Hielscher ultratovush texnologiyasi

To'qima, hujayra madaniyati ultratovush Protein ekstraksiya

  • Proteomlarni ajratib olish proteomiklarda muhim namuna tayyorlash bosqichidir.
  • Proteinlarni o'simlik va hayvon to'qimasidan, maya va mikroorganizmlardan ajratish mumkin.
  • Sonikasyon, qisqa vaqt ichida yuqori oqsil rentabellikga ega bo'lgan ishonchli, samarali oqsil chiqarish usuli hisoblanadi.

 

To'qimalar va hujayralardan oqsil olish

To'qimalar va madaniy xujayralardan oqilona ajratish Elishay, PAGE kabi ko'plab biokimyoviy va analitik metodlarda qo'llaniladigan muhim namuna tayyorlash bosqichidir. G'arbda blotting, massa spektrometri yoki oqsillarni tozalash. Ultrasonik hujayra buzilishi, liziz va ekstraktsiya yuqori oqsilli oqsillarni ta'minlash uchun aniq nazorat qilinadigan usul.

Hayvon to'qimasidan oqsil olish

To'liq to'qimalarni tayyorlash uchun (masalan, buyrak, yurak, o'pka, mushak va boshqalar) to'qimalarni juda oz bo'laklarga toza vositalar, muzda afzalroq va eng qisqa vaqt ichida proteazlarning degradatsiyasini oldini olish uchun ajratish kerak (masalan, RIPA kabi liziz bufferi yoki proteaz va fosfataz inhibitör kokteyli o'z ichiga olgan hipotonik lizis tamponu). Dissizatsiyadan so'ng, namunalar tezroq muzlatish uchun suyuq azotga botiriladi. Namuna keyinroq foydalanish uchun -80 ° C da saqlanishi mumkin yoki darhol homogenlash uchun muzga tushishi mumkin. Ultrasonik ekstraksiyondan oldin, namlik tüpüne tezlik bilan ilova qilingan (muzqaymoq soğutucu tamponu (proteaz inhibitörleri DTT, leupeptin va aprotinin bilan) (~ 10 mg to'qimalarining taxminan 600 mL tampon tavsiya qilinadi). Taxminan. Namuna naychasidan 20-60 mg to'qimalar tavsiya etiladi.
Ultrasonik homojenizasyon, liziz va ekstraksiyon, ultrasonik homojenleştirici bilan amalga oshiriladi Uf200 ः t yoki UP200St, mikro tipli sonotrode bilan jihozlangan. Sonikatsiya davomiyligi 60-90 sekund. ultrasonik tsikli rejimida 15 sekund. sonikatsiya va 10 sek. dam olish vaqti. Namuna har doim muzda saqlanishi kerak.
Ultrasonik homogenlash / ekstraksiyadan so'ng, lizat taxminan 27,000 g ga santrifüjlanadi. 20 min. Keyinchalik supernatant yig'iladi, shuning uchun protein konsentratsiyasi Pirs protein tekshiruvi BCA kabi bir protein tekshiruvi bilan aniqlanishi mumkin.

Protein sonikatsiyasi namuna tayyorlashning muhim usulidir

Hujayralardan ultratovushli protein olish UP200St

Ma'lumot so'rovini




Bizning e'tibor bering Maxfiylik siyosati.


Qon zardobidan oqsil olish

Sarumning bir hil aralashmasi va fosfat tamponu uchun, namunadir ultratovush hujayrasi lizislashidan oldin birinchi bo'lib vortekslanadi. Ultrasonik liziz uchun namuna ultrasonik laboratoriya homogenizatori bilan soniklanadi UP100H har bir 5 sekundlik va 15 sekundlik o'chirish uchun 20% amplituda 8 tsikli uchun. Sonocation sonicationg tomonidan sikllarda o'tkaziladi va namunani muzga joylashtirish orqali namunaning ortiqcha qizib ketishi va termal tanazzulga uchrashiga yo'l qo'yilmaydi. IEFda kam molekulyar oqsillarni ajratishga aralashadigan katta miqdorda yuqori molekulyar oqsillar (masalan, albumin, a-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunglobulin G va immunoglobulin A) mavjud bo'lganligi sababli ularni sarflash tavsiya etiladi saratondan sarg'ayish kolonasidan foydalaniladi.

