C. Elegans namunalarini ultratovush yordamida tayyorlash
Nematoda chuvalchangi C. elegans biologiyada keng qoʻllaniladigan model organizmdir. Tahlildan oldin namunalarni tayyorlash lizis, oqsil va lipidlarni ekstraksiya qilish hamda RNKni fragmentlashni talab qiladi; bu jarayonlarni ultratovush bilan ishlov berish orqali ishonchli bajarish mumkin. Ultratovushli hujayra parchalagichlar C. elegans namunalarini tez tayyorlash uchun ishonchli, ilgʻor va foydalanish oson boʻlgan qurilmalardir.
C. elegans namunalarini ultratovush yordamida tayyorlash
Caenorhabditis elegans yumaloq chuvalchanglar boʻlib, genomika, rivojlanish biologiyasi va kasalliklarni oʻrganish uchun tadqiqot laboratoriyalarida keng qoʻllaniladi. C. elegans genomidagi koʻplab genlarning odamlarda funksional muqobillari mavjud. Shu sababli bu nematoda chuvalchangi inson kasalliklari uchun nihoyatda foydali modeldir. C. elegans keng qoʻllanilishining boshqa afzalliklari bakteriyalar (masalan, E. coli) saqlovchi plastinkalarda oson va arzon yetishtirilishi, shaffofligi, u bilan ishlash qulayligi, shuningdek, chuvalchanglarni muzlatib, uzoqroq muddat saqlash imkoniyatidir.
Oqsil va lipid tahlili laboratoriyalarda muntazam bajariladigan amaliyotlar boʻlib, namunalarni ultratovush yordamida tayyorlash C. elegans nematodalarini rivojlanishning har bir bosqichida (yaʼni embrionlar, L1–L4 lichinkalari, voyaga yetgan individlar) lizis qilishning qaror topgan usulidir. C. elegans maqsadli oqsillarni ortiqcha ekspressiya qilish uchun oqsil ekspressiyasi tizimi sifatida ham qoʻllanilgani sababli, yuqori oqsil chiqimini taʼminlaydigan ishonchli va takrorlanuvchan lizis hamda oqsil ekstraksiyasi usuli talab etiladi. Hujayralarni ultratovush yordamida parchalash va ekstraksiya qilish tizimlari zond turidagi gomogenizatorlar va koʻp namunali ultratovush qurilmalari shaklida mavjud. Namunalarni qulay tayyorlash hamda har qanday hajm va sondagi namunalar bilan ishlash uchun Hielscher Ultrasonics laboratoriya amaliyotingizga mos ideal ultratovushli hujayra parchalagichni taklif etadi.

- Chuvalchang gomogenatlarini tayyorlash
- Oqsil ekstraksiyasi
- Lipid ekstraksiyasi
- Oqsil miqdorini aniqlash
- Immunopretsipitatsiya
- Vestern blotting
- RNK ekstraksiyasi
- Fermentativ tahlillar
VialTweeter koʻp namunali ultratovush qurilmasi 10 ta probirkani bir vaqtda tayyorlash uchun.
C. Elegansni parchalash va lizis qilish uchun ultratovush protokollari
C. elegansni ultratovush yordamida gomogenizatsiya va lizis qilish, keyin esa oqsil va lipidlarni ekstraksiya qilish turli gomogenizatsiya va lizis buferlari hamda boshqa vositalardan foydalanadigan har xil amaliyotlar orqali bajarilishi mumkin. Barcha lizis protokollariga xos umumiy talab – oqsillar degradatsiyasining oldini olish uchun namunalarni uzluksiz muz ustida saqlashdir. Quyida tarkibida yuqori sifatli oqsil yoki lipidlar boʻlgan C. elegans namunalarini tayyorlash uchun ayrim ishonchli va tezkor ultratovushli lizis hamda ekstraksiya protokollarini taqdim etamiz.
C. elegansni ultratovush yordamida lizis qilishning afzalliklari
- ishonchli
- takrorlanuvchan
- harorat aniq nazorat qilinadi
- jarayonni ishonchli nazorat qilish
- yumshoq usul
- qoʻllash oson
- xavfsiz
C. elegans namunalaridan oqsilni ultratovush yordamida ekstraksiya qilish
C. elegans chuvalchanglarini ultratovush yordamida lizis qilish va ulardan oqsilni ekstraksiya qilish turli protokollar orqali bajarilishi mumkin. Quyida oqsil ekstraksiyasida takrorlanuvchan natijalarga erishish uchun bir nechta ishonchli va tezkor lizis protokollarini taqdim etamiz.
C. elegans chuvalchanglaridan ultratovush bilan ishlov berish orqali sitozolik ekstraktni tez tayyorlash
Quyidagi protokol yordamida C. elegans lizatlarini 30 daqiqadan kam vaqt ichida tayyorlashingiz mumkin.
