Ultratovush bilan ishlov berish orqali plazmid tayyorlash

Ultratovush bilan ishlov berish plazmid DNKsini fragmentlarga ajratishning ishonchli usulidir. Aniq boshqariladigan amplituda, impulsli rejim va haroratni nazorat qilish plazmidni shikastlamasdan fragmentlarga ajratish uchun ultratovush qurilmasining eng muhim xususiyatlaridir. Bundan tashqari, ayrim moddalardan foydalanish plazmidni degradatsiyadan himoya qilishga yordam beradi. Hielscher Ultrasonics alohida flakonlardagi plazmidlarni nazorat ostida fragmentlarga ajratish, koʻplab namunalarga bir vaqtda ultratovush bilan ishlov berish, shuningdek, koʻp uyachali plastinkalarga ishlov berish uchun turli yechimlarni taklif etadi. Plazmidlarni ultratovush yordamida muvaffaqiyatli fragmentlarga ajratish haqida koʻproq bilib oling!

Ultratovush bilan ishlov berish orqali plazmidni siljish kuchlari yordamida parchalash

DNK namunalariga ultratovush toʻlqinlari taʼsir ettirilganda, ultratovush hosil qilgan tebranishlar suyuqlikda akustik kavitatsiyani yuzaga keltiradi; u mexanik kuchlar orqali yuqori molekulyar massali DNK molekulalarini siljish kuchlari yordamida parchalaydi yoki uzadi. Ultratovush bilan ishlov berish DNKni katta miqdorda siljish kuchlari yordamida parchalash tajribalarida eng keng qoʻllaniladigan usuldir. Bunga yuqori ajrata olish qobiliyatiga erishish uchun kichik fragment oʻlchamlari mutlaqo zarur boʻlgan xromatin immunopretsipitatsiyasi (ChIP) kabi qoʻllanmalar ham kiradi. (qarang: Tseng et al., 2012)
Plazmid DNKsi (pDNA) halqasimon shakli bilan tavsiflanadigan DNKning oʻziga xos turi boʻlib, bakteriyalar va ayrim eukariotlarda uchraydi.
Superoʻralgan pDNA plazmid DNKsining kerakli shaklidir, chunki u avtomatlashtirilgan sekvenslash va transfeksiya kabi keyingi jarayonlarda eng yaxshi natijalarni koʻrsatadi. Ultratovush bilan ishlov berish pDNAni, jumladan, superoʻralgan pDNAni muvaffaqiyatli fragmentlarga ajratishga mos keladi.
Thompson et al. (2008) superoʻralgan DNKni fragmentlarga ajratishi maʼlum boʻlgan plazmidga ultratovush bilan ishlov berish ketma-ketlikning phred20 sifatidagi oʻqish uzunliklarini Beckman Coulter nazorat matritsasi yoki fermentativ usulda chiziqlashtirilgan plazmidlarnikidan sezilarli farq qilmaydigan darajagacha oshirishning samarali usuli ekanini koʻrsatgan.

