Ultrasonikatsiya orqali BL21 hujayralarining hujayra lizisi
BL21 xujayralari E. coli shtammi bo'lib, oqsillarni yuqori samarali ifodalash qobiliyati tufayli tadqiqot laboratoriyalari, biotexnologiya va sanoat ishlab chiqarishida keng qo'llaniladi. Ultrasonik hujayra buzilishi, lizis va oqsil ekstraktsiyasi BL21 hujayralarining hujayra ichki qismidan maqsadli oqsillarni ajratish va yig'ishning keng tarqalgan usuli hisoblanadi. Ultrasonikatsiya hujayrani to'liq buzadi va barcha to'plangan oqsillarni chiqaradi, bu esa oqsilning 100% ni mavjud qiladi.
Protein ifodasi uchun BL21 hujayralari
BL21 xujayrasi T7 RNK polimeraza-IPTG indüksiyon tizimidan foydalangan holda transformatsiya va yuqori darajadagi protein ifodasi uchun mos keladigan kimyoviy jihatdan vakolatli E. coli bakterial shtammidir. BL21 xujayralari T7 promouteri nazorati ostida bo'lgan har qanday genning yuqori samarali protein ifodasini ta'minlaydi. E. coli shtammi BL21 (DE3) T7 RNK polimeraza asosidagi protein ishlab chiqarish shtammi bo'lib, T7 promotoriga asoslangan ekspresyon vektorlari bilan birlashtirilgan va rekombinant oqsillarni ishlab chiqarish uchun laboratoriya va sanoatda keng qo'llaniladi. BL21(DE3) da rekombinant oqsilni kodlovchi genning ifodasi xromosoma bilan kodlangan T7 RNK polimeraza (T7 RNAP) orqali transkripsiyalanadi, bu an’anaviy E. coli RNAPga qaraganda sakkiz marta tezroq transkripsiyalanadi. Bu BL21 (DE3) shtammini yuqori samaradorlikka olib keladi va uni eng ko'p afzal qilingan protein ekspression hujayra tizimlaridan biriga aylantiradi.
Ultrasonik lizis va BL21 hujayralaridan oqsil olish protokoli
BL21 hujayralarining hujayra lizisi asosan liziz tamponi sifatida natriy lauroil sarkosinat (shuningdek, sarkosil deb ham ataladi) bilan birgalikda ultratovush yordamida amalga oshiriladi. Ultrasonik hujayralarni buzish va oqsillarni olishning afzalliklari ultrasonikatorlarning ishonchliligi, takrorlanishi va oddiy, xavfsiz va tezkor ishlashida yotadi. Quyidagi protokol ultratovushli BL21 hujayra lizisi uchun bosqichma-bosqich yo'nalishni beradi:
- Chaperon oqsillarini olib tashlash uchun BL21 bakterial granulalari 50 ml muzli sovuq natriy Tris-EDTA (STE) tamponida (10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl 100M qo'shilgan) qayta suspenziya qilindi. PMSF).
- 500 ul lizozim (10 mg/ml) qo'shiladi va hujayralar muz ustida 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi.
- Keyin 500 ul DTT va 7 ml sarkosil (STE buferida tashkil topgan 10% (h/h)) qo'shiladi.
- Barcha tozalash tamponlarini muzdek saqlash va namunalarni doimo muzda saqlash juda muhimdir. Iloji bo'lsa, barcha tozalash bosqichlari sovuq xonada amalga oshirilishi kerak.
- Ultrasonik lizis va oqsillarni olish uchun namunalar ultratovushda sonikatsiya qilinadi VialTweeter MultiSample Ultrasonikator 100% amplituda 4 x 30 soniya davomida har bir sonikatsiya o'rtasida 2 daqiqalik interval bilan. Shu bilan bir qatorda, mikro uchli zond tipidagi ultratovushli gomogenizator, masalan, UP200Ht S26d2 bilan (3 x 30 sek, ultratovush davrlari orasidagi 2 min. pauza, 80% amplituda) foydalanish mumkin.
- Keyingi tozalash bosqichlari uchun namunalar muz ustida saqlanishi yoki keyingi ishlov berilgunga qadar -80 ° C da saqlanishi kerak.
Ultrasonik hujayra buzuvchisi UP200St lizis va oqsillarni olish uchun mikro-uchli S26d2 bilan
Aniq harorat nazorati ostida ultratovushli lizis
Biologik namunalar bilan ishlashda haroratni aniq va ishonchli nazorat qilish juda muhimdir. Yuqori haroratlar namunalarda termal sabab bo'lgan protein degradatsiyasini boshlaydi.
Namuna tayyorlashning barcha mexanik usullari singari, sonikatsiya issiqlik hosil qiladi. Biroq, VialTweeter-dan foydalanganda namunalarning harorati yaxshi nazorat qilinishi mumkin. Biz sizga VialTweeter va VialPress yordamida namunalaringiz haroratini kuzatish va nazorat qilish uchun turli xil variantlarni taqdim etamiz.
- Namuna haroratini kuzatish: VialTweeter-ni boshqaradigan ultratovushli protsessor UP200St aqlli dasturiy ta'minot va ulanadigan harorat sensori bilan jihozlangan. Harorat sensorini UP200St ga ulang va harorat sensori uchini namuna naychalaridan biriga joylashtiring. Raqamli rangli sensorli displey orqali siz UP200St menyusida namunaviy sonikatsiya uchun ma'lum bir harorat oralig'ini o'rnatishingiz mumkin. Ultrasonikator maksimal haroratga erishilganda avtomatik ravishda to'xtaydi va namuna harorati belgilangan harorat ∆ pastki qiymatiga tushguncha pauza qiladi. Keyin sonication yana avtomatik ravishda boshlanadi. Bu aqlli xususiyat issiqlikdan kelib chiqadigan buzilishning oldini oladi.
- VialTweeter bloki oldindan sovutilishi mumkin. Titan blokini oldindan sovutish uchun VialTweeter blokini (faqat transdusersiz sonotrod!) muzlatgichga yoki muzlatgichga qo'ying, namunadagi harorat ko'tarilishini kechiktirishga yordam beradi. Iloji bo'lsa, namunaning o'zi ham oldindan sovutilishi mumkin.
- Sonikatsiya paytida sovutish uchun quruq muzdan foydalaning. Quruq muz bilan to'ldirilgan sayoz patnisdan foydalaning va issiqlik tez tarqalishi uchun VialTweeterni muz ustiga qo'ying.
Butun dunyo bo'ylab mijozlar VialTweeter va VialPress-dan biologik, biokimyoviy, tibbiy va klinik laboratoriyalarda kundalik namuna tayyorlash ishlari uchun foydalanadilar. UP200St protsessorining aqlli dasturiy ta'minoti va haroratni nazorat qilish, harorat ishonchli tarzda boshqariladi va issiqlik ta'sirida namuna degradatsiyasining oldini oladi. VialTweeter va VialPress yordamida ultratovushli namuna tayyorlash juda ishonchli va takrorlanadigan natijalarni beradi!
Lizis ilovangiz uchun optimal ultratovushli buzuvchini toping
Hielscher Ultrasonics - bu laboratoriyalar, dastgoh va sanoat miqyosidagi tizimlar uchun yuqori samarali ultratovushli hujayra buzuvchilar va gomogenizatorlarning uzoq vaqtdan beri tajribali ishlab chiqaruvchisi. Sizning bakterial hujayra madaniyati hajmi, tadqiqot yoki ishlab chiqarish maqsadingiz va soatiga yoki kuniga qayta ishlanadigan hujayra hajmi sizning ilovangiz uchun to'g'ri ultratovush hujayra buzuvchisini topish uchun muhim omillardir.
Hielscher Ultrasonics bir vaqtning o'zida ko'p namunali (VialTweeter bilan 10 flakongacha) va ommaviy namunalarni (ya'ni, UIP400MTP mikrotitr plitalari / ELISA plitalari), shuningdek, klassik zond tipidagi laboratoriya ultrasonikatorini bir vaqtning o'zida sonication uchun turli xil echimlarni taklif etadi. quvvat darajasi 50 dan 400 vattgacha bo'lgan to'liq sanoat ultratovushli protsessorlarga qadar Katta ishlab chiqarishda tijorat hujayralarining buzilishi va oqsillarni olish uchun birlik uchun 16 000 vatt. Barcha Hielscher ultrasonikatorlari to'liq yuk ostida 24/7/365 ishlashi uchun qurilgan. Mustahkamlik va ishonchlilik ultratovush qurilmalarimizning asosiy xususiyatlari hisoblanadi.
Barcha raqamli ultratovushli gomogenizatorlar aqlli dasturiy ta'minot, rangli sensorli displey va avtomatik ma'lumotlar protokoli bilan jihozlangan, bu ultratovush qurilmasini laboratoriya va ishlab chiqarish korxonalarida qulay ish vositasiga aylantiradi.
Biologik namunalaringizni qanday hujayralar, qanday hajmda, qaysi chastotada va qaysi maqsadda qayta ishlashingiz kerakligini bizga xabar bering. Biz sizga jarayon talablaringiz uchun eng mos ultratovushli hujayra buzilishini tavsiya qilamiz.
Quyidagi jadval ixcham qo'lda ushlab turiladigan gomogenizatorlar va MultiSample Ultrasonikatorlardan tijorat ilovalari uchun sanoat ultratovushli protsessorlarigacha bo'lgan ultratovush tizimlarimizning taxminiy qayta ishlash quvvati haqida ma'lumot beradi:
| To'plam hajmi | Oqim darajasi | Tavsiya etilgan qurilmalar |
|---|---|---|
| 96-quduqli / mikrotitrli plitalar | na | UIP400MTP |
| 0,5 dan 1,5 ml gacha bo'lgan 10 flakon | na | VialTweeter da UP200St |
| 0.01 dan 250 ml gacha | 5 dan 100 ml / min | UP50H |
| 0.01 dan 500 ml gacha | 10 dan 200 ml / min | UP100H |
| 10 dan 2000 ml gacha | 20 dan 400 ml / min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 dan 20 L gacha | 0.2 dan 4L/min gacha | UIP2000hdT |
| 10 dan 100 l gacha | 2 dan 10 l / min | UIP4000hdT |
| na | 10 dan 100 l / min | UIP16000 |
| na | kattaroq | ning klasteri UIP16000 |
Biz bilan bog'lanish! / Bizdan so'rang!
UIP400MTP plastinka sonikatori 96-quduqli plitalarda yuqori o'tkazuvchanlik hujayra buzilishi uchun
ultratovush apparati UP200Ht kichik namunalarni sonikatsiya qilish uchun 2 mm mikrotipli S26d2 bilan
Bufer eritmalarini samarali va ishonchli tayyorlash uchun ultratovushli to'qimalarning gomogenizatoridan qanday foydalanish haqida ko'proq o'qing!
Bilishga arziydigan faktlar
Escherichia Coli bakteriyalari
Escherichia coli bakteriya turi bo'lib, spora hosil qilmaydi, gramm-manfiy bo'lib, to'g'ri tayoqcha shakli bilan ajralib turadi. E.coli bakteriyalari inson va hayvonlarning atrof-muhit, oziq-ovqat va ichaklarida mavjud. E. coli odatda peritrikli flagella yordamida harakatlanadi, ammo harakatsiz turlari ham mavjud. E.coli fakultativ-anaerob kimyoorganotrof organizmlar deb ataladi, ya'ni ular nafas olish va fermentativ metabolizmga qodir. Aksariyat E.coli turlari yaxshi xulqli bo'lib, organizmda foydali funktsiyalarni bajaradi, masalan, zararli bakteriyalar turlarining ko'payishini bostirish, vitaminlarni sintez qilish va hokazo.