C. elegansni yigʻish
Kerakli C. elegans chuvalchanglarini fosfat buferli fiziologik eritma (PBS) saqlovchi 1,5ml probirkaga terib oling yoki ularni plastinkadan 1,5ml PBS bilan yuvib tushiring. Choʻkma hosil qilish uchun 2000rpm tezlikda 1min davomida sentrifugalang. Namunalarni doimo muz ustida saqlang.
Soʻng chuvalchanglarni PBS bilan ikki marta yuving.
Keyin chuvalchanglarni ddH bilan ikki marta yuving2O.
Chuvalchanglarni kamida 500ul gomogenizatsiya buferida (HB) qayta suspenziyalang. Endi chuvalchang namunalari ultratovushli lizisga tayyor.
Oqsil ekstrakti sifatini oshirish uchun chuvalchanglarni har birida 5min davomida PBS va steril, oʻta toza suvda (ddH2O) yuvish yoki saxaroza flotatsiyasini bajarish orqali bakterial ifloslanishni kamaytirishni xohlashingiz mumkin. Chuvalchang namunalarini uzluksiz muz ustida saqlang.
C. elegansni ultratovush yordamida lizis qilish protokoli
- Ultratovushli gomogenizator foydalanishga tayyor boʻlishi uchun ultratovush qurilmasini oldindan tayyorlab qoʻying (zond oʻrnatilgan, ultratovush bilan ishlov berish dasturi oldindan sozlangan boʻlishi kerak).
- UP200St yoki UP200Ht yordamida C. elegansni lizis qilish uchun mikrouchlikdan (masalan, 2mm S26d2 zondi; chapdagi rasmga qarang) foydalanib, 40% amplitudada 1sec davomida, oraliqda 30sec tanaffuslar bilan ultratovush ishlovi berilishi kerak. Har biri 1 soniya davom etadigan, orasida 30sec tanaffuslar boʻlgan 5 ta ultratovush ishlovi sikli C. elegans lizisi uchun idealdir. Lizisni birinchi marta bajarayotgan boʻlsangiz, har bir impulsdan keyin namunaning kichik alikvotalarida mikroskop yordamida lizisning borishini tekshirishingiz mumkin.
- Chuvalchanglar parchalanganida lizis muvaffaqiyatli yakunlangan boʻladi. Haddan tashqari ultratovush ishlovi yadrolarning parchalanishiga olib keladi; bu namuna qovushqoq boʻlib qolganida yoki koʻpiklanganida koʻrinadi. Namuna degradatsiyasining oldini olish uchun zarur boʻlsa, koʻproq impuls qoʻllang. Yuqori sifatli oqsil ekstraktlarini olish uchun har bir ultratovush impuls siklining davomiyligini oshirmang.
- Ultratovush yordamida lizis qilingan chuvalchanglarni 14 000rpm tezlikda, 4ºC haroratda 10min davomida sentrifugalab, hujayra lizatini tiniqlashtiring.
- Soʻng supernatantni yangi probirkaga oʻtkazing va immunopretsipitatsiya yoki boshqa tahlillarga tayyorlang.
Agar ultratovush qurilmangiz shtativga oʻrnatilgan boʻlsa, namuna probirkalari solingan muzli vannani ultratovush zondi ostiga joylashtiring va ultratovush zondini 1,5ml probirkaga kiriting.
Gomogenizatsiya buferi haqida eslatma: yuqoridagi ultratovushli lizis protokoli uchun gomogenizatsiya buferini quyidagicha tayyorlang:
- 15 mM Hepes pH 7,6 – 0,5 M eritmadan 15 ml
- 10 mM KCl – 2 M eritmadan 2,5 ml
- 1,5 mM MgCl2 – 1 M eritmadan 0,75 ml
- 0,1 mM EDTA – 0,5 M eritmadan 100 ul
- 0,5 mM EGTA – 0,1 M eritmadan 2,5 ml
- 44 mM saxaroza – 50 % eritmadan 14,7 ml
- Foydalanishdan bevosita oldin qoʻshing: 1mM DTT – 1M dan 1000x
- hamda proteaza ingibitori
UIP400MTP plastinka ultratovush qurilmasi yordamida 96 quduqchali plastinkalarda C. elegansni yuqori unumdorlik bilan lizis qilish
C. elegans lizisi (voyaga yetgan nematodalar)
UIP400MTP 80% amplituda, 20 ta sikl (har bir ultratovush ishlovi sikli: 30 sec YOQILGAN, 30 sec OʻCHIRILGAN)
Lizis buferi:
- 1-variant) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
- 2-variant) koimmunopretsipitatsiya (co-IP) uchun: 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (Complete proteinaza ingibitorlari kokteyli)
DNKni yuqori unumdorlik bilan fragmentlash
C. elegans (voyaga yetgan nematodalar) DNKsi 200–300bp: UIP400MTP plastinka ultratovush qurilmasi – 80% amplituda, 30 ta impulsni sozlang – har biri 30sec yoqilgan, 30sec oʻchirilgan
Namunalarni yuqori unumdorlik bilan tayyorlash uchun UIP400MTP plastinka ultratovush qurilmasi koʻp quduqchali, mikrotitr va 96 quduqchali plastinkalardagi namunalarga bir tekis ultratovush ishlovi beradi
