oshiriladi. Ultratovush hujayralarni buzilishi va oqsillarni ekstraktsiyalashning afzalliklari ultrasonikatorlarning ishonchliligi, takrorlanuvchanligi va sodda, xavfsiz va tezkor ishlashida. Quyidagi protokol ultratovushli BL21 hujayra lizisi uchun bosqichma-bosqich ko'rsatma beradi:
Ultrasonik hujayraning buzilishi UP200St lizis va oqsil olish uchun S26d2 mikro uchi bilan
- Shaperon oqsillarini yo'q qilish uchun BL21 bakterial pelletlari 50 ml muzli natriy Tris-EDTA (STE) buferida qayta tiklandi (10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl 100 mM bilan to'ldirilgan) PMSF).
- , 500 ul lizozim (10 mg / ml) qo'shiladi va hujayralar muz ustida 15 daqiqa davomida inkübe qilinadi.
- Keyinchalik, 500 ul DTT va 7 ml sarkosil (STE tamponida hosil bo'lgan 10% (og'irlik)) qo'shiladi.
- Barcha tozalash buferlarini muzdek saqlash va namunalarni har doim muzda saqlash juda zarur. Barcha tozalash bosqichlari iloji bo'lsa sovuq xonada amalga oshirilishi kerak.
- Ultrasonik lizis va oqsil ekstrakti uchun namunalar sonikatsiyalanadi VialTweeter MultiSample ultratovush tekshiruvi 100% amplituda 4 x 30 soniya davomida har bir sonikatsiya o'rtasida 2 min interval bilan. Shu bilan bir qatorda, proba tipidagi ultratovushli homogenizator, masalan, mikro uchi bilan, Uf200 ः t S26d2 bilan (3 x 30 soniya, ultratovush tsikllari orasidagi 2 min pauza, 80% amplituda) foydalanish mumkin.
- Keyingi tozalash bosqichlari uchun namunalar muzda saqlanishi yoki qo'shimcha ishlov berilgunga qadar -80 ° C darajasida saqlanishi kerak.
Prescise Temperature Control ostida ultratovushli lizis
Biologik namunalar bilan ishlashda haroratni aniq va ishonchli boshqarish juda muhimdir. Yuqori haroratlar namunalarda termal induksiyalangan oqsil parchalanishini boshlaydi.
Barcha mexanik namunalarni tayyorlash texnikasi kabi ultratovush issiqlikni hosil qiladi. Biroq, VialTweeter-dan foydalanganda namunalarning harorati yaxshi nazorat qilinishi mumkin. Namunalaringizni tahlil qilish uchun VialTweeter va VialPress bilan tayyorlayotganda, ular harorati nazorat qilish va boshqarish uchun sizga turli xil variantlarni taqdim etamiz.
- Namuna haroratini nazorat qilish: VialTweeter-ni boshqaradigan UP200St ultratovush protsessori aqlli dasturiy ta'minot va ulanadigan harorat sensori bilan jihozlangan. Harorat sensori UP200St-ga ulang va harorat sensori uchini namuna naychalarining biriga joylashtiring. Raqamli rangli sensorli displey orqali UP200St menyusida ultratovush namunasi uchun ma'lum bir harorat oralig'ini o'rnatishingiz mumkin. Ultrasonikator maksimal haroratga yetganda avtomatik ravishda to'xtaydi va namuna harorati belgilangan haroratning pastki qiymatiga tushguncha to'xtaydi. Keyin sonikatsiya yana avtomatik ravishda boshlanadi. Ushbu aqlli xususiyat issiqlik ta'sirida buzilishning oldini oladi.
- VialTweeter blokini oldindan sovutish mumkin. Titan blokini oldindan sovutish uchun muzlatgichga yoki muzlatgichga VialTweeter blokini qo'ying (faqat transdusersiz sonotrod!) Namunadagi harorat ko'tarilishini kechiktirishga yordam beradi. Iloji bo'lsa, namunaning o'zi ham oldindan sovutilishi mumkin.
- Sonikatsiya paytida sovutish uchun quruq muzdan foydalaning. Quruq muz bilan to'ldirilgan sayoz laganda ishlating va issiqlik tezda tarqalishi uchun VialTweeter-ni muz ustiga qo'ying.
