Western blotting uchun ultratovushli lizis

• Western blot – toʻqima gomogenati yoki hujayra ekstrakti namunasidagi muayyan oqsillarni aniqlash uchun qoʻllaniladigan tahliliy usul.
• Western blot tahlilini oʻtkazish yoki ferment faolligini oʻlchash uchun koʻplab tahlillarda hujayra ichida saqlanib turgan materiallarga (masalan, oqsillar, DNK, subhujayraviy fragmentlar) kirish imkoniyati talab etiladi.
• Ultratovush bilan ishlov berish – hujayralarni nazorat ostida parchalash va lizis qilishning ishonchli hamda qoʻllash oson usuli.

Hujayralarni ultratovush bilan parchalash

Toʻqimalar va oʻstirilgan hujayralardan oqsil ajratib olish koʻplab biologik, biokimyoviy va tahliliy usullar (PAGE, Western blotting, ELISA, mass-spektrometriya va boshqalar) yoki oqsilni tozalashning birinchi bosqichidir. Yuqori oqsil chiqimiga erishish uchun hujayra materiali va toʻqimani samarali parchalash/ lizis qilish kerak. Oʻsimlik hujayrasi yoki hayvon toʻqimasi boʻlishidan qatʼi nazar, ultratovush bilan ishlov berish hujayra lizatini oson va tez tayyorlash usulidir.

Ultratovush bilan ishlov berishning afzalliklari

• tez va samarali
• ishlatish oson
• yuqori oqsil chiqimi
• qayta hosil qilinadigan/ takrorlanadigan
• aniq nazorat qilinadigan
• koʻlamini oshirish mumkin

Western immunoblotting uchun immunopretsipitatsiya protokoli

A. Reagentlar

Eritmalarni tayyorlash uchun Milli-Q kabi tozalangan suvdan foydalaning.

• 1X fosfat buferli tuz eritmasi (PBS)
• 1X hujayra lizisi buferi: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriy pirofosfat, 1 mM β-glitserofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptin
  Muhim: ishlatishdan bevosita oldin 1 mM PMSF qoʻshing.
• 15 μl A oqsili+15 μl G oqsili IP uchun yetarli, ammo bu birlamchi antitanangiz va namuna hajmiga bogʻliq boʻlishi mumkin. Oldindan aralashtirilgan A/ G oqsilli agarozadan ham foydalanishingiz mumkin (masalan, quyon IgG sini choʻktirib ajratish uchun A oqsili va sichqon IgG sini choʻktirib ajratish uchun G oqsili)
• 3X SDS namuna buferi: 187,5 mM Tris-HCl (25°C da pH 6,8), 6% w/v SDS, 30% glitserol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromfenol koʻki

B. Hujayra lizatlarini tayyorlash

• Hujayralarni yigʻib oling. Hujayralarni denaturatsiyalamaydigan sharoitda yigʻib olish uchun oziqa muhitini olib tashlang va hujayralarni muzdek sovuq PBS bilan bir marta chaying.
• PBS ni olib tashlang va har bir plastinkaga (10 cm) 0,5 ml muzdek sovuq 1X hujayra lizisi buferini qoʻshing, soʻng plastinkalarni muz ustida 5 daqiqa inkubatsiya qiling.
• Hujayralarni plastinkalardan qirib oling va mikrotsentrifuga probirkalariga oʻtkazing. Muz ustida saqlang.
• Muzdek sovuq immunopretsipitatsiya buferida ikki marta 10 soniyadan ultratovush bilan ishlov bering (IP buferi: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 va proteaza ingibitorlari aralashmasi). Ultratovush bilan ishlov berish uchun VialTweeter yoki zondli ultratovush qurilmalari, masalan, UP100H yoki UP200Ht eng mos keladi.
• Lizatlarni 4°C da 15 000 g tezlanishda 10 daqiqa tsentrifugalang.
• Choʻkma ustidagi suyuqlikni yangi probirkaga oʻtkazing. (Zarur boʻlsa, lizatni –80°C da saqlash mumkin.)
• Choʻkma ustidagi suyuqlikka birlamchi antitana qoʻshing. Birlamchi antitana qoʻshilgan choʻkma ustidagi suyuqlik yengil aralashtirish ostida 4°C da 1 h inkubatsiya qilinadi. Birlamchi antitana odatda Western blotting uchun ishlatiladiganidan 10x yuqori konsentratsiyada qoʻshiladi. (100μL uchun 1μg dan boshlashingiz mumkin.)
• Soʻng choʻkma ustidagi suyuqlik teng miqdordagi A oqsili-agarozasi (Invitrogen) va G oqsili-agarozasi aralashmasi bilan yana 1 h inkubatsiya qilinadi.
• Agaroza choʻkmalarini IP buferi bilan uch marta yuving. Shundan keyin 95°C da 5 daqiqa qizdirib, SDS-PAGE yuklash buferi yordamida bogʻlangan oqsillarni ajratib oling.