Miqdoriy affin tozalash tahlillari uchun C. elegansni ultratovush yordamida lizis qilish
C. elegans embrionlari (har bir takror uchun ∼2 million) yosh, tuxum tutuvchi germafroditlarga oqartirgich bilan ishlov berish orqali uchta biologik takrorda yangi yigʻib olindi va muz ustida ultratovush bilan ishlov berildi (sikl: 0,5 s, amplituda: 40–45%, har bir seansda 5 ta impuls, 5 ta seans, seanslar orasidagi tanaffus: 30 s; UP200S ultratovush protsessori va S26d2 mikrouchligi (Hielscher Ultrasonics GmbH)) yordamida lizis buferida (umumiy hajm: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glitserin, proteaza ingibitorlari aralashmasi, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Ultratovush ishlovidan keyin Nonidet P-40 Substitute 1% gacha qoʻshildi va lizatlar 4°C haroratda 30 min davomida uchma-uch aylantirish bilan inkubatsiya qilindi, soʻng 4°C haroratda 20 000 × g da 20 min davomida sentrifugalandi. Keyin tiniqlashtirilgan lizat yuqoridagi lipid qatlamini buzmasdan aspiratsiya qilindi va teng ikkiga boʻlinib, anti-GFP agarozali donachalarga yoki bloklangan nazorat donachalariga (40–50 μl) qoʻshildi. 4°C haroratda 60–90 min davomida uchma-uch aylantirishdan keyin donachalar 0,1% Nonidet P-40 Substitute saqlovchi lizis buferi bilan bir marta, soʻng I bufer (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) yoki II bufer (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), yoxud ikkalasi bilan ikki marta yuvildi. GFP:MBK-2 pull-daunlari uchun turli yuvish sharoitlaridan foydalanib, ikkita alohida tajriba bajarildi. Oqsillar xona haroratida 50 μl 6 m mochevina/2 M tiomochevina eritmasida orbital chayqatish orqali elyutsiya qilindi. MBK-1::GFP pull-daun tajribalari uchun oqsillar 90°C haroratda 50μl 8 m guanidiniy xlorid eritmasida chayqatish orqali ikki marta elyutsiya qilindi, soʻng etanol bilan choʻktirildi. Keyin elyutsiya qilingan oqsil namunalari eritmada parchalandi.
(qarang: Chen et al., 2016)
Chuvalchanglarni ultratovush yordamida gomogenizatsiya va lizis qilish
C.elegans lizisi va oqsil ekstraksiyasi amaliyoti uchun har bir namuna hisobiga tegishli bosqichdagi 30 000 ta nematoda yigʻildi va muzdek S-basal bilan yuvildi, 1500 rpm tezlikda 2 min. davomida sentrifugalash orqali konsentratsiyalandi, qoldiq bakteriyalarni yoʻqotish uchun muzdek S-basal bilan olti marta yuvildi va foydalanishga tayyor boʻlguncha muz ustida saqlandi. Oqsil ekstraksiyasi uchun tuxum tutuvchi voyaga yetgan chuvalchanglar oxirgi S-basal yuvishidan keyin zich choʻkma hosil qilishi taʼminlandi. Keyin chuvalchang choʻkmalari 1 ml muzdek ekstraksiya buferida [20 mM kaliy fosfat, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, proteaza ingibitorlari (Sigma P2714)] qayta suspenziyalandi va darhol ishlov berildi.
∼30 000 ta tuxum tutuvchi voyaga yetgan chuvalchangga (∼100 mg nam massaga mos keladi) 1 ml muzdek ekstraksiya buferida zond turidagi ultratovush qurilmasi (masalan, MS2 mikrouchlikli UP50H) yordamida muz ustida, 40% amplitudada, 3 sec yoqilgan va 30 sec oʻchirilgan 10 ta siklda ultratovush ishlovi berildi. (qarang: Baskharan et al. 2012)
C. elegansdan lipidlarni ultratovush yordamida ekstraksiya qilish
Metabolomikaning bir tarmogʻi boʻlgan lipidomikada biologik tizimlarning lipid tarkibi tavsiflanadi va tahlil qilinadi. Metabolik lipidlarning oʻzaro taʼsiri hamda ularning salomatlik va umr davomiyligiga taʼsirini oʻrganish uchun C. elegans lipidomikada keng qoʻllaniladi.
Ultratovushli lizis va ekstraksiya C. elegans embrionlari, lichinkalari va voyaga yetgan chuvalchanglaridan sfingolipidlar kabi lipidlarni ajratib chiqarish uchun qoʻllaniladi. Ultratovush bilan ishlov berish chuvalchang gomogenatlarini tayyorlash va keyinchalik namunadan lipidlarni ekstraksiya qilish uchun qoʻllaniladi.
