SARS-CoV-2 koronavirusini ultratovush bilan ishlov berish orqali inaktivatsiya qilish protokoli

Hielscher VialTweeter – SARS-COV-2 koronavirusini inaktivatsiya qilish uchun ishlatiladigan, bir nechta namunani tayyorlashga moʻljallangan noyob ultratovushli qurilma. VialTweeter bir vaqtning oʻzida 10 tagacha namuna flakonini tayyorlash imkonini beradi va shu sababli koʻp sonli namunalarga ishlov berish uchun ideal qurilmadir.

VialTweeter yordamida SARS-CoV-2 koronavirusini inaktivatsiya qilish

Fiksator olib tashlangach, hujayralar 1mL MEM/5% FBS muhitiga qirib olinishidan oldin bir qatlamli hujayra kulturasi fosfatli buferlangan fiziologik eritma (PBS) bilan uch marta yuvildi va quvvat hamda amplituda 100% boʻlgan holda (3 × 10 soniya yoqilgan, 10 soniya oʻchirilgan) Hielscher ultratovushli protsessorining VialTweeter bilan jihozlangan UP200St moslamasi yordamida ultratovush bilan ishlov berildi. Supernatantlar 3000 × g da 10 daqiqa sentrifugalash orqali tiniqlashtirildi. Quyida Welch va boshqalar (2020) tomonidan ishlab chiqilgan SARS-CoV-2 koronavirusini inaktivatsiya qilish boʻyicha toʻliq protokolni oʻqing:

Hujayralar va virus

Vero E6 hujayralari (Vero C1008; ATCC CRL-1586) 10% (v/v) homila buzoq zardobi (FCS) qo‘shilgan modifikatsiyalangan Eagle minimal zarur oziqa muhitida (MEM) o‘stirildi. Ishlatilgan virus PHE tomonidan 29/01/2020 kuni Buyuk Britaniyadagi dastlabki bemorlar guruhidan ajratib olingan SARS-CoV-2 ning hCOV-19/England/2/2020 shtammi edi. Ushbu virus 1-passajda olindi va inaktivatsiya tadqiqotlarida 2 yoki 3-passajda ishlatildi.
SARS-CoV-2 inaktivatsiyasi, shuningdek reagent sitotoksikligini yo’qotish uchun ishlatiladigan reagentlar va kimyoviy moddalar uchun Welch va boshqalarning ilmiy hisobotiga qarang. (2020).

Detergentlar yordamida virusni inaktivatsiya qilish – Welch va boshqalar, 2020 tomonidan ishlab chiqilgan SARS-CoV-2 koronavirusini inaktivatsiya qilish protokoli

