Sanoat ishlab chiqarishida bioinjeneriya orqali yaratilgan hujayralarning ultratovushli lizisi

E. coli kabi bioinjeneriya orqali yaratilgan bakteriya turlari, shuningdek, genetik modifikatsiyalangan sutemizuvchi va oʻsimlik hujayra turlari biotexnologiyada molekulalarni ekspressiya qilish uchun keng qoʻllaniladi. Sintezlangan ushbu biomolekulalarni ajratib chiqarish uchun hujayralarni parchalashning ishonchli usuli zarur. Yuqori unumli ultratovush bilan ishlov berish hujayralarning samarali va ishonchli lizisi uchun sinalgan usul boʻlib, uni katta ishlov berish hajmlariga oson moslashtirish mumkin. Hielscher Ultrasonics katta hajmlarda yuqori sifatli biomolekulalar ishlab chiqarish maqsadida hujayralarning samarali lizisi uchun yuqori unumli ultratovush uskunalarini taklif etadi.

Hujayra fabrikalaridan molekulalarni ekstraksiya qilish

Keng turdagi biomolekulalarni ishlab chiqarish uchun turli muhandislik yoʻli bilan oʻzgartirilgan mikroblar va oʻsimlik hujayralaridan mikrob hujayra fabrikalari sifatida foydalanish mumkin. Ular qatoriga Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana, suvoʻtlar va boshqa koʻplab organizmlar kiradi. Ushbu hujayra fabrikalari oziq-ovqat sifatida yoki sanoatdagi qoʻllanishlar uchun xomashyo sifatida ishlatiladigan oqsillar, lipidlar, biokimyoviy moddalar, polimerlar, bioyoqilgʻilar va yogʻ-kimyo mahsulotlarini ishlab chiqarishi mumkin. Hujayra fabrikalari sifatida ishlatiladigan hujayralar yopiq bioreaktorlarda oʻstiriladi; u yerda ular yuqori samaradorlik, oʻziga xoslik va kam energiya talabiga erishishi mumkin.
Bioinjeneriya orqali yaratilgan hujayra kulturalaridan maqsadli molekulalarni ajratib olish uchun hujayra ichidagi material ajralib chiqadigan tarzda hujayralarni parchalash kerak. Ultratovushli hujayra parchalagichlar hujayralarni parchalash va birikmalarni ajratib chiqarishning juda ishonchli va samarali usuli sifatida keng eʼtirof etilgan.

Mikrob hujayra fabrikalari turli qimmatli birikmalarni sintez qilish uchun ishlatiladigan, metabolik muhandislik yoʻli bilan oʻzgartirilgan hujayralardir. Hujayralarni ultratovush bilan parchalash hujayra ichidan qimmatli birikmalarni ajratib chiqarishning samarali va ishonchli usulidir.
tadqiqot va grafik: ©Villaverde, 2010.

Ultratovushli hujayra parchalagichlarning afzalliklari

Ultratovushli parchalagichlar issiqliksiz, yumshoq, shu bilan birga juda samarali texnologiya sifatida laboratoriya va sanoatda hujayralarni lizis qilish hamda yuqori sifatli ekstraktlar olish uchun, masalan, hujayra fabrikalaridan molekulalarni ajratib olishda qoʻllaniladi.