C. elegansdan lipidlarni ultratovush yordamida ekstraksiya qilish protokoli
C. elegans choʻkmasini muz ustida eriting va 0,5 ml ultrawater bilan qayta suspenziyalang.
C. elegans namunalariga 1,5mL probirkalarda ultratovush bilan ishlov bering, bunda namunalarni uzluksiz muz ustida saqlang.
Ultratovush bilan ishlov berish uchun quyidagi qurilmalardan foydalanish mumkin: zond turidagi ultratovush qurilmasi, masalan, UP200Ht, namunalarni ultratovush yordamida tayyorlash qurilmasi VialTweeter (10 ta namunaga bir vaqtda ultratovush bilan ishlov berish) yoki UIP400MTP (96 quduqchali plastinkalar kabi koʻp quduqchali plastinkalarga ultratovush bilan ishlov berish uchun).
UP200Ht yordamida ultratovushli lizis qilish uchun S26d2 mikrouchligidan foydalaning. Raqamli menyuda ultratovush sikli rejimini oldindan sozlang. Amplitudani 10% ga, ultratovush bilan ishlov berish sikli rejimini esa har bir ultratovush impulslar seriyasi orasida 30 sec. tanaffus boʻladigan 2 sec impulsli 20 ta siklga sozlang.
Supernatantlarni burama qopqoqli shisha probirkalarga oʻtkazing.
Har bir shisha probirkaga 1 ml ultrawater, soʻng har bir shisha probirkaga 6 ml xloroform/metanol aralashmasini (nisbat = 2:1) qoʻshib, Folch ekstraksiyasini bajaring.
Har bir shisha probirkani vorteksda 30 sec davomida 4 marta aralashtiring.
Fazalarning ajralishini yanada kuchaytirish uchun probirkalarni 1 258 x g da 15 min davomida sentrifugalang (Eppendorf, 5810 R).
Pastki gidrofob fraksiyani shisha Paster pipetkasi yordamida toza shisha probirkaga oʻtkazing.
Pastki gidrofob fraksiyani azot bugʻlatgichida azot oqimi ostida quriting.
Quritilgan choʻkmani foydalanishgacha -80 °C muzlatkichda saqlang.
Chuvalchang lizatlarini ultratovush yordamida tayyorlash
Chuvalchang lizati: barcha bakteriyalarni yoʻqotish uchun L4 bosqichidagi chuvalchanglar yigʻib olindi va M9 buferi (42,26 mM Na2HPO4, 22,04 mM KH2PO4, 85,56 mM NaCl va 0,87 mM MgSO4) bilan uch marta yuvildi. M9 buferi imkon qadar olib tashlanganidan keyin chuvalchanglar lizis buferida qayta suspenziyalandi: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-glitserol fosfat, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM natriy ftorid, 1 mM natriy ortovanadat, 5 mM natriy pirofosfat, 0,2 mM fenilmetansulfonilftorid va proteaza ingibitori. Chuvalchanglar suyuq azotda muzlatilib, 37°C haroratda uch marta eritildi, soʻng 10 ta namuna probirkasini bir vaqtda tayyorlash uchun ultratovushli VialTweeter qurilmasi yordamida quruq muz ustida ultratovush ishlovi berildi. Ultratovush bilan ishlov berish 50% amplitudada, har biri 2 sec. davom etadigan 10 ta siklda, ultratovush impulslar seriyasi orasida 30 sec tanaffus bilan bajarildi. Shundan keyin namunalar 12 000 rpm tezlikda, 4°C haroratda 15 min davomida sentrifugalandi. Supernatant yigʻib olindi va -70°C haroratda saqlandi. Oqsil miqdorini Bradford tahlili bilan aniqlash uchun alikvota ishlatildi.
Umumiy glutation, GSH va GSSGni aniqlash: glutation miqdorini aniqlash uchun lizatlar tayyorlash va aniqlash bir kunda bajarildi. Glyukoza bilan oziqlantirilgan va nazorat L4 lichinkalari yigʻib olindi va M9 buferi bilan uch marta yuvildi. M9 buferi imkon qadar olib tashlanganidan keyin chuvalchanglar muzdek metafosfor kislotada (5% w/v) qayta suspenziyalandi, soʻng ultratovushli VialTweeter yordamida muz ichida 50% amplitudada, har biri 2 sec. davom etadigan oʻnta ultratovush ishlovi siklida, har bir sikl orasida 30 sec. tanaffus bilan ultratovush ishlovi berildi. Shundan keyin 12 000 rpm tezlikda, 4 ̊C haroratda 15 min davomida sentrifugalandi.
