Ultrasonication yordamida plazmid tayyorlash
Ultrasonikatsiya plazmid DNKni parchalashning ishonchli usuli hisoblanadi. Aniq boshqariladigan amplituda, pulsatsiya rejimi va haroratni nazorat qilish ultrasonikatorning zarar etkazmaydigan plazmid parchalanishi uchun eng muhim xususiyatlari hisoblanadi. Bundan tashqari, ma'lum vositalardan foydalanish plazmid degradatsiyasidan himoya qilishga yordam beradi. Hielscher Ultrasonics bitta flakonlardan boshqariladigan plazmid parchalanishi, bir vaqtning o'zida ko'p sonli namunalar va ko'p quduqli plitalar uchun turli xil echimlarni taklif qiladi. Muvaffaqiyatli ultratovushli plazmid parchalanishi haqida ko'proq bilib oling!
UIP400MTP ko'p quduqli plitalarning aniq nazorat ostida ultratovushlanishiga imkon beradi. UIP400MTP ning ilovalaridan biri bu maxsus maqsadli uzunlikdagi fragmentlarni olish uchun plazmid DNKning parchalanishidir.
Ultrasonikatsiya yordamida plazmidlarni kesish
DNK namunalari ultratovush to'lqinlariga duchor bo'lganda, ultratovushli tebranishlar suyuqlikda akustik kavitatsiya hosil qiladi, bu mexanik kuchlar orqali yuqori molekulyar og'irlikdagi DNK molekulalarini kesadi yoki buzadi. Sonikatsiya - bu DNKni ko'paytirish bo'yicha tajribalar uchun eng keng tarqalgan usul bo'lib, Xromatin Immunoprecipitation (ChIP) kabi ilovalar, ular uchun kichik bo'lak o'lchamlari yuqori aniqlikni olish uchun juda muhimdir. (Qarang: Tseng va boshqalar, 2012)
Plazmid DNK (pDNK) DNKning o'ziga xos shakli bo'lib, uning halqa shakli bilan ajralib turadi va bakteriyalar va ba'zi eukariotlarda uchraydi.
Supercoiled pDNK plazmid DNKning kerakli shaklidir, chunki u avtomatlashtirilgan ketma-ketlik va transfeksiya kabi quyi oqim jarayonlarida eng yaxshi natijalarni ko'rsatadi. Ultrasonikatsiya pDNKni, shu jumladan super o'ralgan pDNKni muvaffaqiyatli parchalash uchun javob beradi.
Tompson va boshqalar. (2008) supero'ralgan DNKni parchalashi ma'lum bo'lgan plazmid sonikatsiyasi phred20 ketma-ketligini o'qish uzunligini Bekman Koulterning nazorat shablonidan yoki fermentativ chiziqli plazmidlardan sezilarli darajada farq qilmaydigan darajada yaxshilashning samarali usuli ekanligini ko'rsatdi.
- aniq boshqarilishi mumkin
- Qayta tiklanadigan natijalar
- Maqsadli DNK fragmenti uzunligiga qarab sozlanishi
- Haroratni nazorat qilish
- Har qanday namuna o'lchamiga kengaytirilishi mumkin
Plazmid vektorlardan foydalanish
Plazmidlar ko'pincha genlarni klonlash, uzatish va manipulyatsiya qilish uchun vosita sifatida ishlatiladi. Ushbu maqsadlar uchun plazmidlar eksperimental ravishda ishlatilsa, ular vektorlar deb ataladi. DNK fragmentlari yoki genlari plazmid vektoriga kiritilib, rekombinant plazmid deb ataladigan hosil bo'lishi mumkin. Plazmid vektorlari rekombinant DNKni xost hujayralariga olib kirish uchun vosita sifatida ishlatiladi va molekulyar klonlashning asosiy komponenti hisoblanadi.
