Hielscher Ultrasonics
Jarayoningizni muhokama qilishdan mamnun bo'lamiz.
Bizga qo'ng'iroq qiling: +49 3328 437-420
Bizga xat yuboring: info@hielscher.com

Western Blotting uchun ultratovushli lizis

  • Western blot - bu to'qima gomogenati yoki hujayra ekstrakti namunasida o'ziga xos oqsillarni aniqlash uchun analitik protsedura.
  • Western blotni o'tkazish yoki ferment faolligini o'lchash uchun ko'plab tahlillar hujayra ichida joylashgan materiallarga (masalan, oqsillar, DNK, hujayra osti bo'laklari) kirishni talab qiladi.
  • Sonication - nazorat ostida hujayra buzilishi va lizis uchun ishonchli va oson ishlov berish usuli.

Ultrasonik hujayra buzilishi

To'qimalardan va o'stirilgan hujayralardan oqsil olish ko'plab biologik, biokimyoviy va analitik usullar (PAGE, Western blotting, Elishay, mass-spektrometriya va boshqalar) yoki oqsillarni tozalash uchun birinchi qadamdir. Yuqori protein hosilini olish uchun hujayra materiali va to'qimalari samarali ravishda buzilishi/lizislanishi kerak. O'simlik hujayrasi yoki hayvon to'qimasidan qat'i nazar, sonikatsiya sizning hujayra lizatini oson va tez tayyorlash usulidir.

Sonikatsiyaning afzalliklari

  • Tez & Samarali
  • Oson ishlash
  • yuqori protein hosildorligi
  • takrorlanadigan / takrorlanadigan
  • aniq nazorat qilinadi
  • kengaytiriladigan

Ma'lumot so'rovi







Hielscher's VialTweeter bir nechta namunalarni parchalash uchun ideal

VialTweeter sonikatori hujayra buzilishi va oqsil izolyatsiyasi kabi ultratovush namunasini tayyorlash uchun

G'arbiy immunoblotting uchun immunoprecipitatsiya protokoli

A. Reaktivlar

Eritmalarni tayyorlash uchun Milli-Q kabi tozalangan suvdan foydalaning.

  • 1X fosfat tamponlangan tuz (PBS)
  • 1X Hujayra lizis buferi: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriy pirofosfat, 1 mM b-glitse, Na11V1Om4, mkg/ml Leupeptin
    Muhim: foydalanishdan oldin darhol 1 mM PMSF qo'shing.
  • IP uchun 15 mkl Protein A+15 mkl Protein G yetarli, lekin u asosiy antikor va namuna hajmiga bog‘liq bo‘lishi mumkin. Bundan tashqari, oldindan aralashtirilgan protein A/G agarozasidan foydalanishingiz mumkin (masalan, quyon IgG uchun A oqsili va sichqoncha IgG uchun G oqsili)
  • 3X SDS namuna buferi: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 da 25°C), 6% w/v SDS, 30% glitserin, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromofenol ko‘k

B. Hujayra lizatlarini tayyorlash

  • Hujayralarni yig'ib oling. Hujayralarni denaturatsiya qilinmagan sharoitda yig'ish uchun ommaviy axborot vositalarini olib tashlang va hujayralarni muzli PBS bilan bir marta yuving.
  • PBSni olib tashlang va har bir plastinkaga (10 sm) 0,5 ml muzdek sovuq 1X hujayra lizis buferini qo'shing va plitalarni muz ustida 5 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.
  • Plitalardan hujayralarni qirib tashlang va mikrosentrifuga naychalariga o'tkazing. Muz ustida turing.
  • Muzli sovuq immunoprecipitatsiya tamponida ikki marta 10 soniya davomida sonikatsiya qiling (IP buferi: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 va proteaz inhibitori aralashmasi). Sonikatsiya uchun VialTweeter yoki zond ultratovush apparati UP100H yoki UP200Ht eng mos keladi.
  • Lizatlarni 15000 g da 10 daqiqa davomida 4°C da santrifüj qiling.
  • Supernatantni yangi naychaga o'tkazing. (Agar kerak bo'lsa, lizat -80 ° C da saqlanishi mumkin.)
  • Supernatantga birlamchi antikor qo'shing. Birlamchi antikorga ega bo'lgan supernatant 1 soat davomida 4 ° C da engil aralashtirish ostida inkubatsiya qilinadi. Birlamchi antikor odatda western blotting uchun ishlatiladiganidan 10 baravar ko'proq konsentrlangan miqdorda qo'shiladi. (100 mkl uchun 1 mkg dan boshlashingiz mumkin.)
  • Keyin supernatant yana 1 soat davomida teng miqdorda Protein A-agaroz (Invitrogen) va Protein G agaroza aralashmasi bilan inkubatsiya qilinadi.
  • Agaroz pelletlarini IP tampon bilan uch marta yuving. Shundan so'ng, SDS-PAGE yuklash buferi bilan bog'langan oqsillarni 95 ° C da 5 daqiqa qizdirish orqali ajratib oling.