(qarang: Alcántar-Fernández et al., 2018)
Immunopretsipitatsiya va vestern blottingdan oldin C. elegans namunalarini tayyorlash
Qisqacha, embrion ekstraktlari uchun C. elegans L1 lichinkalari katta miqyosdagi suyuq S-muhit kulturalarida voyaga yetguncha oʻstirildi. Embrionlar standart oqartirgich usuli yordamida yigʻib olindi va lizis buferida (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glitserin, 0,05% NP-40, 1 proteaza ingibitorlari kokteyli va 1 fosfataza ingibitorlari kokteyli I va II) suspenziyalandi, suyuq azotda tez muzlatildi va mikrouchlikli ultratovush qurilmasi, masalan, UP200Ht va S26d2 yordamida 30% amplitudada 10 s davomida 10 ta impuls berib, hujayralarni ultratovush yordamida parchalash orqali lizis qilindi. Koʻproq namunalarni tayyorlash kerak boʻlsa, ultratovushli VialTweeter yoki quduqchali plastinkalar uchun MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP tavsiya etiladi. Ultratovush bilan ishlov berishdan keyin ekstraktlar 30 000g da, 4°C haroratda 20 min davomida sentrifugalash orqali dastlabki tiniqlashtirishdan oʻtkazildi. Dastlabki tiniqlashtirilgan ekstrakt (300µg umumiy oqsil) A-oqsil–agarozaga koʻndalang bogʻlangan 40µg affin tozalangan anti-CDC-25.1 antitanasi (ushbu tadqiqot) bilan inkubatsiya qilindi yoki nazorat sifatida A-oqsil–agarozaga koʻndalang bogʻlangan shunga oʻxshash miqdordagi quyon immunoglobulini (Ig)G ishlatildi; bu amaliyot umumiy hajmi 200µl boʻlgan, 1% NP-40 saqlovchi lizis buferida bajarildi va qoʻshilishi oqsillarning matritsaga nospetsifik bogʻlanishini kamaytirdi. Namunalar 4°C haroratda 1 h davomida aylantirildi, donachalar lizis buferi bilan uch marta yuvildi va 30µl glitsin/HCl hamda 200 mM NaCl, pH 2,2 bilan elyutsiya qilindi. Immunopretsipitatsiyadan keyin elyuatlar 30µl SDS namuna buferida suyultirildi, 95°C haroratda 4 min davomida qizdirildi va odatda umumiy miqdorning 3% qismi boshlangʻich namuna uchun, 30% qismi esa elyuatlar uchun SDS-PAGEga qoʻyildi; undan keyin anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3 (1:500) yoki anti-β-actin (1:2000) antitanalari bilan vestern blotting bajarildi. Ekstraktlar immunopretsipitatsiyadan oʻtkazilmagan hollarda, ulardan olingan bir xil miqdordagi umumiy oqsil SDS namuna buferida qayta suspenziyalandi, 95°C gacha qizdirildi, keyin bevosita SDS-PAGEga qoʻyildi va vestern blotting orqali tahlil qilindi. (qarang: Segref et al. 2020)
UP200St ultratovushli hujayra parchalagich lizis va oqsil ekstraksiyasi uchun S26d2 mikrouchligi bilan
Haroratni aniq nazorat qilish ostida ultratovushli lizis
Biologik namunalar bilan ishlashda haroratni aniq va ishonchli nazorat qilish juda muhimdir. Yuqori haroratlar namunalarda issiqlik taʼsiridagi oqsil degradatsiyasini boshlab beradi.
Namunalarni tayyorlashning barcha mexanik usullari kabi, ultratovush bilan ishlov berish ham issiqlik hosil qiladi. Biroq VialTweeter ishlatilganda namunalarning haroratini yaxshi nazorat qilish mumkin. Namunalarni tahlil uchun VialTweeter va VialPress yordamida tayyorlayotganingizda ularning haroratini kuzatish va nazorat qilishning turli imkoniyatlarini taqdim etamiz.
- Namuna haroratini kuzatish: VialTweeter qurilmasini ishga tushiradigan UP200St ultratovush protsessori aqlli dasturiy taʼminot va ulanadigan harorat sensori bilan jihozlangan. Harorat sensorini UP200St qurilmasiga ulang va harorat sensorining uchini namuna probirkalaridan biriga kiriting. Raqamli rangli sensorli displey orqali UP200St menyusida namunangizga ultratovush bilan ishlov berish uchun muayyan harorat oraligʻini belgilashingiz mumkin. Eng yuqori haroratga yetilganda ultratovush qurilmasi avtomatik toʻxtaydi va namuna harorati belgilangan harorat ∆ ning quyi qiymatigacha tushguncha tanaffus qiladi. Keyin ultratovush bilan ishlov berish avtomatik ravishda yana boshlanadi. Ushbu aqlli funksiya issiqlik taʼsiridagi degradatsiyaning oldini oladi.
- VialTweeter blokini oldindan sovitish mumkin. Titan blokni oldindan sovitish uchun VialTweeter blokini (faqat oʻzgartirgichsiz sonotrodni!) sovitkich yoki muzlatkichga qoʻyish namunada harorat koʻtarilishini kechiktirishga yordam beradi. Imkon boʻlsa, namunaning oʻzini ham oldindan sovitish mumkin.