“Virusli bo'lmagan vektorlar turli xil murakkab kasalliklarni davolash uchun gen terapiyasida potentsial foydalanish uchun keng qamrovli o'rganilmoqda. Virusli bo'lmagan vektorlar plazmid DNKni fizik, kimyoviy va fermentativ buzilishdan himoya qiladi va DNK molekulasini maqsadli joyga etkazib beradi. Masalan, kationik lipozomalar, xitozan va boshqa musbat zaryadlangan nanozarrachalar elektrostatik oʻzaro taʼsirlar orqali plazmid DNK bilan komplekslar hosil qiladi. Shu bilan birga, oson hosil bo'lgan kationik lipozomalar/plazmid DNK komplekslari nisbatan katta (ya'ni, 300-400 nm) va tabiatda heterojen bo'lib, ularni farmatsevtikada qo'llash qiyin. Katta va heterojen plazmid DNK/lipozomalar, plazmid DNK/aerozollar va plazmid DNK/peptidlar komplekslari ultratovush yordamida kichikroq va bir hil zarrachalarga qisqartirilishi mumkin.” (Sarker va boshqalar, 2019)
Plazmid vektorlaridan foydalanishning yorqin namunasi CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 tizimi odatda hujayralarga maqsadli ketma-ketlikni, CRISPR yo'riqnomasini va Cas9ni kodlaydigan bitta katta plazmid yoki bir nechta kichikroq plazmidlar sifatida etkazib beriladi.
DNK yuklangan PLGA nanopartikullarini nanopresipitatsiya orqali ultratovushli tayyorlash
Jo va boshqalar. (2020) CRISPR-Cas9 model plazmidini birlamchi suyak iligidan olingan makrofaglarga etkazib berish uchun nanozarracha tashuvchisini hosil qilish uchun poli(laktik-ko-glikolik kislota) (PLGA) dan foydalangan. PLGA nanopartikullarini nanocho'ktirish uchun ikki xil so'nggi guruhlarga (ester va amin guruhlari) ega PLGA musbat zaryadlangan amin so'nggi qopqoqlari u va manfiy zaryadlangan magistral o'rtasidagi zaryad o'zaro ta'siri tufayli kapsülleme samaradorligini va yuklanishini oshirish maqsadida ishlatilgan. DNK. 50 ml polipropilen konusli santrifüj trubkasida 100 mg Pluronic F127 20 ml avtoklavlangan DI suvda vorteks aralashtirish orqali eritildi, so'ngra ultratovushli vanna yordamida 30 daqiqa yumshoq sonikatsiya (qarang CupHorn). Avtoklavlangan magnit aralashtirgich qo'shildi va eritma 600 aylanish tezligida 30 daqiqa davomida aralashtiriladi, boshqa eritmalar tayyorlanadi. DNKning o'ziga xos bo'lmagan adsorbsiyasini kamaytirish uchun shisha idishlar o'rniga plastik laboratoriya idishlari ishlatilgan. DMF (44,48 mg / ml) va THF (0,667 mg / ml) da erigan TIPS pentasenda eritilgan PLGA eritmalari alohida tayyorlangan. PLGA 30 daqiqa davomida sonikatsiyadan oldin DMFda 30 daqiqa davomida ho'l bo'lishi uchun tinch qoldirildi. (to'liq protokol uchun qarang: Jo va boshqalar, 2020)
- DNKning ekstraktsiyasi
- DNKning inkapsulyatsiyasi
- Nanozarrachalar bilan qoplangan DNKning tarqalishi
- Plazmid DNKni hujayralarga etkazib berish
UP200St CupHorn namunalarni bilvosita sonikatsiya qilish uchun, masalan, DNKni ajratib olish va parchalash uchun.
Sonikatsiya paytida plazmid DNKni himoya qilish
DNK, shu jumladan plazmidlar va o'ta o'ralgan plazmidlar juda sezgir buzilishdir. Mavjud bo'lgan barcha parchalanish usullari ma'lum kamchiliklari bilan ma'lum. Ultrasonik DNK parchalanishi afzal qilingan usullardan biridir, chunki nazorat ostida sonikatsiya himoya choralari bilan birgalikda DNK zanjirlarining kesish va issiqlik ta'sirida shikastlanishini kamaytirishga imkon beradi.