Plazmid vektorlaridan foydalanish

Plazmidlar koʻpincha genlarni klonlash, koʻchirish va oʻzgartirish vositalari sifatida ishlatiladi. Plazmidlar tajribalarda shu maqsadlarda ishlatilganda, ular vektorlar deb ataladi. DNK fragmentlari yoki genlar plazmid vektoriga kiritilib, rekombinant plazmid deb ataladigan tuzilma hosil qilinishi mumkin. Plazmid vektorlari rekombinant DNKni xoʻjayin hujayraga kiritish vositalari sifatida ishlatiladi va molekulyar klonlashning asosiy tarkibiy qismidir.
«Virus boʻlmagan vektorlardan turli murakkab kasalliklarni davolash uchun gen terapiyasida foydalanish imkoniyatlari keng oʻrganilmoqda. Virus boʻlmagan vektorlar plazmid DNKsini fizik, kimyoviy va fermentativ degradatsiyadan himoya qiladi hamda DNK molekulasini maqsadli joyga yetkazadi. Masalan, kationli liposomalar, xitozan va boshqa musbat zaryadlangan nanozarrachalar elektrostatik oʻzaro taʼsirlar orqali plazmid DNKsi bilan komplekslar hosil qiladi. Biroq oson hosil boʻladigan kationli liposomalar/plazmid DNKsi komplekslari nisbatan yirik (yaʼni, 300–400 nm) va tabiatan geterogen boʻlib, bu ularni farmatsevtik qoʻllanmalarda ishlatishni qiyinlashtiradi. Yirik va geterogen plazmid DNKsi/liposomalar, plazmid DNKsi/aerozollar va plazmid DNKsi/peptidlar komplekslarini ultratovush bilan ishlov berish orqali kichikroq va bir jinsli zarrachalarga aylantirish mumkin.» (Sarker et al., 2019)
Plazmid vektorlaridan foydalanishning yorqin misoli CRISPR–Cas9 hisoblanadi. CRISPR–Cas9 tizimi odatda hujayralarga maqsadli ketma-ketlik, CRISPR yoʻnaltiruvchisi va Cas9 ni kodlaydigan bitta katta plazmid yoki bir nechta kichikroq plazmid shaklida yetkaziladi.

Nanopretsipitatsiya orqali DNK yuklangan PLGA nanozarrachalarini ultratovush yordamida tayyorlash

Jo et al. (2020) namunaviy CRISPR–Cas9 plazmidini suyak iligidan olingan birlamchi makrofaglarga yetkazish uchun nanozarracha tashuvchisini hosil qilish maqsadida poli(sut-ko-glikol kislota) (PLGA) ishlatgan. PLGA nanozarrachalarini nanopretsipitatsiya qilish uchun ikki xil terminal guruhli (ester va amin guruhlari) PLGA ishlatilgan. Bunda musbat zaryadlangan terminal amin guruhlari bilan DNKning manfiy zaryadlangan asosiy zanjiri oʻrtasidagi zaryad oʻzaro taʼsirlari tufayli inkapsulyatsiya samaradorligi va yuklanishni oshirish maqsad qilingan. 50 mL hajmli polipropilen konussimon sentrifuga probirkasida 100 mg Pluronic F127 vorteks yordamida aralashtirish orqali 20 mL avtoklavlangan deionlashtirilgan suvda eritilgan, soʻng ultratovushli vannada 30 min davomida yumshoq ultratovush bilan ishlov berilgan (CupHorn ga qarang). Avtoklavlangan magnit aralashtirgich tayoqchasi qoʻshilgan va boshqa eritmalar tayyorlanayotgan paytda eritma 600 RPM tezlikda 30 min davomida aralashtirilgan. DNKning nospetsifik adsorbsiyasini minimallashtirish uchun butun jarayon davomida shisha idishlar oʻrniga plastik laboratoriya idishlari ishlatilgan. DMFda eritilgan PLGA (44,48 mg/ ml) va THFda eritilgan TIPS pentatsen (0,667 mg/ml) eritmalari alohida tayyorlangan. PLGAga 30 min davomida ultratovush bilan ishlov berishdan oldin, u DMFda namlanishi uchun 30 min tinch holatda qoldirilgan. (toʻliq protokol uchun Jo et al., 2020 ga qarang)