- Ultratovush bilan ishlov berish paytida sovitish uchun quruq muzdan foydalaning. Quruq muz bilan toʻldirilgan sayoz patnisdan foydalaning va issiqlik tez tarqalishi uchun VialTweeter qurilmasini quruq muz ustiga joylashtiring.
Lizis amaliyotingiz uchun optimal ultratovushli hujayra parchalagichni toping
Hielscher Ultrasonics laboratoriyalar, stol usti va sanoat miqyosidagi tizimlar uchun yuqori unumli ultratovushli hujayra parchalagichlar va gomogenizatorlarni ishlab chiqarishda koʻp yillik tajribaga ega. Bakterial hujayra kulturangizning koʻlami, tadqiqot yoki ishlab chiqarish maqsadingiz va bir soat yoki bir kunda ishlov beriladigan hujayralar hajmi amaliyotingiz uchun toʻgʻri ultratovushli hujayra parchalagichni topishda muhim omillardir.
Hielscher Ultrasonics bir nechta namunalarga (10 tagacha flakon) hamda koʻp sonli namunalarga (yaʼni mikrotitr plastinkalari / 96 quduqchali plastinkalar) bir vaqtda ultratovush bilan ishlov berish uchun turli yechimlarni, 50 dan 400 vattgacha boʻlgan turli quvvat darajalaridagi klassik zond turidagi laboratoriya ultratovush qurilmalaridan tortib, yirik ishlab chiqarishda tijoriy hujayra parchalash va oqsil ekstraksiyasi uchun har bir qurilmasi 16,000vattgacha quvvatga ega toʻliq sanoat ultratovush protsessorlarigacha taklif etadi. Barcha Hielscher ultratovush qurilmalari toʻliq yuklama ostida 24/7/365 ishlash uchun yaratilgan. Mustahkamlik va ishonchlilik ultratovush qurilmalarimizning asosiy xususiyatlaridir.
Barcha raqamli ultratovushli gomogenizatorlar aqlli dasturiy taʼminot, rangli sensorli displey va maʼlumotlarni avtomatik qayd etish funksiyasi bilan jihozlangan boʻlib, bular ultratovush qurilmasini laboratoriya va ishlab chiqarish korxonalarida qulay ish vositasiga aylantiradi.
Biologik namunalaringizda qanday hujayralarga, qanday hajmda, qanchalik tez-tez va qanday maqsadda ishlov berishingiz kerakligini bizga bildiring. Jarayoningiz talablariga eng mos ultratovushli hujayra parchalagichni tavsiya qilamiz.
Quyidagi jadval ixcham qoʻlda ushlanadigan gomogenizatorlar va koʻp namunali ultratovush qurilmalaridan tortib, tijoriy amaliyotlar uchun sanoat ultratovush protsessorlarigacha boʻlgan ultratovush tizimlarimizning taxminiy ishlov berish quvvati haqida tasavvur beradi:
| Partiya hajmi | Hajmiy oqim tezligi | Tavsiya etiladigan qurilmalar |
|---|---|---|
| 96 quduqchali / mikrotitr plastinkalari | n.a. | UIP400MTP |
| Har biri 0,5 dan 1,5mL gacha boʻlgan 10 ta flakon | n.a. | UP200St qurilmasiga ulangan VialTweeter |
| 0,01 dan 250mL gacha | 5 dan 100mL/min gacha | UP50H |
| 0,01 dan 500mL gacha | 10 dan 200mL/min gacha | UP100H |
| 10 dan 2000mL gacha | 20 dan 400mL/min gacha | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 dan 20L gacha | 0,2 dan 4L/min gacha | UIP2000hdT |
| 10 dan 100L gacha | 2 dan 10L/min gacha | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 dan 100L/min gacha | UIP16000 |
| n.a. | yuqoriroq | qurilmalar klasteri: UIP16000 |
Biz bilan bogʻlaning! / Bizdan soʻrang!
Adabiyotlar / Manbalar
- Chen J.-X; Cipriani P.G.; Mecenas D.; Polanowska J.; Piano F.; Gunsalus K.C.; Selbach M. (2016): In Vivo Interaction Proteomics in Caenorhabditis elegans Embryos Provides New Insights into P Granule Dynamics. Molecular & Cellular Proteomics 15.5; 2016. 1642-1657.
- Jonathan Alcántar-Fernández, Rosa E. Navarro, Ana María Salazar-Martínez, Martha Elva Pérez-Andrade, Juan Miranda-Ríos (2018): Caenorhabditis elegans respond to high-glucose diets through a network of stress-responsive transcription factors. PLoS One 13(7); 2018.
- Segref, A.; Cabello, J.; Clucas, C.; Schnabel, R.; Johnstone I.L. (2010): Fate Specification and Tissue-specific Cell Cycle Control of the Caenorhabditis elegans Intestine. Molecular Biology of the Cell Vol. 21, 2010. 725–738.
- Henderson S.T., Bonafe M., Johnson T.E. (2006): daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2006; 61:444–60.