Biologik, biokimyoviy, tibbiy va klinik laboratoriyalarda kundalik namunalarni tayyorlash uchun butun dunyo bo'ylab mijozlar VialTweeter va VialPress-dan foydalanadilar. UP200St protsessorining aqlli dasturiy ta'minoti va haroratni boshqarish, harorat ishonchli boshqariladi va issiqlik ta'sirida namuna parchalanishiga yo'l qo'yilmaydi. VialTweeter va VialPress bilan ultratovush namunalarini tayyorlash juda ishonchli va takrorlanadigan natijalarni beradi!
Lizik dastur uchun optimal ultratovushli buzuvchini toping
Hielscher Ultrasonics laboratoriyalar, dastgoh usti va sanoat miqyosidagi tizimlar uchun yuqori samarali ultratovushli hujayralarni buzuvchi va homogenizatorlar ishlab chiqaradigan uzoq yillik tajribaga ega. Sizning bakterial hujayra madaniy hajmingiz, tadqiqotlaringiz yoki ishlab chiqarish maqsadlaringiz va soatiga yoki kuniga ishlov beradigan hujayraning hajmi sizning qo'llashingiz uchun to'g'ri ultratovushli hujayraning buzilishini topish uchun muhim omillardir.
Hielscher Ultrasonics bir vaqtning o'zida ko'p namunalarni (VialTweeter bilan 10 ta flakongacha) va massa namunalarini (ya'ni, mikrotitrli plitalar / UIP400MTP bilan ELISA plitalarini) ultratovushli ultratovush tekshiruvi uchun turli xil echimlarni taklif etadi 50 dan 400 vattgacha bo'lgan quvvat, to'liq ishlab chiqariladigan ultratovushli protsessorlarga qadar 16000 vattgacha bo'lgan hujayraning tijorat buzilishi va katta ishlab chiqarishda oqsil olish uchun. Barcha Hielscher ultrasonikatorlari to'liq yuk ostida 24/7/365 ishlashi uchun qurilgan. Sog'lomlik va ishonchlilik ultratovushli qurilmalarimizning asosiy xususiyatlari.
Barcha raqamli ultratovushli homogenizatorlar aqlli dasturiy ta'minot, rangli sensorli displey va avtomatik ma'lumotlarni protokollash bilan jihozlangan bo'lib, ular ultratovush qurilmasini laboratoriya va ishlab chiqarish binolarida qulay ish vositasiga aylantiradi.
Biologik namunalaringizni qayta ishlash uchun qanday hujayralar, qanday hajmda, qaysi chastotada va qanday maqsad bilan ishlashingiz kerakligini bizga xabar bering. Jarayon talablari uchun sizga eng mos ultratovushli hujayra buzilishini tavsiya etamiz.
Quyidagi jadvalda bizning ultratovush tizimlarimizning ixcham qo'l homogenizatorlari va MultiSample ultratovush tekshirgichlaridan tijorat maqsadlarida foydalanish uchun ultratovushli protsessorlarga ishlov berish hajmi taxminiy ko'rsatkichi berilgan:
| Buyurtma miqdori | Oqim darajasi | Tavsiya Qurilmalar |
|---|---|---|
| 96 quduq / mikrotitr plitalari | ga | UIP400MTP |
| 10 flakon 0,5 dan 1,5 ml gacha | ga | UP200St da VialTweeter |
| 0.01 dan 250 ml gacha | 5 dan 100 ml / min | UP50H |
| 0.01 dan 500 ml gacha | 10 200ml / min uchun | UP100H |
| 10 2000mL uchun | 20 400ml / min uchun | Uf200 ः t, UP400St |
| 0.1 20L | 04L / min uchun .2 | UIP2000hdT |
| 10 100L uchun | 10L 2 / min | UIP4000hdT |
| ga | 10 100L / min uchun | UIP16000 |
| ga | katta | Klaster UIP16000 |
Biz bilan bog'lanish! Bizdan so'rang!
ultrasonikator Uf200 ः t kichik namunalarni sonikatsiyalash uchun 2 mm mikrotipli S26d2 bilan
Adabiyotlar / Adabiyotlar
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Bilishingiz kerak bo'lgan dalillar
Escherichia Coli bakteriyalari
Escherichia coli bakteriyalar turi bo'lib, u spora hosil qilmaydi, gram-manfiydir va to'g'ri tayoq shakli bilan tavsiflanadi. E.coli bakteriyalari atrof muhitda, oziq-ovqat va odam va hayvonlarning ichaklarida mavjud. E. coli odatda peritrichous flagella yordamida harakatchan, ammo harakatsiz turlari ham mavjud. E.coli fakultativ ravishda anaerobik ximoorganotrof organizmlar deb ataladi, ya'ni ular nafas olish va fermentativ metabolizmga qodir. E.coli turlarining aksariyati zararsiz va organizmdagi foydali funktsiyalarni bajaradi, masalan, zararli bakteriyalar turlarini ko'payishini to'xtatish, vitaminlarni sintez qilish va boshqalar.