Mikrob hujayra fabrikalarini samarali parchalash uchun kuchli ultratovush

Ultratovushli hujayra parchalagichlarning ishlash mexanizmi va taʼsirlari:
Hujayralarni ultratovush bilan parchalash ultratovush toʻlqinlarining quvvatidan foydalanadi. Ultratovushli gomogenizator / hujayra parchalagich taxminan 20 kHz yuqori chastotada tebranadigan titan qotishmasidan tayyorlangan zond (sonotrod deb ham ataladi) bilan jihozlangan. Bu ultratovush zondi ultratovush bilan ishlov berilayotgan suyuqlikka soniyasiga 20 000 ta tebranish uzatishini anglatadi. Suyuqlikka uzatiladigan ultratovush toʻlqinlari navbatma-navbat almashinadigan yuqori bosim / past bosim sikllari bilan tavsiflanadi. Past bosim sikli davomida suyuqlik kengayadi va juda mayda vakuum pufakchalari paydo boʻladi. Ushbu juda kichik pufakchalar bir necha almashinuvchi bosim sikli davomida boshqa energiya yuta olmaydigan holatga kelguncha oʻsadi. Shu nuqtada kavitatsiya pufakchalari shiddat bilan ichkariga qulaydi va mahalliy ravishda energiya zichligi favqulodda yuqori boʻlgan muhitni hosil qiladi. Ushbu hodisa akustik kavitatsiya deb ataladi va mahalliy juda yuqori haroratlar, juda yuqori bosimlar hamda siljish kuchlari bilan tavsiflanadi. Ushbu siljish kuchlanishlari hujayra devorlarini samarali parchalaydi va hujayra ichi bilan uni oʻrab turgan erituvchi oʻrtasidagi massa almashinuvini oshiradi. Sof mexanik usul sifatida ultratovush hosil qiladigan siljish kuchlari keng qoʻllaniladi va bakteriya hujayralarini parchalash, shuningdek, oqsillarni ajratib olish uchun tavsiya etiladigan usul hisoblanadi. Hujayralarni parchalashning oddiy va tezkor usuli sifatida ultratovush bilan ishlov berish kichik, oʻrta va katta hajmlarda ajratib olish uchun idealdir. Hielscher raqamli ultratovush qurilmalari ultratovush bilan ishlov berishni aniq nazorat qilish uchun tushunarli sozlamalar menyusi bilan jihozlangan. Ultratovush bilan ishlov berishga oid barcha maʼlumotlar oʻrnatilgan SD-kartada avtomatik saqlanadi va ulardan oson foydalanish mumkin. Ultratovush bilan parchalash jarayonida tashqi sovitish, impuls rejimida ultratovush bilan ishlov berish va boshqalar kabi issiqlikni chiqarishning ilgʻor imkoniyatlari jarayonning ideal haroratini saqlashni va shu orqali ekstraksiya qilingan issiqlikka sezgir birikmalarning butunligini taʼminlaydi.

Tadqiqotlar hujayralarni ultratovush bilan parchalash va ekstraksiyaning kuchli tomonlarini tasdiqlaydi

Prof. Chemat va boshqalar (2017) oʻz tadqiqotlarida quyidagicha xulosa qiladilar: “Ultratovush yordamida ekstraksiya qilish oziq-ovqat va tabiiy mahsulotlar uchun anʼanaviy usullarga ekologik va iqtisodiy jihatdan maqsadga muvofiq muqobildir. Asosiy afzalliklar ekstraksiya va ishlov berish vaqtining, sarflanadigan energiya va erituvchilar miqdorining, birlik operatsiyalar sonining hamda CO₂ chiqindilarining kamayishidir.”
Gabig-Ciminska va boshqalar (2014) DNKni ajratib chiqarish uchun sporalarni lizis qilish boʻyicha oʻz tadqiqotlarida yuqori bosimli gomogenizator va ultratovushli hujayra parchalagichdan foydalanganlar. Hujayralarni parchalashning ikkala usulini taqqoslagan tadqiqot guruhi spora DNKsini olish uchun hujayra lizisi haqida quyidagicha xulosa qiladi: “Tahlil yuqori bosimli gomogenizatsiya natijasida olingan hujayra lizatlari yordamida oʻtkazildi. Keyinchalik hujayralarni ultratovush bilan parchalash ushbu maqsad uchun juda katta afzalliklarga ega ekanligini angladik. Bu ancha tezkor usul va kichik namuna hajmlariga ishlov berishda qoʻllanishi mumkin.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Oziq-ovqat ishlab chiqarish uchun hujayra fabrikalaridan olinadigan biomolekulalar