O'simlik to'qimasidan olingan oqsil

Yangi, yumshoq o'simlik to'qimasini, masalan, mox va hokazo, osonlik bilan chopishdagi namunani materialni sonizlash uchun liziz tamponiga joylashtirish yo'li bilan osonlikcha buzish mumkin. Zaharli o'simliklar o'simlik to'qimalari, masalan, urug'lar, shpil ignalari va boshqalar quruq bo'lishi kerak. Ba'zi qattiq, yog'ochli o'simlik materiallari muzlatilib, suyuq azotda ultrafiltratsiyadan oldin chiqarilishi kerak. O'simlik hujayrasi madaniyati suspenziyalari uchun lizis tamponida 30 dan 150 soniyagacha ultrasonik davolash ko'pincha etarli. Qovoq urug'i kabi qattiq materiallar quyida ta'riflanganidek, yanada qizg'in sonikatsiyani talab qiladi.

Albomni qovoq urug'idan ultratovush chiqarish uchun protokol

Ultrasonik to'qimalarining homogenizatori UP400S S24d40 bilan - o'simlik va hayvon to'qimasidan oqsillarni ajratish uchun (kengaytirish uchun bosing!)Albomni ultratovush oqimi uchun yaxshi erga qovoq tohum kukunidan, 10 g yog'sizlangan qovoq tohum kukuni va 100 ml liyolli suvni 250 ml lik shisha idishda qo'shing. Protein ekstrakti ikki bosqichdan iborat: Birinchidan, namuna prob probi ultrasonikator bilan soniklanadi UP400St (400V, 24kHz) ulangan sonotrode S24d7 bilan jihozlangan. Shisha idishni ultrasonik homogenlash jarayonida sovuq suvli hammaga joylashtiriladi. Ultrasonikatorni sozlash UP400St taqsimlanadigan harorat sensori bilan namuna harorati har doim 30 ° C atrofida ostida bo'lishini ta'minladi. Sonication paytida aniq harorat nazorati bilan albominning denatürasyonundan saqlanish. Ikkinchidan, ekstraksiya 200 rpm tezligida va 30 ° C da mikser bilan amalga oshirildi. Keyinchalik stakan termostatik shakarga aylanadi. Globulin distillangan suv bilan diyaliz orqali chiqariladi. Globulinni olib tashlagach, oqsillar ekstrakti albumin profilini aniqlash uchun namuna olinishi mumkin va undan keyin albumin koagulyatsiyasi uchun 0,1 M HCl yordamida pI = 3,0 ga o'rnatiladi. Qattiq faz 5000 g, 20 ° C da santrifüj bilan ajratiladi va deionlangan suvda qayta ishlanadi. Albomin pıhtılaşması, albumin konsantresinde protein darajasi oshirish uchun ikki marta amalga oshiriladi.

Guruch kubigidan oqsil konsentrati tayyorlash uchun ultratovushli gidroksidi protein ekstrakti ultratovushli davolash ancha yuqori qisqartirish muddatida yuqori protein hosil bo'lishiga olib keladi – an'anaviy ekstraksiyon usullari bilan solishtirganda.

Ultrasonik qurilma VialTweeter to'qimalar namunasidan oqsillarni ajratish uchun (kengaytirish uchun bosing!)