C. Immunitetning pasayishi

  • 200 mkl hujayra lizatini oling va birlamchi antikor qo'shing. Kechasi 4 ° C da yumshoq silkitib inkubatsiya qiling.
  • Protein A yoki G agaroz boncuklarini qo'shing (20 mkl 50% boncuk atala). 4 ° C da 1-3 soat davomida yumshoq silkitish bilan inkubatsiya qiling.
  • 4°C da 30 soniya davomida mikrotsentrifuga qiling. Peletni besh marta 500 µl 1X hujayra lizis buferi bilan yuving. Yuvish paytida muz ustida saqlang.
  • Pelletni 20 mkl 3X SDS namuna buferi bilan qayta suspenziya qiling. Vorteks, keyin 30 soniya davomida mikrotsentrifuga.
  • Namunani 2-5 daqiqa davomida 95-100 ° S gacha qizdiring va 14000 X g da 1 daqiqa davomida mikrosentrifuga qiling.
  • Namunani (15–30 mkl) SDS-PAGE jeliga (12–15%) yuklang.
  • Western blotting usuli bilan namunani tahlil qiling.

Sonicator UP50H bilan Western Blot tahlili

Kriebisch va boshqalarni o'rganishda prob tipidagi sonikator UP50H yordamida quyidagi protokol ishlatilgan. (2011):
Ultrasonik prob tipidagi gomogenizator UP50H odatda hujayralarni buzish va oqsillarni izolyatsiyalash uchun Western Blottingdan oldin namuna tayyorlash bosqichi sifatida ishlatiladi.Umumiy protein 1,25 (OH) bilan ishlangan MC3T3-E1 hujayralaridan ajratilgan.2D3 (10−8 M) yoki transport vositasi. Hujayralar 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich) ni o'z ichiga olgan bufer bilan lizing qilindi; 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriy dodesil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) va 0,5% natriy deoksixolat (Merck). Hujayra lizatasi 1-siklda 2 × 10 s va amplituda 80 ultratovush bilan sonikatsiya qilindi. UP50H ultratovushli protsessor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germaniya). Shundan so'ng, material 14000 rpm da 10 daqiqa davomida santrifüj qilindi va supernatant Western bloting uchun ishlatilgan. Yigirma besh mkg oqsil namuna buferida va qaytaruvchi vositada (Invitrogen) qaynatiladi va keyinchalik 4-12% poliakrilamid jellari (Invitrogen) yordamida SDS-PAGE orqali ajratildi va nitroselüloz membranasiga o'tkazildi (GE Healthcare). Membrana 1% kazein (Sigma-Aldrich) va 1% Tris (1 M) o'z ichiga olgan TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) bilan 1 soat davomida bloklandi. Bloklashdan so'ng, membrana birlamchi antikor (quyon anti-inson CBS 1/500, professor R. Banerji, Ann Arbor, MI, AQSh) laboratoriyasida ishlab chiqilgan 4 ° C haroratda kechasi engil qo'zg'atish bilan inkubatsiya qilindi. Horseradish peroksidaza (HPR) bilan konjugatsiyalangan ikkilamchi antikor (Dako) bilan inkubatsiya xona haroratida 1 soat davomida amalga oshirildi. Barcha blotlar yaxshilangan xemiluminesans (Perkin Elmer) tomonidan ishlab chiqilgan.
 

Ushbu qo'llanmada laboratoriyalarda liziz, hujayra buzilishi, oqsil izolyatsiyasi, DNK va RNK parchalanishi, tahlil va tadqiqotlar kabi namuna tayyorlash vazifalaringiz uchun qaysi turdagi sonikator eng yaxshi ekanligini tushuntiradi. Ilovangiz, namuna hajmi, namuna raqami va o'tkazish qobiliyati uchun ideal sonikator turini tanlang. Hielscher Ultrasonics siz uchun ideal ultratovushli homogenizatorga ega!

Fan va tahlilda hujayra buzilishi va oqsil olish uchun mukammal sonikatorni qanday topish mumkin

Video eskizi

 

Ultrasonik hujayra parchalanishi va ekstraktsiyasi, lizat tayyorlash va jarayonni yaxshilash bo'yicha tavsiyalar bo'yicha eng yaxshi amaliyotlar haqida ko'proq ma'lumot olish uchun bu yerni bosing!
 