Mikrob hujayra fabrikalari bakteriyalar, achitqilar, zamburugʻlar va boshqa mikroorganizmlarning metabolik bioinjeneriyasi orqali ularga xos va xos boʻlmagan metabolitlarni yuqori hosildorlikda ishlab chiqarish uchun mikrob organizmlaridan foydalanadigan amaliy jihatdan maqbul va samarali ishlab chiqarish usulidir. Masalan, katta hajmlarda ishlab chiqariladigan fermentlar Aspergillus oryzae, zamburugʻlar va bakteriyalar kabi mikroorganizmlar yordamida olinadi. Ushbu fermentlar oziq-ovqat va ichimliklar ishlab chiqarishda, shuningdek, qishloq xoʻjaligi, bioenergetika va uy-roʻzgʻor parvarishida qoʻllaniladi.
Acetobacter xylinum va Gluconacetobacter xylinus kabi ayrim bakteriyalar fermentatsiya jarayonida sellyuloza ishlab chiqaradi; bunda nanotolalar quyi darajadagi tarkibiy qismlardan yuqori darajadagi tuzilmani hosil qilish jarayonida sintezlanadi. Bakterial sellyuloza (mikrob sellyulozasi deb ham ataladi) kimyoviy jihatdan oʻsimlik sellyulozasiga teng, biroq u yuqori kristallik darajasi va yuqori tozalikka (lignin, gemisellyuloza, pektin va boshqa biogen tarkibiy qismlardan xoli) hamda sellyuloza nanotolalaridan toʻqilgan uch oʻlchamli (3D) toʻrsimon tarmoqning noyob tuzilishiga ega. (cf. Zhong, 2020) Oʻsimliklardan olinadigan sellyulozaga nisbatan bakterial sellyuloza ekologik jihatdan barqarorroq boʻlib, ishlab chiqariladigan sellyuloza toza va murakkab tozalash bosqichlarini talab qilmaydi. Ultratovush bilan ishlov berish va NaOH yoki SDS (natriy dodesilsulfat) yordamida erituvchi bilan ekstraksiya qilish bakteriya hujayralaridan bakterial sellyulozani ajratib olish uchun juda samaralidir.

Farmatsevtika mahsulotlari va vaksinalar ishlab chiqarish uchun hujayra fabrikalaridan olinadigan biomolekulalar

Hujayra fabrikalaridan olinadigan eng muhim farmatsevtika mahsulotlaridan biri inson insulinidir. Bioinjeneriya orqali insulin ishlab chiqarishda asosan E. coli va Saccharomyces cerevisiae qoʻllaniladi. Biosintezlangan nanooʻlchamli molekulalar yuqori biologik moslikni taʼminlagani sababli ferritin kabi biologik nanozarrachalar koʻplab biologik ishlab chiqarish qoʻllanishlari uchun afzalliklarga ega. Bundan tashqari, metabolik muhandislik yoʻli bilan oʻzgartirilgan mikroblarda ishlab chiqarish koʻpincha olinadigan mahsulot hosildorligi jihatidan sezilarli darajada samaraliroq boʻladi. Masalan, artemizin kislotasi, resveratrol va likopin ishlab chiqarish oʻn baravardan bir necha yuz baravargacha oshgan va sanoat miqyosidagi ishlab chiqarish allaqachon yoʻlga qoʻyilgan yoki shu miqyosga olib chiqish uchun ishlab chiqilmoqda. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Masalan, ferritin va virusga oʻxshash zarrachalar kabi oʻz-oʻzidan yigʻilish xususiyatiga ega oqsil asosidagi nanooʻlchamli biomolekulalar vaksina ishlab chiqish uchun ayniqsa qiziqarlidir, chunki ular patogenlarning ham oʻlchamini, ham tuzilishini taqlid qiladi va immun hujayralari bilan oʻzaro taʼsirni kuchaytirish uchun ularning yuzasiga antigenlarni biriktirish mumkin. Bunday molekulalar muayyan maqsadli molekulani ishlab chiqaradigan hujayra fabrikalari deb ataluvchi tizimlarda (masalan, muhandislik yoʻli bilan oʻzgartirilgan E. coli shtammlarida) ekspressiya qilinadi.

Ferritinni ajratib chiqarish uchun E. coli BL21 ning ultratovushli lizisi protokoli