VialTweeter bilvosita Sonikasyon.

afzalliklari

  • tez
  • yuqori hosil
  • yuqori samarali
  • Parametrlarni aniq nazorat qilish
  • tekrarlanabilir natijalar
  • chiziqli kengayuvchanlik

Funktsional iNOS fermenti uchun namuna tayyorlash protokoli

To'liq ishlab iNOS fermentini olish uchun (masalan, dori tekshiruvi uchun) quyidagi protokol tavsiya etiladi: Hujayra suspenziyasi muzga joylashtiriladi va UP100H 10 sekundlik amplitudada 5 sekund rejimida. sonikatsiya va 25 sek. muz ustida dam olish. Jarayonni taxminan takroran qaytarish kerak. 3 marta. Sonication tsikllari orasidagi dam olish vaqti harorat ko'tarilishini pasaytiradi va shuning uchun denatürasyon xavfini kamaytiradi.

Ultrasonik Proteinni Chiqarish

Sonikasyon, odatda, bir necha soat talab qiladigan protein çözündürme jarayonini tezlashtirishi mumkin. Namunani haddan tashqari qizdirmaslik va karbamid o'z ichiga olgan probirkaga protein degradatsiyasi va modifikatsiyasini oldini olish uchun, ultrasonik portlashlar bir necha sekunddan ortiq davom etmasligi kerak.

Umumiy ko'rsatmalar

Harorat nazorat qilish: Termal denatürasyonsuz yuqori oqsil rentabellikga erishish uchun ekstraksiyon paytida harorat nazorat qilinishi kerak. Hielscherning zamonaviy ultratovushli homogenizatorlar – shuningdek, ultratovush disintegrator yoki ultimaters deb ataladi – aniq nazorat qilinadi. Ular ekvivalent harorat sensori bilan birga keladi. Ultrasonik homojenizatorni sozlash variantlarida maksimal harorat sozlanishi. Ushbu haroratga maksimal erishilganda, ultrasonikator namunadir sovib ketguncha avtomatik tarzda to'xtaydi.
bufer: Tegishli buferning tanlovi va buferning to'g'ri hajmlari to'qimadan to'qimaga o'zgarib turadi va sinov-va-xato sinovlari yordamida aniqlanishi kerak.
Izolyatsiya / tozalash: Proteinli lizatlar DNK yoki uglevodlar kabi ko'p miqdorda biomolekulyar moddalarni o'z ichiga olishi mumkin, bular oqsillar yog'inlari (deoksikolat-trichloroacetic acid) yoki bufer almashinuvi bilan olib tashlanishi mumkin.

Chittapalo va Noomhorm (2009), ultrasonik to'qimalarni homogenlash va lizizlash jarayoni mavjud ekstraktsiya jarayonlarini sezilarli darajada oshirishi mumkinligini aytdi. – yangi tijorat maqsadlarida qazib olish imkoniyatlarini yaratishga imkon beradi.

Hielscher ning ovoz panjaralari SPB-L va ultratovush qurilma UP200St bilan himoya ovoz. (Kattalashtirish uchun bosing!)

Ultratovush to'qimalarining Homojenleştirici UP200St samarali oqsillarni ajratish uchun

Ultrasonik davolanishni aniq nazorat qilish (kattalashtirish uchun shu yerni bosing!)

Sonication jarayonining aniq ishlashi va monitoringi uchun brauzer boshqaruvi

Protein ekstrakti uchun ultrasonik uskunalar

Hielscher ultratovush tekshiruvi hujayralar, to'qimalar, bakteriyalar, mikroorganizmlar, xamirturushlar va sporlar tarqalishi uchun ultratovushli homogenizatorlarning keng spektrini taklif etadi.
Hielscher laboratoriya ultratovush qurilmalari kuchli va qulay ishlaydi. 24/7 operatsiya uchun qurilgan bo'lib, ular mustahkam va samarali laboratoriya va dastgoh usti qurilma sifatida yaratilgan. Barcha qurilmalar uchun energiya chiqishi va amplituda aniq nazorat qilinishi mumkin. Keng doiradagi Aksessuarlar qo'shimcha sozlash variantlarini ochadi. Raqamli qurilmalar kabi VialTweeter, Uf200 ः t, UP200Stva UP400St avtomatik ravishda ma'lumotlarni saqlash uchun o'rnatilgan haroratni boshqarish va o'rnatilgan SD-kartaga ega.
Bir nechta misollarni bevosita, kontaminatsiyasiz va bir vaqtning o'zida ultratovushlantirish uchun biz taklif qilamiz VialTweeter yoki ultratovush cuphorn.
Arizangizga, materialingizga va namunaviy hajmiga qarab, biz sizga namunaviy tayyorgarlik uchun sizga eng qulay moslama taklif qilamiz. Bugun biz bilan bog'laning!

