Western Blotting uchun ultratovushli lizis

• Western blot - bu to'qima gomogenati yoki hujayra ekstrakti namunasida o'ziga xos oqsillarni aniqlash uchun analitik protsedura.
• Western blotni o'tkazish yoki ferment faolligini o'lchash uchun ko'plab tahlillar hujayra ichida joylashgan materiallarga (masalan, oqsillar, DNK, hujayra osti bo'laklari) kirishni talab qiladi.
• Sonication - nazorat ostida hujayra buzilishi va lizis uchun ishonchli va oson ishlov berish usuli.

Ultrasonik hujayra buzilishi

To'qimalardan va o'stirilgan hujayralardan oqsil olish ko'plab biologik, biokimyoviy va analitik usullar (PAGE, Western blotting, Elishay, mass-spektrometriya va boshqalar) yoki oqsillarni tozalash uchun birinchi qadamdir. Yuqori protein hosilini olish uchun hujayra materiali va to'qimalari samarali ravishda buzilishi/lizislanishi kerak. O'simlik hujayrasi yoki hayvon to'qimasidan qat'i nazar, sonikatsiya sizning hujayra lizatini oson va tez tayyorlash usulidir.

Sonikatsiyaning afzalliklari

• Tez & Samarali
• Oson ishlash
• yuqori protein hosildorligi
• takrorlanadigan / takrorlanadigan
• aniq nazorat qilinadi
• kengaytiriladigan

G'arbiy immunoblotting uchun immunoprecipitatsiya protokoli

A. Reaktivlar

Eritmalarni tayyorlash uchun Milli-Q kabi tozalangan suvdan foydalaning.

• 1X fosfat tamponlangan tuz (PBS)
• 1X Hujayra lizis buferi: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriy pirofosfat, 1 mM b-glitse, Na11V1Om4, mkg/ml Leupeptin
  Muhim: foydalanishdan oldin darhol 1 mM PMSF qo'shing.
• IP uchun 15 mkl Protein A+15 mkl Protein G yetarli, lekin u asosiy antikor va namuna hajmiga bog‘liq bo‘lishi mumkin. Bundan tashqari, oldindan aralashtirilgan protein A/G agarozasidan foydalanishingiz mumkin (masalan, quyon IgG uchun A oqsili va sichqoncha IgG uchun G oqsili)
• 3X SDS namuna buferi: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 da 25°C), 6% w/v SDS, 30% glitserin, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromofenol ko‘k

B. Hujayra lizatlarini tayyorlash

• Hujayralarni yig'ib oling. Hujayralarni denaturatsiya qilinmagan sharoitda yig'ish uchun ommaviy axborot vositalarini olib tashlang va hujayralarni muzli PBS bilan bir marta yuving.
• PBSni olib tashlang va har bir plastinkaga (10 sm) 0,5 ml muzdek sovuq 1X hujayra lizis buferini qo'shing va plitalarni muz ustida 5 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.
• Plitalardan hujayralarni qirib tashlang va mikrosentrifuga naychalariga o'tkazing. Muz ustida turing.
• Muzli sovuq immunoprecipitatsiya tamponida ikki marta 10 soniya davomida sonikatsiya qiling (IP buferi: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 va proteaz inhibitori aralashmasi). Sonikatsiya uchun VialTweeter yoki zond ultratovush apparati UP100H yoki UP200Ht eng mos keladi.
• Lizatlarni 15000 g da 10 daqiqa davomida 4°C da santrifüj qiling.
• Supernatantni yangi naychaga o'tkazing. (Agar kerak bo'lsa, lizat -80 ° C da saqlanishi mumkin.)
• Supernatantga birlamchi antikor qo'shing. Birlamchi antikorga ega bo'lgan supernatant 1 soat davomida 4 ° C da engil aralashtirish ostida inkubatsiya qilinadi. Birlamchi antikor odatda western blotting uchun ishlatiladiganidan 10 baravar ko'proq konsentrlangan miqdorda qo'shiladi. (100 mkl uchun 1 mkg dan boshlashingiz mumkin.)
• Keyin supernatant yana 1 soat davomida teng miqdorda Protein A-agaroz (Invitrogen) va Protein G agaroza aralashmasi bilan inkubatsiya qilinadi.
• Agaroz pelletlarini IP tampon bilan uch marta yuving. Shundan so'ng, SDS-PAGE yuklash buferi bilan bog'langan oqsillarni 95 ° C da 5 daqiqa qizdirish orqali ajratib oling.