SARS-CoV-2 inaktivatsiyasi


Tijoriy mahsulotlar uchun virus preparatlariga (toʻqima kulturasi suyuqligi, titrlari 1 × 10⁶ dan 1 × 10⁸ PFU/ml) reagentlar bilan uch takrorda, ishlab chiqaruvchining foydalanish yo‘riqnomasi mavjud bo‘lsa, unda tavsiya etilgan konsentratsiyalar va ta’sir vaqtlarida yoki sinov laboratoriyalari alohida so‘ragan konsentratsiyalar va vaqtlar davomida ishlov berildi. Ishlab chiqaruvchi konsentratsiyalar oralig‘ini ko‘rsatgan hollarda mahsulotning namunaga eng past nisbati (ya’ni sinalayotgan mahsulotning tavsiya etilgan eng past konsentratsiyasi) sinovdan o‘tkazildi. Agar ishlab chiqaruvchi namuna suyuqligi hajmining reagent hajmiga nisbatini belgilamagan bo‘lsa, namunalarni tashish probirkalaridagi reagentlar to‘qima kulturasi suyuqligining bir hajmiga reagentning o‘n hajmi nisbatida sinaldi. Detergentlar, fiksatorlar va erituvchilar ko‘rsatilgan konsentratsiyalarda va ko‘rsatilgan vaqtlar davomida sinaldi. Barcha inaktivatsiya bosqichlari xona haroratida (18 – 25°C) bajarildi. Muqobil namuna turlarini sinash uchun virus ko‘rsatilgan namuna matritsasiga 1:9 nisbatda qo‘shildi, so‘ng yuqorida bayon qilinganidek sinov reagentlari bilan ishlov berildi. Barcha tajribalarga sinov reagenti o‘rniga teng hajmdagi PBS qo‘llanilgan, xuddi shunday ishlov berilgan nazorat namunalari uch takrorda kiritildi. Zarur ta’sir vaqti tugashi bilanoq ishlov berilgan namunaning 1mL hajmi tegishli ravishda tanlangan filtrlash matritsasi yordamida qayta ishlandi. Inaktivatsiyani sinash uchun reagentni olib tashlash kattaroq sentrifugalash kolonkalari formatida Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) yordamida yoki sig‘imi 10mL bo‘lgan bo‘sh Pierce sentrifugalash kolonkalarini (Thermo Fisher) SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR yoki Sephadex LH-20 bilan to‘ldirib, zich joylashgan granulalar/qatron hajmini 4mL ga yetkazish orqali amalga oshirildi. Amicon filtrlari yordamida tozalashda 2 × 500μl namunalar avval bayon qilingan usul bo‘yicha ikkita sentrifugal filtr yordamida tozalandi, so‘ng birlashtirildi. Formaldegidni hamda formaldegid bilan glutaraldegidni olib tashlash uchun 1× 500μl hajmdagi namuna bilan bitta filtr ishlatildi; ishlov berilgandan so‘ng namuna 500μl PBS da qayta suspenziyalandi va 400ul MEM/5% FBS ga qo‘shildi. Inaktivatsiya qilish uchun infeksiyalangan monolayers, 12,5 cm² flasks of Vero E6 cells (2,5 × 10⁶ cells/flask in 2,5mL MEM/5% FBS) were infected at MOI 0,001 and incubated at 37°C/5% CO₂ 24 soat davomida. Supernatant olib tashlandi va hujayralar xona haroratida 15 yoki 60 daqiqa davomida 5mL formaldegid yoki formaldegid va glutaraldegid yordamida fiksatsiya qilindi. Fiksator olib tashlandi va hujayralarni qirib 1mL MEM/5% FBS ga yig‘ishdan oldin bir qatlamli hujayra kulturalari PBS bilan uch marta yuvildi, so‘ng VialTweeter moslamasi o‘rnatilgan UP200St (Hielscher Ultrasound Technology) yordamida ultratovush bilan ishlov berildi (100% quvvat va amplitudada 3 × 10 soniya ishlash, 10 soniya tanaffus). Supernatantlar 3000 × g da 10 daqiqa sentrifugalash orqali tiniqlashtirildi.


Welch va boshqalar, 2020 protokoliga muvofiq ultratovushli VialTweeter yordamida SARS-CoV-2 koronavirusini inaktivatsiya qilish uchun ishlatilgan reagent haqidagi tafsilotlar

Hielscher VialTweeter qurilmasidan foydalanishni ham oʻz ichiga olgan toʻliq protokolni bu yerda topish mumkin:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Ilgʻor ultratovushli parchalagichlar va hujayralarni parchalash qurilmalari

Bir nechta namunaga ishlov beradigan VialTweeter ultratovushli qurilmasi biologik, biokimyoviy va klinik laboratoriyalarda namunalarni tayyorlash uchun moʻljallangan koʻplab ultratovushli yechimlardan biridir. Hielscher Ultrasonics sizning vazifangiz uchun, masalan, hujayra lizisi, hujayralardan ekstraksiya qilish, toʻqimalarni gomogenizatsiya qilish, lizatni solyubilizatsiya qilish, eritish, namunalarni gazsizlantirish va boshqa maqsadlar uchun ideal ultratovushli parchalagichni taklif etadi.
Bir soatda va bir kunda nechta namunaga ishlov berishingiz kerakligini, bevosita yoki bilvosita ultratovush bilan ishlov berishni afzal koʻrishingizni hamda namunaga ultratovush bilan ishlov berishdan maqsadingizni bizga bildiring. Kundalik ishingiz uchun eng mos ultratovushli qurilmani tavsiya qilamiz!
Hielscher Ultrasonics raqamli ultratovushli protsessorlari aqlli dasturiy taʼminot, maʼlumotlarni avtomatik qayd etish, haroratni boshqarish, ultratovush bilan ishlov berish davomiyligi va sikl/impuls rejimini oson oldindan sozlash imkoniyatlari, shuningdek, namunani yoritish va brauzer orqali masofadan boshqarish bilan jihozlangan. Tadqiqotlaringiz va kundalik ishingiz imkon qadar qulay va muvaffaqiyatli boʻlishi uchun ultratovushli qurilmalarimizni imkon qadar aqlli qilishga intilamiz.
VialTweeter yordamida namunalarni ultratovush bilan tayyorlash protokollarini ham oʻz ichiga olgan boshqa qoʻllanish sohalarini topish uchun bu yerni bosing!