Biz bilan bog'lanish! Bizdan so'rang!

Ultrasonik homojenizasyon haqida qo'shimcha ma'lumot talab qilish bo'lsangiz, iltimos, quyidagi shaklni foydalaning. Sizga talablarga javob beradigan ultratovushli tizimni taklif qilishdan mamnun bo'lamiz.









Iltimos, bizning e'tibor bering Maxfiylik siyosati.


Adabiyotlar / manbalar

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Moylangan guruch kepasidan oqsillarni ultratovushli gidroksidi ekstrakti va protein konsentratlarining xususiyatlari. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simo's, Andre EI :; Pereira, Diane M .; Amaral, Joana D .; Nunes, Ana F .; Gomes, Sofiya E .; Rodriges, Pedro M .; Lo, Adrian C .; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J .; Thibodeau, Stephen N .; Borralxo Pedro M .; Rodrigues, Cecilia MP (2013): trizol yoki trizol LS RNK ekstraktsiyasidan va uzoq muddatli saqlashdan so'ng bir nechta manba namunalaridan oqsillarni samarali qayta tiklash. BMC Genomics 2013, 14: 181.


Bilishingiz kerak bo'lgan dalillar

Proteomika

Proteomiklar oqsillarni va proteomni tadqiq qiluvchi tadqiqot sohasi. Proteinlar organizmlar ichida juda muhim vazifalarni bajaradi. Proteom - ma'lum bir vaqtda genom, hujayra, to'qima yoki organizm tomonidan ifodalangan oqsillarni to'plamidir. Proteom vaqt va har xil talablarga, yoki stress yoki hujayra yoki organizmga o'tishi bilan farq qiladi. Keyinchalik ma'lumki, muayyan vaqt ichida, muayyan shartlar ostida, muayyan turdagi hujayra yoki organizmda ma'lum proteynlar majmui. Terim oqsil va genom aralashmasi. Proteomikalar - bu proteomni o'rganishdir.

Protein

Proteinlar makromolekulyar deb ataladigan katta biomolekullardir – bir yoki bir necha uzun zanjirli amino kislotalar qoldiqlaridan tashkil topgan. Proteinlar o'simlik va hayvonlarning barcha organizmlarida mavjud va ular biologik funktsiyalarning aksariyati uchun juda muhimdir. Proteinlar ko'plab biologik ma'lumotlarga ega bo'lganligi sababli ular analitik maqsadlar uchun, masalan proteomik tadqiqotlar uchun olinadi. Proteinlar tomonidan bajariladigan eng muhim funktsiyaga metabolik reaktsiyalar, DNKning replikatsiyasi, ogohlantirishlarga javob berish va molekulalarni bir joydan ikkinchi joyga ko'chirish kiradi. Proteinlar bir-biridan birinchi navbatda ularning genlarining nukleotid ketma-ketligi bilan belgilanadigan amino kislotalar ketma-ketligida farqlanadi va bu odatda uning tarkibini belgilaydigan o'ziga xos uch o'lchovli tuzilishga oqsil hosil bo'lishiga olib keladi. Proteinlar bor – peptidlardan tashqari – oziq-ovqatning asosiy tarkibiy qismlaridan biri hisoblanadi. Shu bois, proteomiklar oziq-ovqat fani jarayonlarini optimallashtirish, oziq-ovqat xavfsizligi va ozuqaviy baholash uchun kuchli vositadir.

Jel elektroforez

Jel elektroforez - DNK, RNK va oqsil kabi makromolekulyarlarni ajratish va tahlil qilishning asosiy usuli va ularning qismlari va ularning zaryadlari asosida. Klinik kimyada DNK va RNK fragmentlarining aralashgan populyatsiyasini uzunligi bo'yicha ajratish uchun zaryadlangan va / yoki kattalikdagi (IEF agaroz, asosan o'lchamsiz) va biokimyoda, molekulyar biologiya va proteomikalarda ajratish uchun DNKning o'lchamini aniqlash uchun ishlatiladi va RNK fragmentlarini yoki oqsillarni zaryad bilan ajratish.

Hujayra madaniyati

Hujayra madaniyati nazorat qilinadigan sharoitda hujayralar etishtiriladigan nazorat qilinadigan o'sishi jarayonidir. Har bir hujayra turi uchun hujayra madaniyati shartlari o'zgaradi. Umuman olganda, hujayra madaniyatining muhiti asosiy oziq moddalar (aminokislotalar, uglevodlar, vitaminlar, minerallar), o'sish omillari, gormonlar va gazlarni etkazib beruvchi substrat yoki vosita bilan mos bo'lgan idishni (masalan, Petr idishidan) iborat (CO2,2) va fiziologik-kimyoviy muhitni (pH buferi, osmotik bosim, harorat) tartibga soladi. Aksariyat hujayralar sirt yoki sun'iy substratga muhtoj, boshqa hujayra madaniyatlari esa madaniy muhitda erkin siltab chiqarilishi mumkin (suspenziya madaniyati, hujayra suspenziyasi).
Hayvon hujayralarining massa massalari virusli vaktsinalar va boshqa biotexnologik mahsulotlardan sanoat mahsulotlarini ishlab chiqarishda qo'llaniladi. Insonning ildiz hujayralari hujayralar sonini kengaytirish va transplantatsiya maqsadlarida hujayralarni turli xil badandagi hujayra turlariga ajratish uchun madaniyatga ega.

To'qimalarining namunalari

Teri atamasi hujayra tarkibidagi hujayralar va organlar o'rtasida tashkiliy darajada bo'lgan hujayrali qidiruv mahsulotni tasvirlaydi. To'qimada, xuddi shu funktsiyani birgalikda bajaradigan bir xil turdagi hujayralar to'planadi. Ko'p to'qimalarni ishlab guruhlash orqali organlarning murakkab tuzilmalari shakllantiriladi.
To'qimachilik biologiyasi, gistologiya / histopatologiya, parazitologiya, biokimyo, immunohistokimyoviy tadqiqotlar, shuningdek, DNKni ishlab chiqish va olish uchun namuna olingan. U hayvon (ajratib: sutemizuvchilar to'qimasi) va o'simlik to'qimasidan ajralib turishi mumkin. Hayvonlarning to'qimalari birlashtiruvchi, mushak, asab va epiteliya to'qimalarining to'rtta asosiy turiga bo'linadi. O'simlik to'qimasi quyidagi uchta to'qimalarga bo'linadi: epidermis, tuproq to'qimasi va qon tomir to'qimasi.
To'qimalarning namunalari hayvon yoki o'simlik qismlaridan, masalan, suyak, mushak, barg va boshqalardan tayyorlanishi mumkin.

Tana suyuqligi

Qon, sarum, plazma, miya omurilik suyuqligi, tupurik va sinovial suyuqlik tana suyuqligi bo'lib, ular diagnostik jihatdan muhim ma'lumotni ta'minlaydi. Shuning uchun, tahlil qilish uchun tana suyuqligi namunalarini murakkab tayyorlash muhim ahamiyatga ega. Birinchi qiyinchilik tana suyuqliklarida mavjud komponentlarning keng dinamik doirasiga bog'liq.

Protein kontsentratsiyasini aniqlash

Bradford assay, Lowry assay va bicinchoninic acid (BCA) assay oqsillarni konsentratsiyasini aniqlash uchun keng tarqalgan tajribalardir. Sigir sarum albumin (BSA), eng ko'p ishlatiladigan protein me'yorlaridan biri hisoblanadi.