Bilishga arziydigan faktlar
Caenorhabditis elegans
C. elegans uzunligi taxminan 1 mm boʻlgan, erkin yashovchi shaffof nematoda (yumaloq chuvalchang) boʻlib, bakteriyalar (masalan, E. coli) bilan oziqlanadi va nisbatan qisqa hayot sikliga ega. 20 °C haroratda C. elegansning laboratoriya shtammi (N2) oʻrtacha 2–3 hafta umr koʻradi va avlod almashinish vaqti 3–4 kunni tashkil etadi. C. elegans katta miqdorda yetishtirilganda – buni aniq nazorat qilinadigan laboratoriya sharoitlarida oson bajarish mumkin – yangi dorilarning taʼsir mexanizmi, shuningdek, inson kasalliklaridagi murakkab molekulyar jarayonlar doirasida ularning taʼsiri va oʻzaro taʼsirini oson tekshirish mumkin. Kichik genom, qisqa hayot sikli va laboratoriya sharoitida u bilan ishlashning oddiyligi C. elegansni genomika, proteomika, rivojlanish biologiyasi, kasalliklarni oʻrganish, dori ishlab chiqish va boshqa tadqiqotlar uchun ideal model organizmga aylantiradi.
Caenorhabditis elegans chuvalchanglari erkak yoki germafrodit boʻlishi mumkin. Germafroditlarda ham erkak, ham urgʻochi koʻpayish organlari mavjud. Biroq urgʻochi chuvalchanglar mavjud emas. Germafroditlar oʻzini oʻzi urugʻlantirishi yoki erkak chuvalchanglar bilan koʻpayishi ham mumkin. C. elegans har kuni 1 000 dan ortiq tuxum hosil qilishi mumkin.
C. elegans asab tizimiga ega eng sodda organizmlardan biri boʻlgani sababli, bu nematoda chuvalchangi 1963 yildan beri tadqiqotlarda model organizm sifatida qoʻllaniladi. Neyronlar harakat potensiallarini hosil qilmaydi va kuchlanish bilan boshqariladigan hech qanday natriy kanallarini ekspressiya qilmaydi. Germafroditda bu tizim 302 ta neyrondan iborat boʻlib, ularning bogʻlanish sxemasi konnektom deb ataladigan xaritada toʻliq aks ettirilgan.
C. elegans genomidagi koʻplab genlarning odamlarda funksional muqobillari mavjud boʻlib, bu uni inson kasalliklari uchun nihoyatda foydali modelga aylantiradi; masalan, u rivojlanish biologiyasi, qarish va uzoq umr koʻrishga taʼsir etuvchi omillarni oʻrganishda qoʻllaniladi. Bundan tashqari, C. elegans mutantlari koʻplab inson kasalliklari, jumladan nevrologik buzilishlar (masalan, Altsgeymer kasalligi), tugʻma yurak kasalligi va buyrak kasalligi uchun modellarni taqdim etadi.
Bu omillar C. elegansni koʻplab tadqiqot yoʻnalishlari uchun juda qimmatli modelga aylantirdi. Natijada C. elegans butun genomi sekvenslangan birinchi koʻp hujayrali organizm boʻldi. Genomda taxminan 20 470 ta oqsil kodlovchi gen mavjud. C. elegans genlarining taxminan 35% ida inson gomologlari bor. Eʼtiborga molik jihati shundaki, inson genlari C. elegansga kiritilganda uning tegishli gomologlari oʻrnini bosa olishi qayta-qayta koʻrsatilgan. Aksincha, C. elegansning koʻplab genlari sutemizuvchilar genlariga oʻxshash tarzda ishlashi mumkin.