C. Immunopretsipitatsiya

• 200 μl hujayra lizatini oling va birlamchi antitana qoʻshing. 4°C da tun davomida sekin tebratib inkubatsiya qiling.
• A yoki G oqsilli agaroza donachalarini (50% li donacha suspenziyasidan 20 μl) qoʻshing. 4°C da 1–3 soat sekin tebratib inkubatsiya qiling.
• 4°C da 30 soniya mikrotsentrifugalang. Choʻkmani 500 µl 1X hujayra lizisi buferi bilan besh marta yuving. Yuvish davomida muz ustida saqlang.
• Choʻkmani 20 μl 3X SDS namuna buferi bilan qayta suspenziyalang. Vorteksda aralashtiring, soʻng 30 soniya mikrotsentrifugalang.
• Namunani 95–100°C gacha qizdirib, shu haroratda 2–5 daqiqa tuting va 14 000 X g tezlanishda 1 daqiqa mikrotsentrifugalang.
• Namunani (15–30 μl) SDS-PAGE geliga (12–15%) yuklang.
• Namunani Western blotting yordamida tahlil qiling.

UP50H sonikatori yordamida Western blot tahlili

Zondli UP50H sonikatoridan foydalaniladigan quyidagi protokol Kriebisch va boshqalarning (2011) tadqiqotida qoʻllanilgan:
MC3T3-E1 hujayralaridan umumiy oqsil ajratib olindi. Hujayralarga 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) yoki tashuvchi bilan ishlov berilgan edi. Hujayralar tarkibida 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriy dodesil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) va 0,5% natriy dezoksixolat (Merck) boʻlgan bufer bilan lizis qilindi. Hujayra lizatiga sikl 1 va amplituda 80 sozlamalarida 2 × 10 s davomida ultratovush bilan ishlov berish uchun UP50H ultratovush protsessori (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germaniya) ishlatildi. Shundan keyin material 14 000 rpm da 10 min tsentrifugalandi va choʻkma ustidagi suyuqlik Western blotting uchun ishlatildi. Yigirma besh μg oqsil namuna buferi va qaytaruvchi reagent (Invitrogen) ichida qaynatildi, soʻng 4–12% poliakrilamid gellari (Invitrogen) yordamida SDS-PAGE orqali ajratildi va nitrotsellyuloza membranasiga (GE health care) oʻtkazildi. Membrana tarkibida 1% kazein (Sigma-Aldrich) va 1% Tris (1 M) boʻlgan TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) bilan 1 h bloklandi. Bloklashdan keyin membrana birlamchi antitana (quyonda olingan, inson CBS siga qarshi antitana, 1/500; Prof. R. Banerjee laboratoriyasida ishlab chiqilgan, Ann Arbor, MI, AQSh) bilan 4°C da tun davomida yengil aralashtirish ostida inkubatsiya qilindi. Xren peroksidazasi (HPR) bilan konʼyugatsiyalangan ikkilamchi antitana (Dako) bilan inkubatsiya xona haroratida 1 h davomida oʻtkazildi. Barcha blotlar kuchaytirilgan xemilyuminessensiya (Perkin Elmer) yordamida vizuallashtirildi.
 

Hujayralarni ultratovush yordamida lizis qilish va ekstraksiya, lizat tayyorlash boʻyicha eng yaxshi amaliyotlar hamda jarayonni yaxshilash tavsiyalari haqida batafsil oʻqish uchun shu yerni bosing!
 
Quyidagi jadval laboratoriya oʻlchamidagi ultratovush qurilmalarimizning taxminiy ishlov berish quvvati haqida tasavvur beradi:

Adabiyotlar / Manbalar

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.