Lizish bufferi

Lizot tamponu hujayra moddani yoki to'qimasini (to'qima madaniyati, o'simlik, bakteriyalar, qo'ziqorinlar va boshqalar) muvofiq tanlanishi va hujayralar tarkibida va tuzilish turida bo'lsin. Proteinlar, membranalar va organellarni ekstraktsiyalash uchun liziz buferlarining keng doirasi bir yoki bir necha deterjan bilan formuladan qilingan. Detarjan odatda sinov-va-xato sinovlari yoki tanlangan – agar mavjud bo'lsa – mavjud oqsillarni ajratish protokoli bo'yicha. Detarjan to'qimalar manbai va oqsillar bilan mos bo'lishi kerak. Umumiy holda, ma'lum bir to'qimaga / proteinga ishlaydigan engil detarjen ekstrakti maksimal funktsiyasini saqlab qolish uchun tanlanadi. Bundan tashqari, membranani va organellarni ajratib olishda yumshoq detarjen membranani mustahkam saqlaydi. Lizot tamponlarida tez-tez ishlatiladigan yuvish vositalari ko'pincha nonionik yoki zvitterionikdir, masalan, CHAPS, deoksikolat, Triton X-100, NP40 va Tween 20.
Misol uchun, miya, jigar, ichak, buyrak, taloq va boshqalar kabi to'qimalarni oddiygina RIPA – Biroq, proteaz inhibitörleri va DTT (masalan, jel elektroforez uchun), shu jumladan qilinadi.
Skelet mushak to'qimalari uchun muzlatuvchi tampon (muzli sovuq): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (A / A) gliserol, 1 mM EDTA , 1 mM ditiotreitol proteaz va fosfataz inhibitör kokteyl bilan to'ldiriladi
Umumiy buferlar jadvali va ularning pH oralig'i. Umumiy holda, bu tamponlar odatda 20-50 mm kontsentratsiyalarda ishlatiladi.

Bufer pH oralig'i
Limon kislotasi – NaOH 2,2 – 6,5
Natriy sitrat – Limon kislotasi 3.0 – 6,2
Natriy asetat – asatik kislota 3,6 – 5,6
Cakodlik kislota natriy tuzi – HCl 5.0 – 7,4
Hik – NaOH 5,6 – 6,8
Natriy dihidrogen fosfat – disodyum vodorod fosfat 5,8 – 8,0
Imidazol – HCl 6,2 – 7,8
MOPS – KOH 6,6 – 7,8
Triethanolamin gidroxloridi – NaOH 6,8 – 8,8
tris – HCl 7,0 – 9,0
HES – NaOH 7,2 – 8,2
Tricin – NaOH 7,6 – 8,6
Natriy tetraborat – Borik kislota 7,6 – 9,2
Bikini – NaOH 7,7 – 8,9
Glitsin – NaOH 8,6 – 10.6

Ko'pgina tamponlar harorat bilan pH ga bog'liqligini ko'rsatadi. Bu, ayniqsa, Tris tamponlari uchun to'g'ri keladi. PKa 8,06 dan 25 ° C dan 8,85 ga 0 ° C gacha o'zgaradi.
(pH va pKa buferning pH qiymati: suvli eritmada vodorod ionlarining konsentratsiyasini o'lchaydi, pKa (= kislotani ajratish sobit) - bu o'ziga xos, ammo o'ziga xos o'lchovdir, buning natijasida molekula qanday ta'sir qiladi? pH qiymati.)

TRIzol

TRIzol - guanidinyum tiosiyanat-fenol-xloroform ekstraktsiyasida RNK / DNK / oqsilni olish uchun ishlatiladigan kimyoviy eritma. Ultrasonik yordam TRIzol ekstraktsiyasini qo'llash yuqori DNK, RNK va oqsillarni bir xil namunadan hosil qiladi va shuning uchun boshqa ekstraksiya usullarini oshiradi.