Ferritin asosiy vazifasi temirni saqlash boʻlgan oqsildir. Ferritin vaksinalarda oʻz-oʻzidan yigʻiluvchi nanozarrachalar sifatida istiqbolli imkoniyatlarni namoyon etadi; bunda u vaksina tarkibiy qismlarini yetkazib beruvchi vosita sifatida ishlatiladi (masalan, SARS-Cov-2 tikansimon oqsillari). Sun va boshqalarning (2016) ilmiy tadqiqoti rekombinant ferritinni NaCl ning past konsentratsiyalarida (≤50 mmol/L) Escherichia coli dan eruvchan shaklda ajratib chiqarish mumkinligini koʻrsatadi. E. coli BL21 da ferritinni ekspressiya qilish va uni ajratib chiqarish uchun quyidagi protokol muvaffaqiyatli qoʻllanilgan. Rekombinant pET-28a/ferritin plazmidi E coli BL21 (DE3) shtammiga transformatsiya orqali kiritilgan. Ferritinli E coli BL21 (DE3) hujayralari 0,5% kanamitsinli LB oʻstirish muhitida 37°C da oʻstirilgan va OD600 0,6 ga yetganda 0,4% izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid bilan 37°C da 3 soat davomida induksiya qilingan. Soʻng yakuniy kultura 4°C da 10 daqiqa davomida 8000g da sentrifugalash orqali yigʻib olingan va choʻkma toʻplangan. Keyin choʻkma mos ravishda LB muhiti (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% achitqi ekstrakti)/lizis buferi (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) va NaCl eritmasining turli konsentratsiyalarida (0, 50, 100, 170 va 300 mmol/L) qayta suspenziyalangan. Bakteriya hujayralarini lizis qilish uchun impuls rejimida ultratovush bilan ishlov berilgan: masalan, UP400St ultratovush qurilmasi yordamida 100% amplitudada, 5 soniya YOQILGAN, 10 soniya OʻCHIRILGAN ish sikli bilan 40 sikl davomida) va keyin 4°C da 15 daqiqa davomida 10 000g da sentrifugalangan. Choʻkma ustidagi suyuqlik va choʻkma natriy dodesilsulfatli poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) yordamida tahlil qilingan. Natriy dodesilsulfat bilan boʻyalgan barcha gellar yuqori aniqlikdagi skaner yordamida skanerlangan. Gel tasvirlari Magic Chemi 1D dasturi yordamida tahlil qilingan. Eng yaxshi ravshanlik uchun oqsil tasmalari parametrlarni sozlash orqali aniqlangan. Tasmalar boʻyicha maʼlumotlar uchta texnik takror asosida olingan. (cf. Sun et al., 2016)

Hujayra fabrikalarining sanoat lizisi uchun ultratovushli hujayra parchalagichlar

Ultratovushli lizis va ekstraksiya hujayra fabrikalaridan metabolitlarni ajratib chiqarishning ishonchli va qulay usuli boʻlib, shu orqali maqsadli molekulalarni samarali ishlab chiqarishga yordam beradi. Ultratovushli hujayra parchalagichlar laboratoriyadan sanoat oʻlchamigacha mavjud va jarayonlarni toʻliq chiziqli ravishda kengaytirish mumkin.
Hielscher Ultrasonics yuqori unumli ultratovushli parchalagichlar boʻyicha malakali hamkoringiz boʻlib, stol usti va sanoat sharoitlarida ultratovush tizimlarini oʻrnatish sohasida koʻp yillik tajribaga ega.
Ilgʻor apparat va dasturiy taʼminot nuqtayi nazaridan Hielscher Ultrasonics hujayralarni parchalash tizimlari jarayonni optimal nazorat qilish, oson ishlatish va foydalanish qulayligiga qoʻyiladigan barcha talablarni qondiradi. Hielscher ultratovush qurilmalarining mijozlari va foydalanuvchilari Hielscher ultratovushli hujayra parchalagichlari va ekstraktorlarining jarayonni raqamli sensorli displey va brauzer orqali masofadan boshqarish yordamida aniq kuzatish va nazorat qilish imkoniyatini qadrlaydilar. Ultratovush bilan ishlov berishga oid barcha muhim maʼlumotlar (masalan, sof energiya, umumiy energiya, amplituda, davomiylik, harorat, bosim) oʻrnatilgan SD-kartaga CSV fayli sifatida avtomatik saqlanadi. Bu qayta hosil qilinadigan va takrorlanuvchan natijalarni olishga yordam beradi hamda jarayonni standartlashtirishni, shuningdek, Yaxshi ishlab chiqarish amaliyotlari (cGMP) talablarini bajarishni osonlashtiradi.
Albatta, Hielscher ultratovush protsessorlari toʻliq yuklama ostida 24/7 ishlash uchun yaratilgan va shu sababli sanoat ishlab chiqarish sharoitlarida ishonchli ishlatilishi mumkin. Yuqori mustahkamlik va kam texnik xizmat talabi tufayli ultratovush uskunalarining ishlamay turish vaqti juda kam. CIP (joyida tozalash) va SIP (joyida sterilizatsiya qilish) imkoniyatlari mehnat talab qiladigan tozalash ishlarini kamaytiradi, ayniqsa, suyuqlik bilan aloqadagi barcha qismlar silliq metall yuzalardan iborat boʻlgani uchun (yashirin teshiklar yoki soplolar yoʻq).

Quyidagi jadval ultratovush qurilmalarimizning taxminiy ishlov berish quvvati haqida tasavvur beradi: