BL21 hujayralarini ultratovush bilan lizis qilish
BL21 hujayralari oqsillarni yuqori samaradorlik bilan ekspressiya qilish qobiliyati tufayli tadqiqot laboratoriyalarida, biotexnologiyada va sanoat ishlab chiqarishida keng qoʻllaniladigan E. coli shtammidir. Hujayralarni ultratovush bilan parchalash, lizis qilish va oqsillarni ekstraksiya qilish BL21 hujayralarining ichki qismidan maqsadli oqsillarni ajratib olish va toʻplashning keng tarqalgan usulidir. Ultratovush bilan ishlov berish hujayrani toʻliq parchalaydi va uning ichida saqlanib qolgan barcha oqsillarni chiqarib, oqsilning 100% ini olish imkonini beradi.
Oqsil ekspressiyasi uchun BL21 hujayralari
BL21 hujayrasi T7 RNK polimeraza-IPTG induksiya tizimi yordamida transformatsiya va yuqori darajadagi oqsil ekspressiyasi uchun mos boʻlgan kimyoviy kompetent E. coli bakterial shtammidir. BL21 hujayralari T7 promouteri nazoratidagi har qanday genning oqsil ekspressiyasini yuqori samaradorlik bilan amalga oshirish imkonini beradi. E. coli BL21(DE3) shtammi T7 RNK polimerazasiga asoslangan oqsil ishlab chiqaruvchi shtamm boʻlib, T7 promouteriga asoslangan ekspressiya vektorlari bilan birgalikda rekombinant oqsillar ishlab chiqarish uchun laboratoriyalarda va sanoatda keng qoʻllaniladi. BL21(DE3) da rekombinant oqsilni kodlovchi gen ekspressiyasi xromosomada kodlangan T7 RNK polimerazasi (T7 RNAP) tomonidan transkripsiya qilinadi; u odatdagi E. coli RNAP ga qaraganda sakkiz baravar tezroq transkripsiya qiladi. Bu BL21(DE3) shtammini yuqori samarali qiladi va uni oqsil ekspressiyasi uchun eng koʻp afzal koʻriladigan hujayra tizimlaridan biriga aylantiradi.
BL21 hujayralarini ultratovush bilan lizis qilish va ulardan oqsillarni ekstraksiya qilish protokoli
BL21 hujayralarining lizisi asosan lizis buferi sifatida natriy lauroil sarkozinat (sarkozil nomi bilan ham tanilgan) bilan birgalikda ultratovush bilan ishlov berish orqali amalga oshiriladi. Hujayralarni ultratovush bilan parchalash va oqsillarni ekstraksiya qilishning afzalliklari ishonchlilik, natijalarning takrorlanuvchanligi hamda ultratovush qurilmalarini sodda, xavfsiz va tez ishlatish imkoniyatidadir. Quyidagi protokol BL21 hujayralarini ultratovush bilan lizis qilish boʻyicha bosqichma-bosqich koʻrsatmalar beradi:
- Shaperon oqsillarini olib tashlash uchun BL21 bakteriyalarining choʻkmalari 50 ml muzdek natriy Tris-EDTA (STE) buferida qayta suspenziyalandi (tarkibi: 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl va qoʻshimcha 100 mM PMSF).
- Keyin 500 ul lizotsim (10 mg/ ml) qoʻshiladi va hujayralar muz ustida 15 min inkubatsiya qilinadi.
- Shundan soʻng 500 ul DTT va 7 ml sarkozil (STE buferida tayyorlangan 10% (w/v)) qoʻshiladi.
- Barcha tozalash buferlarini muzdek holda saqlash va namunalarni doimo muz ustida tutish zarur. Imkon boʻlsa, barcha tozalash bosqichlari sovuq xonada bajarilishi kerak.
- Ultratovushli lizis va oqsillarni ekstraksiya qilish uchun namunalar VialTweeter MultiSample Ultrasonicator qurilmasida 100% amplitudada 4 x 30 sec davomida, har bir ultratovush bilan ishlov berish orasida 2 min tanaffus bilan ishlanadi. Muqobil ravishda mikro uchli zond turidagi ultratovushli gomogenizator, masalan, UP200Ht qurilmasini S26d2 bilan ishlatish mumkin (3 x 30 sec, ultratovush sikllari orasida 2 min. tanaffus, 80% amplituda).