B tipidagi Escherichia coli bakteriyasi hujayrasi E.coli shtammlarining maxsus toifasi bo'lib, ular bakteriofagning sezgirligi yoki cheklov-modifikatsiya tizimlari kabi mexanizmlarni o'rganish uchun tadqiqotlarda keng qo'llaniladi. Bundan tashqari, E.coli bakteriyalari biotexnologiya va hayot fanlari laboratoriyalarida oqsillarni ifodalash uchun ishonchli vosita sifatida baholanadi. Masalan, E.coli sanoat miqyosida oqsillar va oligosakkaridlar kabi birikmalarni sintez qilish uchun ishlatiladi. Proteaz etishmovchiligi, glyukozaning yuqori darajasida past asetat ishlab chiqarilishi va o'tkazuvchanlikning kuchayishi kabi o'ziga xos xususiyatlar tufayli E. coli B hujayralari genetik jihatdan ishlab chiqilgan oqsillarni ishlab chiqarish uchun eng ko'p ishlatiladigan xost hujayralari hisoblanadi.
Rekombinant oqsil
Rekombinant oqsillar (rProt) ko'p sohalarda, jumladan kimyo ishlab chiqarish, farmatsevtika, kosmetika, inson va hayvonot tibbiyoti, qishloq xo'jaligi, oziq-ovqat, shuningdek, chiqindilarni qayta ishlash sanoatida muhim ahamiyat kasb etmoqda.
Rekombinant oqsil ishlab chiqarish ekspression tizimdan foydalanishni talab qiladi. Rekombinant DNK ishlab chiqarish uchun hujayra tizimlarini ifodalovchi sifatida prokaryotik va eukaryotik hujayralardan foydalanish mumkin. Bakterial hujayralar arzon narxlardagi, oson miqyosda va oddiy muhit sharoitlari kabi omillar tufayli oqsillarni ifodalash uchun eng keng tarqalgan bo'lsa-da, sutemizuvchilar, xamirturushlar, suv o'tlari, hasharotlar va hujayrasiz tizimlar o'rnatilgan muqobildir. Protein turi, funktsional faolligi, shuningdek, ifodalangan oqsilning zarur hosildorligi oqsillarni ifodalash uchun ishlatiladigan hujayra tizimini tanlashga ta'sir qiladi.
Rekombinant oqsilni ifodalash uchun ma'lum bir hujayrani rekombinant DNK shablonini o'z ichiga olgan DNK vektori bilan transfektsiya qilish kerak. Shablon bilan transfektsiyalangan hujayralar keyinchalik kulturalanadi. Hujayra mexanizmi natijasida hujayralar qiziqish uyg'otadigan oqsilni transkripsiya qiladi va tarjima qiladi va shu bilan maqsadli oqsilni ishlab chiqaradi.
Eksprese qilingan oqsillar hujayra matritsasida ushlanganligi sababli, oqsillarni chiqarish uchun hujayra lizislanishi (buzilishi va parchalanishi) kerak. Keyingi tozalash bosqichida oqsil ajratiladi va tozalanadi.
Davolashda ishlatiladigan birinchi rekombinant oqsil 1982 yilda rekombinant inson insulini edi. Bugungi kunda butun dunyoda tibbiy muolajalar uchun 170 dan ortiq turdagi rekombinant oqsil ishlab chiqariladi. Tibbiyotda keng qo'llaniladigan rekombinant oqsillar, masalan, rekombinant gormonlar, interferonlar, interleykinlar, o'sish omillari, o'sma nekrozi omillari, qon ivish omillari, trombolitik dorilar va diabet, mitti, miokard infarkti, konjestif yurak etishmovchiligi kabi asosiy kasalliklarni davolash uchun fermentlar, miya apopleksiyasi, ko'p skleroz, neytropeniya, trombotsitopeniya, anemiya, gepatit, revmatoid artrit, astma, Kron kasalligi va saraton kasalliklarini davolash. (qarang. Phuc V. Pham, Omics Technologies and Bio-engineering, 2018)
Adabiyot / Adabiyotlar
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonikatori 10 ta namunani bir vaqtning o'zida sonikatsiya qilish uchun, masalan, BL21 hujayralarini buzish uchun
Yuqori samarali ultratovush! Hielscherning mahsulot assortimenti ixcham laboratoriya ultratovush qurilmasidan to'liq sanoat ultratovush tizimlarigacha bo'lgan to'liq spektrni o'z ichiga oladi.