C. Immunitetning pasayishi

• 200 mkl hujayra lizatini oling va birlamchi antikor qo'shing. Kechasi 4 ° C da yumshoq silkitib inkubatsiya qiling.
• Protein A yoki G agaroz boncuklarini qo'shing (20 mkl 50% boncuk atala). 4 ° C da 1-3 soat davomida yumshoq silkitish bilan inkubatsiya qiling.
• 4°C da 30 soniya davomida mikrotsentrifuga qiling. Peletni besh marta 500 µl 1X hujayra lizis buferi bilan yuving. Yuvish paytida muz ustida saqlang.
• Pelletni 20 mkl 3X SDS namuna buferi bilan qayta suspenziya qiling. Vorteks, keyin 30 soniya davomida mikrotsentrifuga.
• Namunani 2-5 daqiqa davomida 95-100 ° S gacha qizdiring va 14000 X g da 1 daqiqa davomida mikrosentrifuga qiling.
• Namunani (15–30 mkl) SDS-PAGE jeliga (12–15%) yuklang.
• Western blotting usuli bilan namunani tahlil qiling.

Sonicator UP50H bilan Western Blot tahlili

Kriebisch va boshqalarni o'rganishda prob tipidagi sonikator UP50H yordamida quyidagi protokol ishlatilgan. (2011):
Umumiy protein 1,25 (OH) bilan ishlangan MC3T3-E1 hujayralaridan ajratilgan.₂D₃ (10⁻⁸ M) yoki transport vositasi. Hujayralar 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich) ni o'z ichiga olgan bufer bilan lizing qilindi; 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriy dodesil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) va 0,5% natriy deoksixolat (Merck). Hujayra lizatasi 1-siklda 2 × 10 s va amplituda 80 ultratovush bilan sonikatsiya qilindi. UP50H ultratovushli protsessor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germaniya). Shundan so'ng, material 14000 rpm da 10 daqiqa davomida santrifüj qilindi va supernatant Western bloting uchun ishlatilgan. Yigirma besh mkg oqsil namuna buferida va qaytaruvchi vositada (Invitrogen) qaynatiladi va keyinchalik 4-12% poliakrilamid jellari (Invitrogen) yordamida SDS-PAGE orqali ajratildi va nitroselüloz membranasiga o'tkazildi (GE Healthcare). Membrana 1% kazein (Sigma-Aldrich) va 1% Tris (1 M) o'z ichiga olgan TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) bilan 1 soat davomida bloklandi. Bloklashdan so'ng, membrana birlamchi antikor (quyon anti-inson CBS 1/500, professor R. Banerji, Ann Arbor, MI, AQSh) laboratoriyasida ishlab chiqilgan 4 ° C haroratda kechasi engil qo'zg'atish bilan inkubatsiya qilindi. Horseradish peroksidaza (HPR) bilan konjugatsiyalangan ikkilamchi antikor (Dako) bilan inkubatsiya xona haroratida 1 soat davomida amalga oshirildi. Barcha blotlar yaxshilangan xemiluminesans (Perkin Elmer) tomonidan ishlab chiqilgan.
 

Ultrasonik hujayra parchalanishi va ekstraktsiyasi, lizat tayyorlash va jarayonni yaxshilash bo'yicha tavsiyalar bo'yicha eng yaxshi amaliyotlar haqida ko'proq ma'lumot olish uchun bu yerni bosing!
 
Quyidagi jadvalda laboratoriya o'lchamidagi ultratovush apparatlarining taxminiy qayta ishlash quvvati ko'rsatilgan:

Adabiyot / Adabiyotlar