Ultratovush bilan ishlov berish paytida plazmid DNKsini himoya qilish

DNK, jumladan, plazmidlar va superoʻralgan plazmidlar degradatsiyaga juda sezgir. Fragmentlarga ajratishning mavjud barcha usullari muayyan kamchiliklari bilan maʼlum. DNKni ultratovush yordamida fragmentlarga ajratish afzal koʻriladigan usullardan biridir, chunki nazorat qilinadigan ultratovush bilan ishlov berishni himoya choralari bilan birga qoʻllash DNK zanjirlarining siljish kuchlari va issiqlik taʼsirida shikastlanishini kamaytirishga imkon beradi.
DNKni ultratovush yordamida siljish kuchlari bilan parchalash paytida past amplituda sozlamalari, impulsli rejim va harorat nazoratidan tashqari, ayrim moddalardan foydalanish DNK degradatsiyasiga qarshi sezilarli himoya taʼsirini koʻrsatgan. Masalan, turli polimerlar, peptidlar va lipidlar ultratovush bilan ishlov berish paytida plazmid DNKsini himoya qiladi.

Plazmid DNKsi va plazmid DNKsi/IL nanokomplekslarining ultratovush hosil qiladigan siljish kuchlanishiga chidamliligi agaroza gel elektroforezi tahlili yordamida oʻrganilgan. Plazmid DNKsi ham, plazmid DNKsi/IL nanokomplekslari ham turli vaqt davomida ultratovush hosil qiladigan siljish kuchlanishiga duchor qilingan. Plazmid DNKsiga 0, 10, 20, 30 va 40 daqiqa davomida ultratovush hosil qiladigan siljish kuchlanishi taʼsir ettirilgan. Plazmid DNKsi/IL nanokomplekslariga esa 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 va 120 daqiqa davomida ultratovush hosil qiladigan siljish kuchlanishi taʼsir ettirilgan.
(tadqiqot va rasm: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) plazmid DNKsi / ionli suyuqlik (pDNA/IL) nanotuzilmalariga 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 va 120 min davomida ultratovush hosil qiladigan siljish kuchlanishi taʼsir ettirilib, ular savdoda mavjud boʻlgan kationli gen yetkazish vositasi lipofektamin bilan kompleks hosil qilganda, fluoressensiya-musbat hujayralar ulushi mos ravishda 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% va 50% boʻlganini koʻrsatgan (quyidagi diagrammaga qarang). Nanotuzilmalarga 10 va 20 min davomida ultratovush hosil qiladigan siljish kuchlanishi taʼsir ettirilganda fluoressensiya-musbat hujayralar ulushi oshgan, keyin esa asta-sekin kamaygan.

Ionli suyuqlik [Bmim][PF6] ning plazmid DNKsini COS7 hujayralariga yetkazishga taʼsiri. Plazmid DNKsi/IL (ionli suyuqlik) nanokomplekslariga 120 daqiqagacha ultratovush hosil qiladigan siljish kuchlanishi taʼsir ettirilgan va COS7 hujayralariga yetkazilishidan oldin ular LA bilan kompleks hosil qilgan. Maʼlumotlar 10 ta turli mikroskopik koʻrish maydonida sanalgan GFP-musbat HeLa hujayralarining oʻrtacha sonini (%) koʻrsatadi va tajriba uch xil kunda bir necha marta bajarilgan. (Tadqiqot va diagramma: ©Sarker et al., 2019)

Lizatni ultratovush yordamida tayyorlash

Hujayralarni ultratovush yordamida lizis qilish protokoli
Hujayralarni ajratish usuli (masalan, immunomagnit hujayra ajratish, fluoressensiya bilan faollashtirilgan hujayra saralash (FACS), zichlik gradiyentida sentrifugalash, immunozichlik asosida hujayra ajratish) orqali tayyorlangan, hujayralar bilan boyitilgan namunadan boshlang.
Hujayra namunalaridagi lizis buferining hajmi tajriba maqsadiga va zondli ultratovush qurilmasiga mos boʻlishi kerak.
Gipotonik buferlar afzal koʻriladi, chunki ular hujayralarning ultratovush yordamida lizis qilinishini kuchaytiradi. Qoʻshimchalar va tuz konsentratsiyasidan tegishli tarzda foydalanish muhimdir.
Ultratovushli lizis qurilmangizni tanlang: flakonlarga bilvosita ultratovush bilan ishlov berish uchun VialTweeter yoki CupHorn tavsiya etiladi. Koʻp uyachali plastinkalar uchun UIP400MTP ideal ultratovush qurilmasidir. Klassik zondli ultratovush bilan ishlov berish uchun esa mikro uchlikli UP100H yoki UP200Ht kabi ultratovushli gomogenizator eng mos keladi.
Zondli ultratovush bilan ishlov berish protokoli: Ultratovush qurilmasi zondini mikrosentrifuga probirkasidagi namuna ichiga joylashtiring va taxminan 10 soniya davomida ultratovush bilan ishlov bering. DNK namunasiga qarab, ultratovush bilan ishlov berish yana bir yoki ikki marta takrorlanishi mumkin. Kerakli ultratovush energiyasi kiritilishi (Ws/mL) namunaning qovushqoqligi va DNK turiga bogʻliq. Muzli vanna orqali sovitish va ultratovush qurilmasining impulsli rejimi namunaning issiqlik taʼsirida degradatsiyaga uchrashining oldini olishga yordam beradi.
Ultratovushli lizisdan soʻng namuna choʻkma qoldiqlarini (lizisga uchramagan hujayralar, yadrolar va lizisga uchramagan organellalarni oʻz ichiga oladi) ajratish uchun sentrifugalanadi.
Agar namunaga darhol keyingi ishlov berilmasa, uning yashovchanligini saqlash uchun uni tegishli haroratda saqlash mumkin, saqlash mumkin.

DNKni fragmentlarga ajratish uchun ultratovush qurilmalari

Hielscher Ultrasonics DNK, RNK va xromatinni fragmentlarga ajratish uchun ultratovushga asoslangan turli platformalarni taklif etadi. Ushbu platformalarga ultratovush zondlari (sonotrodlar), bir nechta probirka yoki koʻp uyachali plastinkalardagi (masalan, 96 uyachali plastinkalar, mikrotitr plastinkalari) namunalarni bir vaqtda tayyorlash uchun bilvosita ultratovush bilan ishlov berish yechimlari, sonoreaktorlar va ultratovushli cuphorn qurilmalari kiradi. DNKni siljish kuchlari yordamida parchalash uchun barcha platformalar aniq boshqariladigan va takroran olinadigan natijalarni taʼminlaydigan, chastotasi sozlangan yuqori unumdorlikdagi ultratovush protsessorlari bilan ishlaydi.

Istalgan namuna soni va hajmi uchun ultratovush protsessorlari

Hielscher kompaniyasining koʻp namunaga ishlov beruvchi VialTweeter (10 tagacha probirka uchun) va UIP400MTP (mikroplastinkalar/ koʻp uyachali plastinkalar uchun) ultratovush qurilmalari bilan kuchli va aniq boshqariladigan ultratovush bilan ishlov berish tufayli namunalarga ishlov berish vaqtini osonlik bilan qisqartirish, shu bilan birga DNK fragmentlarining kerakli oʻlcham taqsimoti va chiqishini olish mumkin. DNKni ultratovush yordamida fragmentlarga ajratish plazmid tayyorlash bosqichlarini samarali, ishonchli va koʻlamini oʻzgartirish mumkin boʻlgan jarayonlarga aylantiradi. Doimiy ultratovush parametrlarini qoʻllash orqali protokollar koʻlamini bitta namunadan koʻplab namunalargacha chiziqli ravishda oshirish mumkin.
Birdan beshtagacha barmoqsimon qismga ega zondli ultratovush qurilmalari kamroq sondagi namunalarni tayyorlash uchun idealdir. Hielscher laboratoriya ultratovush qurilmalari turli quvvat darajalarida mavjud, shuning uchun DNK bilan bogʻliq qoʻllanmangiz uchun ideal ultratovushli parchalagichni tanlashingiz mumkin.