Quyidagi jadvalda laboratoriya o'lchamidagi ultratovush apparatlarining taxminiy qayta ishlash quvvati ko'rsatilgan:

Tavsiya etilgan qurilmalar To'plam hajmi Oqim darajasi
UIP400MTP 96-quduqli plitali sonikator ko'p quduqli / mikrotitrli plitalar na
Ultrasonik kubok Flakonlar yoki stakan uchun CupHorn na
GDmini2 ultratovushli mikro-oqimli reaktor na
VialTweeter 0,5 dan 1,5 ml gacha na
UP100H 1 dan 500 ml gacha 10 dan 200 ml / min
UP200Ht, UP200St 10 dan 1000 ml gacha 20-200 ml/min
UP400St 10 dan 2000 ml gacha 20 dan 400 ml / min
Ultrasonik elak silkitgich na na

Biz bilan bog'lanish! / Bizdan so'rang!

Qo'shimcha ma'lumot olish uchun so'rang

Western Blots-dan oldin namuna tayyorlash uchun sonikatorlarimiz, batafsil dastur protokollari va narxi haqida qo'shimcha ma'lumot so'rash uchun quyidagi shakldan foydalaning. Biz siz bilan namuna tayyorlash jarayonini muhokama qilishdan va sizning talablaringizni qondiradigan ultratovush tizimini taklif qilishdan mamnun bo'lamiz!









Iltimos, bizning Maxfiylik siyosati.




Mikroplastinkalar, ko'p quduqli plitalar, PCR plitalari va 96 quduqli plitalar UIP400MTP plastinka sonikatori yordamida qulay va bir xilda sonikatsiyalanishi mumkin.

UIP400MTP plastinka sonikatori 96-quduqli plitalarning yuqori o'tkazuvchanlik sonikatsiyasi uchun



Western Blotting haqida

Blotlar - bu DNK, RNK va oqsillar ajratilishi uchun tashuvchiga o'tkaziladigan analitik protseduralar.
Southern blot DNKni aniqlash uchun ishlatiladi, Shimoliy blot RNK uchun va Western blot oqsillar uchun.
Western blotting, shuningdek, protein immunoblotting deb ataladi, chunki antikor uning antijenini aniq aniqlash uchun ishlatiladi. Western Blotting namunadagi maxsus oqsillarni aniqlash uchun eng muhim tahlil usullaridan biridir. Western blotda oqsillar monoklonal yoki poliklonal antikorlar yordamida ularni aniqlash uchun membranalarda immobilizatsiya qilinadi.
SDS-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) orqali mahalliy oqsillar 3-D strukturasi yoki polipeptid uzunligi bo'yicha denatüratsiyalangan oqsillar bilan ajratiladi. Keyin oqsillar membranaga (odatda nitroselüloza yoki PVDF) o'tkaziladi, u erda ular maqsadli oqsilga xos antikorlar bilan bo'yaladi. Jel elektroforez bosqichi antikorlarning o'zaro reaktivligi masalasini hal qilish uchun western blot tahliliga kiritilgan.
Shundan so'ng, ajratilgan oqsillar matritsaga (asosan nitroselüloza yoki PVDF membranasiga) bo'yaladi, u erda ular antikorlar bilan bo'yaladi. Antikorlar zond vazifasini bajaradi va maqsadli oqsil uchun maxsus tanlanadi. Muayyan reaktsiyaning joylashuvi va intensivligini tahlil qilish, berilgan namunadagi maqsadli oqsillarning ifoda tafsilotlarini ochib beradi. Western blotting jel elektroforezining yuqori aniqligi va immunoassayning kuchli o'ziga xosligi va yuqori sezuvchanligi tufayli 1ng ga teng bo'lgan maqsadli oqsilni aniqlashi mumkin. Western blot usuli molekulyar biologiya, biokimyo, immunogenetika va boshqa molekulyar tadqiqot sohalarida qo'llaniladi.
Boshqa tegishli usullar orasida nuqta tahlili, immunohistokimyo va immunotsitokimyo mavjud bo'lib, bunda antikorlar to'qimalar va hujayralardagi oqsillarni immuno-bo'yash orqali aniqlash uchun ishlatiladi va ferment bilan bog'liq immunosorbent tahlili (ELISA).


Adabiyot / Adabiyotlar

VialTweeter-ni to'liq sozlash: UP200St ultratovush protsessorida VialTweeter sonotrode

VialTweeter sonikatori bir vaqtning o'zida bir nechta flakonlardan namuna tayyorlash uchun

Biz bilan bog'lanish! / Bizdan so'rang!





Iltimos, bizning Maxfiylik siyosati.




Namuna tayyorlash jarayonida sonikatsiya muhim bosqichdir

Namuna sonication uchun mikro-uchli UP200St

Jarayoningizni muhokama qilishdan mamnun bo'lamiz.

Keling, aloqaga chiqamiz.