G'arb jarayoni uchun ultratovush erishi

• G'arb dog 'to'qima hil yoki hujayra ekstrakt bir namunadagi maxsus oqsillarni aniqlash uchun analitik tartibi hisoblanadi.
• G'arb o'chirmayman ishlatish uchun yoki enzim faoliyatini o'lchash uchun, juda ko'p tajribalar, hujayra hapsolabilir materiallar (masalan oqsillar, DNK, subcellular bo'laklari) kirish talab qiladi.
• Sonikasyon nazorat Uyali izdan va parchalash uchun ishonchli va qulay sopi usuli hisoblanadi.

Ultratovush Uyali Disruption

to'qima va hujayra dan oqsil qazib olish ko'p, biologik biokimyoviy va analitik metodlarni (sahifasida Western Blotting, Elishay, massa spektrometrisi, va hokazo) yoki oqsil tozalash uchun birinchi qadamdir. yuqori oqsil hosil olish uchun, hujayra moddiy va to'qima samarali liz qilinadi / izdan kerak. o'simlik xujayrasi yoki hayvon to'qimalarining qat'i nazar, ultrasonik tebranish mobil lysate oson va tez tayyorlash usuli hisoblanadi.

Sonikasyon afzalliklari

• tez & samarali
• qulay foydalanish
• yuqori oqsil hosil
• tekrarlanabilir / tekrarlanabilir
• to'liq nazorat
• ölçeklendirilebilir

Western immunoblotting uchun Immunoprecipitation bayonnomasi

A Reaktivlar

echimlar tayyorlash uchun, masalan, milliy-Q sifatida tozalangan suv foydalaning.

• 1X fosfat tamponlu bilan qo'yvoring (PBS)
• 1X hujayra lizis tamponunda: 20 mm Tris (pH 7.5), 150 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mm natriy pirofosfat, 1 mm β-glycerophosphate, 1 mm Na3VO4, 1 mg / ml Leupeptin
  Muhim: foydalanish qo'shish 1 mm PMSF darhol avvalgi.
• 15 ml oqsil A + 15 ml oqsil G IP uchun etarli, lekin asosiy Antikor va namuna hajmiga bog'liq bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, oldingi aralash oqsil A / G agaroz foydalanishingiz mumkin (masalan, oqsil bir quyon uchun IgG pastga torting va protein G sichqoncha IgG uchun pastga torting)
• 3X SDS namuna tampon: 187.5 mm Tris-HCl (25 ° S da pH 6,8), w 6% / 0.03% ko'k / v Bromophenol w, SDS, 30% glitserin, 150 mm DTT, v

Hujayra lizatları B. tayyorlash

• xujayralari yig'im. nondenaturing sharoitlarda hujayralar hosil qilish uchun, ommaviy axborot vositalari olib tashlash va muzdek sovuq PBS bilan bir marta hujayralarini yuvib.
• PBS olib tashlash va har bir plastinka (10 sm) 0,5 ml muz-sovuq 1X hujayra parchalanishiga bufer qo'shishingiz va 5 daqiqa davomida muz ustida plitalari inkübe.
• plitalar off hujayralarni oldirish va Mikrosantrıfuj qulflash o'tkazing. muz ustida turing.
• Tovush to'lqinlarining ta'sir ikki marta muz-sovuq immünopresipitasyon tampon bilan 10 soniya davomida (IP bufer: 50 mm Tris-HCI [pH 7,4], 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 0,1% NP-40 va proteaz inhibitörü mix). Sonikasyon, VialTweeter yoki bir tekshirish ultrasonicator bunday UP100H yoki Uf200 ः t eng MUMKIN.
• 4 ° C da 10 daqiqa davomida 15,000 g lizatları santrifüjleyin.
• yangi naycha uchun süpernatant o'tkazing. (Zarur bo'lsa, lysate -80 ° C da saqlanishi mumkin.)
• süpernatana asosiy Antikor qo'shing. asosiy Antikor bilan supernatant engil çalkalama ostida 4 ° C da 1 soat davomida inkübe qilinadi. Boshlang'ich Antikor odatda g'arb blot ishlatiladi ko'proq joyga jamlanganda, bir miqdorda 10x qo'shiladi. (Siz quduqqa 100mL boshiga 1μg bilan boshlash mumkin.)
• Süpernatan keyin yana 1 soat davomida oqsil A-agaroz (Invitrogen) va oqsil G agaroz teng miqdorda aralashmasi bilan yanada inkübe qilinadi.
• IP tampon bilan agaroz granulalari uch marta yuvib tashlang. Shundan so'ng, 5 daqiqa davomida 95 ° C da isitish tomonidan SDS-PAGE Loading tampon bilan bog'lab proteinlar chiqarib.