B turi deb ataladigan ichak tayoqchasi bakteriyalar hujayrasi bu E.coli shtammlarining maxsus toifasi bo'lib, ular bakteriofaglarga sezgirlik yoki restriksiya-modifikatsiya tizimlari kabi mexanizmlarni tadqiq qilishda keng qo'llaniladi. Bundan tashqari, E.coli bakteriyalari biotexnologiya va hayotshunoslik laboratoriyalarida oqsil ekspresiyasi uchun ishonchli ishchi ot sifatida baholanadi. Masalan, E.coli sanoat miqyosida oqsillar va oligosakkaridlar kabi birikmalarni sintez qilish uchun ishlatiladi. Proteaza etishmovchiligi, glyukozaning yuqori darajasida kam asetat ishlab chiqarilishi va o'tkazuvchanlikning kuchayishi kabi o'ziga xos xususiyatlar tufayli E. coli B hujayralari u genetik jihatdan yaratilgan oqsillarni ishlab chiqarish uchun eng ko'p ishlatiladigan xujayra hisoblanadi.
Rekombinant oqsil
Rekombinant oqsillar (rProt) ko'p tarmoqlarda, shu jumladan kimyoviy ishlab chiqarish, farmatsevtika, kosmetika, odam va hayvonot tibbiyoti, qishloq xo'jaligi, oziq-ovqat, shuningdek chiqindilarni qayta ishlash sanoatida muhim ahamiyat kasb etmoqda.
Rekombinant oqsil ishlab chiqarish ekspression tizimidan foydalanishni talab qiladi. Rekombinant DNKni ishlab chiqarish uchun ekspression hujayra tizimlari sifatida prokaryotik va eukaryotik hujayralardan foydalanish mumkin. Bakterial hujayra oqsillarni ekspression qilish uchun eng arzon narx, oson ölçeklenebilirlik va oddiy muhit kabi omillar tufayli keng qo'llanilgan bo'lsa-da, sutemizuvchilar, xamirturush, suv o'tlari, hasharotlar va hujayrasiz tizimlar muqobil. Protein turi, funktsional faolligi, shuningdek, ifoda etilgan oqsilning zarur hosildorligi oqsil ekspressioni uchun ishlatiladigan hujayra tizimini tanlashga ta'sir qiladi.
Rekombinant oqsilni ifoda etish uchun ma'lum bir hujayradan rekombinat DNK shablonini o'z ichiga olgan DNK vektori bilan transfektsiya qilish kerak. Shablon bilan transfektsiya qilingan hujayralar keyinchalik o'stiriladi. Uyali mexanizm natijasida hujayralar qiziqadigan oqsilni transkripsiya qiladi va tarjima qiladi va shu bilan maqsadli oqsil hosil qiladi.
Bunda ifoda etilgan oqsillar hujayra matritsasiga tushganligi sababli, oqsillarni bo'shatish uchun hujayra lizlangan (buzilgan va buzilgan) bo'lishi kerak. Keyingi tozalash bosqichida oqsil ajratiladi va tozalanadi.
Davolashda birinchi rekombinant oqsil 1982 yilda rekombinant odam insulini bo'lgan. Bugungi kunda tibbiy muolajalar uchun dunyoda 170 dan ortiq rekombinant oqsillar ishlab chiqarilmoqda. Tibbiyotda tez-tez ishlatiladigan rekombinant oqsillar, masalan, rekombinat gormonlar, interferonlar, interleykinlar, o'sish omillari, o'smaning nekroz omillari, qon ivish omillari, trombolitik dorilar va diabet, mittiizm, miokard infarkti, konjestif yurak etishmovchiligi kabi asosiy kasalliklarni davolash uchun fermentlar. miya apopleksiyasi, skleroz, neytropeniya, trombotsitopeniya, anemiya, gepatit, revmatoid artrit, astma, Kron kasalligi va saraton kasalligini davolash usullari. (qarang: Phuc V. Pham, Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Yuqori ishlash ultratovush! Hielscher mahsulot assortimenti ixcham laboratoriya ultrasonikatoridan dastgoh uskuna ustidagi to'liq sanoat ultratovush tizimlariga qadar to'liq spektrni qamrab oladi.