- Keyingi tozalash bosqichlari uchun namunalar muz ustida saqlanishi yoki muqobil ravishda keyingi ishlov berishgacha -80°C da saqlanishi kerak.
UP200St ultratovushli hujayra parchalagichi lizis va oqsillarni ekstraksiya qilish uchun S26d2 mikro uchi bilan
Haroratni aniq nazorat qilish sharoitida ultratovushli lizis
Biologik namunalar bilan ishlashda haroratni aniq va ishonchli nazorat qilish juda muhim. Yuqori haroratlar namunalarda issiqlik taʼsiridagi oqsil parchalanishini boshlab beradi.
Namunalarni tayyorlashning barcha mexanik usullari kabi, ultratovush bilan ishlov berish ham issiqlik hosil qiladi. Biroq VialTweeter dan foydalanilganda namunalar haroratini yaxshi nazorat qilish mumkin. Namunalarni tahlil uchun VialTweeter va VialPress yordamida tayyorlash vaqtida ularning haroratini kuzatish va nazorat qilishning turli imkoniyatlarini sizga taqdim etamiz.
- Namuna haroratini kuzatish: VialTweeter ni ishlatadigan UP200St ultratovush protsessori aqlli dasturiy taʼminot va ulanadigan harorat sensori bilan jihozlangan. Harorat sensorini UP200St ga ulang va sensor uchini namuna probirkalaridan biriga kiriting. Raqamli rangli sensorli displey orqali UP200St menyusida namunangizga ultratovush bilan ishlov berish uchun muayyan harorat oraligʻini belgilashingiz mumkin. Maksimal haroratga yetilganda ultratovush qurilmasi avtomatik ravishda toʻxtaydi va namuna harorati belgilangan harorat ∆ ning quyi qiymatigacha tushguncha tanaffus qiladi. Keyin ultratovush bilan ishlov berish avtomatik ravishda yana boshlanadi. Ushbu aqlli funksiya issiqlik taʼsiridagi parchalanishning oldini oladi.
- VialTweeter blokini oldindan sovitish mumkin. Titan blokni oldindan sovitish uchun VialTweeter blokini (faqat oʻzgartirgichsiz sonotrodni!) sovitkich yoki muzlatkichga qoʻyish namunada harorat koʻtarilishini kechiktirishga yordam beradi. Imkon boʻlsa, namunaning oʻzini ham oldindan sovitish mumkin.
- Ultratovush bilan ishlov berish vaqtida sovitish uchun quruq muzdan foydalaning. Sayoz patnisni quruq muz bilan toʻldiring va issiqlik tez tarqalishi uchun VialTweeter ni muz ustiga qoʻying.
Butun dunyodagi mijozlar biologik, biokimyoviy, tibbiy va klinik laboratoriyalarda kundalik namuna tayyorlash ishlarida VialTweeter va VialPress dan foydalanadilar. UP200St protsessorining aqlli dasturiy taʼminoti va harorat nazorati yordamida harorat ishonchli nazorat qilinadi va namunalarning issiqlik taʼsirida parchalanishining oldi olinadi. VialTweeter va VialPress bilan namunalarni ultratovush yordamida tayyorlash yuqori darajada ishonchli va takrorlanuvchan natijalar beradi!
Lizis jarayoningiz uchun eng maqbul ultratovushli parchalagichni toping
Hielscher Ultrasonics laboratoriyalar, laboratoriya stoliga oʻrnatiladigan va sanoat miqyosidagi tizimlar uchun yuqori unumdor ultratovushli hujayra parchalagichlari va gomogenizatorlarni ishlab chiqarishda koʻp yillik tajribaga ega. Bakterial hujayra kulturangiz miqyosi, tadqiqot yoki ishlab chiqarish maqsadingiz hamda soatiga yoki kuniga ishlov beriladigan hujayralar hajmi qoʻllanishingiz uchun toʻgʻri ultratovushli hujayra parchalagichini topishda muhim omillardir.