Ultrasonik DNKni kesish paytida past amplituda sozlamalari, pulsatsiya rejimi va haroratni nazorat qilish bilan bir qatorda, ba'zi vositalardan foydalanish DNK degradatsiyasiga qarshi sezilarli himoya ta'sirini ko'rsatdi. Masalan, ultratovush paytida turli xil polimerlar, peptidlar va lipidlar plazmid DNKni himoya qiladi.
Plazmid DNK va plazmid DNK/IL nanokomplekslarining ultratovush kesish stressiga nisbatan barqarorligi agaroz gel elektroforez tahlili yordamida tekshirildi. Plazmid DNK va plazmid DNK/IL nanokomplekslari turli vaqt nuqtalari uchun ultratovushli kesish stressiga duchor bo'lgan. Plazmid DNK 0, 10, 20, 30 va 40 daqiqa davomida ultratovush kesish stressiga duchor bo'ldi. Biroq, plazmid DNK / IL nanokomplekslari 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 va 120 daqiqa davomida ultratovush kesish stressiga duchor bo'ldi.
(tadqiqot va rasm: ©Sarker va boshqalar, 2019)
Sarker va boshqalar. (2019) plazmid DNK / ionli suyuqlik (pDNK / IL) nanostrukturalari 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 va 120 daqiqa davomida ultratovush kesish stressiga duchor bo'lganida va tijoratda mavjud bo'lgan katyonik gen bilan murakkablashganini ko'rsatdi. etkazib berish agenti lipofektamin, floresan musbat hujayralar foizi 80% ni tashkil etdi, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% va 50% (quyidagi jadvalga qarang). Nanostrukturalar 10 va 20 daqiqa davomida ultratovush kesish stressiga duchor bo'lganda, lyuminestsent musbat hujayralar ulushi ortdi va keyin asta-sekin kamaydi.
Plazmid DNKning COS7 hujayralariga yetkazilishiga ionli suyuqlik [Bmim][PF6] ta'siri. Plazmid DNK / IL (ionli suyuqlik) nanokomplekslari 120 daqiqagacha ultratovushli kesish stressiga duchor bo'ldi va COS7 hujayralariga etkazib berishdan oldin LA bilan komplekslashtirildi. Ma'lumotlar 10 xil mikroskopik maydonlarda hisoblangan GFP musbat HeLa hujayralarining o'rtacha sonini (%) ko'rsatadi va tajriba uch xil kunda bir necha marta o'tkazildi. (O'rganish va jadval: ©Sarker va boshqalar, 2019)
Plazmid DNKni ultratovushli parchalanishdan oldin agent qo'shilishi bilan himoya qilish mumkin: yalang'och pDNK (A) va 1,5 mM CaCl2 va 20% (v/v) t-butanol (B) bilan tuzilgan pDNK ning sonikatsiya natijasida parchalanishi.
Namunalar har bir chiziqning tepasida ko'rsatilganidek, 20 Vt zond bilan 120 soniyagacha sonikatsiya qilindi. H qatori Hyperladder I ™️ belgisiga mos keladi. OC va SC plazmid diapazonlari ko'rsatilgan.
(tadqiqot va rasmlar: © Wu va boshqalar, 2009)
Ultrasonik lizat tayyorlash
Ultrasonik hujayra lizis protokoli
Hujayralarni ajratish usuli (masalan, immunomagnit hujayralarni ajratish, flüoresans bilan faollashtirilgan hujayralarni saralash (FACS), zichlik gradienti santrifüjlash, immunitet tanqisligi hujayra izolyatsiyasi) orqali tayyorlangan hujayralarning boyitilgan namunasidan boshlang.
Hujayra namunalari eksperimental maqsad va prob tipidagi ultratovush qurilmasiga mos keladigan lizis buferining hajmini ko'rsatishi kerak.