C. elegansning umr davomiyligi taxminan 3 hafta boʻlib, oltita hayot bosqichidan iborat: embriogenez (tuxum bosqichi), toʻrtta lichinkalik bosqichi (L1 dan L4 gacha) va voyaga yetgan bosqich. Nematodalar tuxumdan 560 ta hujayradan iborat L1 lichinkalari sifatida chiqadi. Har bir lichinkalik bosqichidagi oʻsish hujayra boʻlinishi va hujayra gipertrofiyasi orqali yuz beradi. Har bir lichinkalik bosqichi kutikulaning almashinishi bilan belgilanadi. Agar ogʻir atrof-muhit sharoitlari rivojlanayotgan chuvalchangga voyaga yetganda koʻpayishni taʼminlash ehtimoli pastligini bildirsa, C. elegans oʻz rivojlanishini oʻzgartirib, muqobil L3 lichinkalik bosqichini hosil qilishi mumkin; bunda lichinkalar dauer bosqichiga oʻtadi. Bu holatda hayvonlar stressga favqulodda chidamli va uzoq umr koʻruvchi boʻlib, uch oydan toʻqqiz oygacha yashashi mumkin. Dauer lichinkalari ogʻiz va anal boʻshliqlarini yopish, ichagini kichraytirish va daf-16/FOXOga bogʻliq genetik dasturni faollashtirish orqali noqulay sharoitlardan oʻzini ajratadi; bu dastur, boshqa taʼsirlar qatorida, dauerga xos kutikulaning ekspressiyasiga olib keladi. (qarang: Henderson et al., 2006)
C. elegans dauer lichinkalari
Dauer lichinkalari muqobil rivojlanish bosqichiga oʻtgan nematoda lichinkalarini bildiruvchi atamadir. “Dauer lichinkalari” atamasi ayniqsa rabditidlar oilasidagi chuvalchanglar, jumladan Caenorhabditis elegans uchun qoʻllaniladi. “Dauer” soʻzi nemis tilidan kelib chiqqan boʻlib, “vaqt davri” maʼnosidagi “davomiylik”ni anglatadi. Dauer lichinkalari oʻziga xos stazis holatiga oʻtadi va ogʻir sharoitlarda omon qolishi mumkin. Lichinkaning dauer bosqichiga oʻtishi va qachon oʻtishi atrof-muhit sharoitlariga bogʻliq. Dauer lichinkalari biologiyada keng oʻrganiladi, chunki ular ogʻir muhitda omon qolish va uzoq vaqt yashash uchun favqulodda qobiliyat namoyon etadi. Masalan, C. elegans dauer lichinkalari toʻrt oygacha yashashi mumkin, bu odatdagi reproduktiv rivojlanishdagi taxminan uch haftalik oʻrtacha umr davomiyligidan ancha uzoqdir.
C. elegans hayot sikliga umumiy nazar
Qulay muhitda C. elegansning rivojlanishi:
Caenorhabditis elegans (C. elegans) qulay va noqulay atrof-muhit sharoitlarida turlicha rivojlanish yoʻlini namoyon etadi.
C. elegansning qulay sharoitlarga javobi:
Qulay sharoitlarda mikroskopik yumaloq chuvalchang Caenorhabditis elegans (C. elegans) aniq belgilangan rivojlanish yoʻlidan boradi. Atrof-muhit sharoitlari optimal boʻlganda, odatda 15°C dan 20°C gacha boʻlgan haroratlarda, nematoda hayot siklini odatda ancha tez oʻtaydi.
- Reproduktiv rivojlanish: C. elegans hayot siklini embrion sifatida boshlaydi. Keyin u L1 dan L4 gacha deb qisqartiriladigan toʻrtta alohida lichinkalik bosqichidan oʻtadi.
- Voyaga yetgan bosqich: Toʻrtta lichinkalik bosqichini tugatganidan keyin C. elegans atigi 3–5 kunda voyaga yetgan bosqichga yetadi. Bu bosqichda ular koʻpayishga qodir boʻlib, atrof-muhit omillariga qarab yana 2–3 hafta yashashda davom etadi.
C. elegansning noqulay sharoitlarga javobi:
Biroq C. elegans chidamli organizm boʻlib, dauer hosil boʻlishi deb ataladigan jarayon orqali noqulay sharoitlarga moslasha oladi.
- Dauer hosil boʻlishi: Atrof-muhit sharoitlari noqulaylashganda, masalan, haddan tashqari zichlik, cheklangan oziqa taʼminoti yoki yuqori haroratlar kuzatilganda, C. elegans “dauer” deb ataladigan va L3d deb qisqartiriladigan oʻziga xos uchinchi lichinkalik bosqichiga oʻtishi mumkin.
- Dauer holatida omon qolish: Dauer lichinkalari ogʻir sharoitlarda omon qolishga maxsus moslashgan. Ular bu bosqichda energiyani tejab va murakkab muhit sharoitlariga bardosh berib, bir necha oy yashashi mumkin.
Qulay muhitda tiklanish:
C. elegansning eʼtiborga molik jihati – sharoitlar yaxshilanganda odatdagi hayot sikliga qaytish qobiliyatidir.
- Qulay sharoitlarga qaytish: C. elegans dauer lichinkalari yana qulay sharoitlarga, masalan, moʻl oziqa, pastroq populyatsiya zichligi va mos haroratlarga duch kelganda, muhitdagi oʻzgarishni sezadi.
- Tiklanish va koʻpayish: Ushbu yaxshilangan sharoitlarga javoban dauer lichinkalari “tiklanish” deb ataladigan jarayondan oʻtadi. Tiklanish paytida ular lichinkalik bosqichlariga qaytadi va oxir-oqibat odatdagi umr davomiyligiga ega, koʻpayishga qodir voyaga yetgan individlarga aylanadi.
Atrof-muhit sharoitlariga javoban rivojlanish bosqichlari orasida almashinish qobiliyati C. elegans biologiyasining oʻziga xos jihatidir. Bu ularga keng koʻlamdagi sharoitlarda samarali omon qolish va koʻpayish imkonini beradi hamda ularni ilmiy tadqiqotlar, ayniqsa rivojlanish, genetika va qarishni oʻrganish uchun qimmatli model organizmga aylantiradi.