Hielscher Ultrasonics bir nechta namunaga (VialTweeter bilan 10 tagacha flakon) va koʻp sonli namunaga (yaʼni UIP400MTP bilan mikrotitr plastinalari / ELISA plastinalari) bir vaqtning oʻzida ultratovush bilan ishlov berish uchun turli yechimlarni, shuningdek, quvvati 50 dan 400 vattgacha boʻlgan klassik zond turidagi laboratoriya ultratovush qurilmalaridan tortib yirik ishlab chiqarishda tijoriy hujayra parchalash va oqsil ekstraksiyasi uchun har bir qurilma quvvati 16 000 vattgacha boʻlgan toʻliq sanoat ultratovush protsessorlarigacha taklif etadi. Barcha Hielscher ultratovush qurilmalari toʻliq yuklama ostida 24/7/365 ishlash uchun ishlab chiqilgan. Mustahkamlik va ishonchlilik ultratovush qurilmalarimizning asosiy xususiyatlaridir.
Barcha raqamli ultratovushli gomogenizatorlar aqlli dasturiy taʼminot, rangli sensorli displey va maʼlumotlarni avtomatik qayd etish tizimi bilan jihozlangan boʻlib, bular ultratovush qurilmasini laboratoriyalar va ishlab chiqarish korxonalarida qulay ish vositasiga aylantiradi.
Biologik namunalaringizdagi qanday hujayralarga, qancha hajmda, qanday tez-tezlikda va qanday maqsadda ishlov berishingiz kerakligini bizga bildiring. Biz jarayoningiz talablariga eng mos ultratovushli hujayra parchalagichini tavsiya qilamiz.
Quyidagi jadval ixcham qoʻlda ushlanadigan gomogenizatorlar va MultiSample Ultrasonicators qurilmalaridan tortib tijoriy qoʻllanishlar uchun sanoat ultratovush protsessorlarigacha boʻlgan ultratovush tizimlarimizning taxminiy ishlov berish quvvati haqida tasavvur beradi:
| Partiya hajmi | Hajmiy oqim tezligi | Tavsiya etiladigan qurilmalar |
|---|---|---|
| 96 uyachali / mikrotitr plastinalari | n.a. | UIP400MTP |
| Har biri 0,5 dan 1,5mL gacha boʻlgan 10 ta flakon | n.a. | UP200St dagi VialTweeter |
| 0,01 dan 250mL gacha | 5 dan 100mL/min gacha | UP50H |
| 0,01 dan 500mL gacha | 10 dan 200mL/min gacha | UP100H |
| 10 dan 2000mL gacha | 20 dan 400mL/min gacha | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 dan 20L gacha | 0,2 dan 4L/min gacha | UIP2000hdT |
| 10 dan 100L gacha | 2 dan 10L/min gacha | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 dan 100L/min gacha | UIP16000 |
| n.a. | yuqoriroq | Quyidagi qurilmalardan tashkil topgan klaster: UIP16000 |
Biz bilan bogʻlaning! / Bizdan soʻrang!
UIP400MTP plastina ultratovush qurilmasi 96 uyachali plastinalarda koʻp sonli namunadagi hujayralarni parchalash uchun
Ultratovush qurilmasi UP200Ht kichik namunalarga ultratovush bilan ishlov berish uchun 2mm oʻlchamli S26d2 mikro uchi bilan
Bufer eritmalarini samarali va ishonchli tayyorlash uchun ultratovushli toʻqima gomogenizatoringizdan qanday foydalanishingiz mumkinligi haqida batafsil oʻqing!
Bilishga arziydigan faktlar
Escherichia Coli bakteriyalari
Escherichia coli spora hosil qilmaydigan, gram-manfiy va toʻgʻri tayoqcha shakli bilan tavsiflanadigan bakteriya turidir. E.coli bakteriyalari atrof-muhitda, oziq-ovqat mahsulotlarida hamda odamlar va hayvonlarning ichaklarida uchraydi. E. coli odatda peritrix xivchinlar yordamida harakatlanadi, biroq harakatsiz turlari ham mavjud. E.coli fakultativ anaerob xemoorganotrof organizmlar deb ataladi, yaʼni ular ham nafas olish, ham fermentatsiya metabolizmiga qodir. E.coli turlarining aksariyati zararsiz boʻlib, organizmda foydali vazifalarni bajaradi, masalan, zararli bakteriya turlarining oʻsishini bostiradi, vitaminlarni sintez qiladi va hokazo.