S immunoprecipitatsiya

• 200 ml hujayra lizatı oling va asosiy Antikor qo'shish. yumshoq 4 ° C da kechada hilpiragan bilan inkübe.
• oqsil A yoki G agaroz tasbeh (50% marjon atala 20-ul) ham qo'shing. yumshoq 4 ° C da 1-3 soat davomida hilpiragan bilan inkübe.
• 4 ° C da, 30 soniya davomida Mikrosantrıfuj. Yuvish 1X hujayra lizis tamponu 500 ul bilan besh marta Palaf. yuviladi davomida muz ustida turing.
• 20-ul 3X SDS namuna tampon bilan pelletini. Aylanma, keyin 30 soniya davomida Mikrosantrıfuj.
• 14,000 X g 1 daqiqa uchun 95-100 ° 2-5 daqiqa davomida C va mikrosantrifüj uchun namunasi isitish.
• SDS-PAGE gel (12-15%) namuna (15-30 ml) yuklashingiz mumkin.
• G'arb blot tomonidan namunasi tahlil qiling.

ultrasonicator UP50H bilan Western Blot tahlil

Quyidagi protokol Kriebisch boshq yilda ishlatilgan. (2011):
Total protein 1,25 bilan muomala MC3T3-E1 hujayralari izolyatsiya qilingan (OH)₂D₃ (10^-8 M) yoki avtomobil. Hujayralar 50 mm Tris HCI, pH 8 (Sigma-Aldrich) o'z ichiga olgan tampon bilan vayron qilindi; 150 mm NaCl (Fisher Ilmiy); 0,1% natriy sulfat deodesil (SDS) (Fisher Ilmiy); 1% Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich) va 0,5% natriy m deoksikolattır (tashkilot). hujayra lizatı tsikli 1 2 × 10 s soniklendi va 80 genlik edi UP50H Ultrasonic Protsessor (Hielscher, ultratovush texnologiyasi, Teltow, Germaniya). Shundan so'ng, materiallar 14.000 rpm'de 10 daqiqa davomida santrifüje qilindi va süpernatant Western blotting uchun ishlatildi. Yigirma besh mg protein namunadir tampon va kamaytirish agenti (Invitrogen) qaynatildi va keyin 4-12% poliakrilamid jel (Invitrogen) yordamida SDS-PAGE bilan ajraldi va nitroseluloza membrana (GE sog'liqni saqlash xizmati) o'tkazildi. Membrana 1 soat davomida 1% quloqda (1% kasein (Sigma-Aldrich) va 1% Tris (1 M) o'z ichiga olgan TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl) bilan bloklandi. To'sib bo'lgandan so'ng, membranani kecha davomida 4 ° C darajasida engil ajitatsiya bilan asosiy antikor (quyon inson-inson CBS 1/500, Professor R. Banerjee, Enn Arbor, MI, AQSH laboratoriyasida ishlab chiqilgan) bilan inkubatsiya qilindi. Yalpiz peroksidaza (HPR) bilan qo'shilgan sekonder antikor (Dako) bilan inkubatsiya xona haroratida 1 soat davomida amalga oshirildi. Barcha blotlar chemiluminesans rivojlangan (Perkin Elmer) tomonidan ishlab chiqilgan.

Adabiyotlar / Adabiyotlar