B turi deb ataladigan Escherichia coli bakteriya hujayralari E.coli shtammlarining maxsus toifasi boʻlib, bakteriofaglarga sezgirlik yoki restriksiya-modifikatsiya tizimlari kabi mexanizmlarni oʻrganish uchun tadqiqotlarda keng qoʻllaniladi. Bundan tashqari, E.coli bakteriyalari biotexnologiya va hayot haqidagi fanlar laboratoriyalarida oqsil ekspressiyasi uchun ishonchli ishchi organizm sifatida qadrlanadi. Masalan, E.coli sanoat miqyosida oqsillar va oligosaxaridlar kabi birikmalarni sintez qilish uchun ishlatiladi. Proteaza yetishmovchiligi, glyukoza miqdori yuqori boʻlganda atsetatning kam hosil boʻlishi va oʻtkazuvchanlikning oshishi kabi oʻziga xos xususiyatlari tufayli E. coli B hujayralari genetik muhandislik orqali yaratilgan oqsillarni ishlab chiqarishda eng koʻp ishlatiladigan xoʻjayin hujayralardir.
Rekombinant oqsil
Rekombinant oqsillar (rProt) koʻplab sohalarda, jumladan kimyoviy ishlab chiqarish, farmatsevtika, kosmetika, inson va hayvonlar tibbiyoti, qishloq xoʻjaligi, oziq-ovqat hamda chiqindilarni qayta ishlash tarmoqlarida katta ahamiyat kasb etmoqda.
Rekombinant oqsil ishlab chiqarish ekspressiya tizimidan foydalanishni talab qiladi. Rekombinant DNK ishlab chiqarish uchun ekspressiya qiluvchi hujayra tizimlari sifatida ham prokariot, ham eukariot hujayralardan foydalanish mumkin. Kam xarajat, miqyosni oson kengaytirish va oziqa muhitiga oddiy talablar kabi omillar tufayli oqsil ekspressiyasi uchun bakterial hujayralar eng keng qoʻllanilsa-da, sutemizuvchi, achitqi, suv oʻti, hasharot va hujayrasiz tizimlar amaliyotda qaror topgan muqobillardir. Oqsil turi, funksional faolligi hamda ekspressiya qilingan oqsilning talab etiladigan chiqimi oqsil ekspressiyasi uchun ishlatiladigan hujayra tizimini tanlashga taʼsir qiladi.
Rekombinant oqsilni ekspressiya qilish uchun muayyan hujayra rekombinant DNK matritsasini oʻz ichiga olgan DNK vektori bilan transfeksiya qilinishi kerak. Keyin matritsa bilan transfeksiya qilingan hujayralar oʻstiriladi. Hujayraviy mexanizm natijasida hujayralar kerakli oqsilni transkripsiya va translyatsiya qilib, shu orqali maqsadli oqsilni ishlab chiqaradi.
Ekspressiya qilingan oqsillar hujayra matritsasida saqlanib qolgani sababli, ularni chiqarish uchun hujayra lizis qilinishi (parchalanishi va buzilishi) kerak. Keyingi tozalash bosqichida oqsil ajratiladi va tozalanadi.
Davolashda ishlatilgan birinchi rekombinant oqsil 1982 yilda rekombinant inson insulini boʻlgan. Bugungi kunda butun dunyoda tibbiy davolash uchun rekombinant oqsilning 170 dan ortiq turi ishlab chiqariladi. Tibbiyotda keng qoʻllaniladigan rekombinant oqsillarga, masalan, rekombinant gormonlar, interferonlar, interleykinlar, oʻsish omillari, oʻsma nekrozi omillari, qon ivish omillari, trombolitik dorilar va diabet, pakanalik, miokard infarkti, dimlanishli yurak yetishmovchiligi, miya apopleksiyasi, tarqoq skleroz, neytropeniya, trombotsitopeniya, anemiya, gepatit, revmatoid artrit, astma, Kron kasalligi kabi jiddiy kasalliklarni davolash hamda saratonni davolash uchun fermentlar kiradi. (qarang: Phuc V. Pham, Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Adabiyotlar / Manbalar
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter ultratovush qurilmasi 10 ta namunaga bir vaqtning oʻzida ultratovush bilan ishlov berish, masalan, BL21 hujayralarini parchalash uchun
Yuqori unumdor ultratovush texnologiyasi! Hielscher mahsulotlari assortimenti ixcham laboratoriya ultratovush qurilmasidan tortib laboratoriya stoliga oʻrnatiladigan qurilmalar va toʻliq sanoat ultratovush tizimlarigacha boʻlgan barcha toifalarni qamrab oladi.