Gipotonik tamponlarga afzallik beriladi, chunki ular ultratovushli hujayra lizisini kuchaytiradi. Qo'shimchalar va tuz konsentratsiyasini to'g'ri ishlatish muhimdir.
Ultrasonik lizis qurilmangizni tanlang: flakonlarni bilvosita sonikatsiya qilish uchun VialTweeter yoki CupHorn tavsiya etiladi. Ko'p quduqli plitalar uchun UIP400MTP ideal ultratovushdir. Va klassik zond tipidagi sonikatsiya, mikro uchli UP100H yoki UP200Ht kabi ultratovushli gomogenizator eng mos keladi.
Prob tipidagi sonikatsiya uchun protokol: Ultrasonikator probini mikrosentrifuga trubkasidagi namuna hajmiga joylashtiring va taxminan sonikatsiya qiling. 10 soniya. DNK namunasiga qarab, sonikatsiya yana bir yoki ikki marta takrorlanishi mumkin. Kerakli ultratovush energiyasini kiritish (Ws / ml) namunaning yopishqoqligi va DNK turiga bog'liq. Ultrasonikatorning muzli vanna va pulsatsiya rejimi orqali sovutish namunaning termal degradatsiyasini oldini olishga yordam beradi.
Ultrasonik lizizdan so'ng, namuna pellet qoldiqlarini ajratish uchun santrifüj qilinadi (tarkibida parchalanmagan hujayralar, yadrolar va parchalanmagan organellalar mavjud)
Agar namuna darhol qayta ishlanmasa, uning hayotiyligini saqlab qolish uchun uni tegishli haroratda saqlash mumkin.
DNK parchalanishi uchun ultrasonikatorlar
Hielscher Ultrasonics DNK, RNK va xromatin parchalanishi uchun ultratovushga asoslangan turli platformalarni taklif etadi. Ushbu turli platformalarga ultratovushli zondlar (sonotrotlar), bir vaqtning o'zida bir nechta naychalar yoki ko'p quduqli plitalar (masalan, 96 quduqli plitalar, mikrotitr plitalari), sonoreaktorlar va ultratovushli kupalar namunalarini tayyorlash uchun bilvosita sonikatsion echimlar kiradi. DNKni kesish uchun barcha platformalar chastotali sozlangan, yuqori samarali ultratovushli protsessorlar bilan ishlaydi, ular aniq boshqarilishi mumkin va takrorlanadigan natijalarni beradi.
Har qanday namuna soni va hajmi uchun ultratovushli protsessorlar
Hielscherning ko'p namunali ultratovushli ultratovush apparatlari VialTweeter (10 tagacha probirka uchun) va UIP400MTP (mikroplastinkalar/ko'p quduqli plitalar uchun) yordamida intensiv va aniq boshqariladigan ultrasonikatsiya tufayli namunani qayta ishlash vaqtini osonlik bilan qisqartirish mumkin bo'ladi, shu bilan birga kerakli DNK fragmenti hajmi taqsimoti va rentabelligi olinadi. . Ultrasonik DNK parchalanishi plazmid tayyorlash bosqichlarini samarali, ishonchli va kengaytiriladigan qiladi. Protokollarni doimiy ultratovush parametrlarini qo'llash orqali bir nechta namunalargacha chiziqli o'lchash mumkin.
Bir-besh barmoqli probli ultratovush apparatlari kichikroq namuna raqamlarini tayyorlash uchun idealdir. Hielscher laboratoriyasining ultratovush apparatlari turli quvvat darajalarida mavjud bo'lib, siz DNK bilan bog'liq ilovangiz uchun ideal ultratovush disruptorni tanlashingiz mumkin.
Ultrasonik ko'p namunali tayyorlash birligi VialTweeter bir vaqtning o'zida 10 flakongacha sonikatsiya qilish imkonini beradi. VialPress qisqich moslamasi yordamida kuchli sonikatsiya uchun 4 tagacha qo'shimcha naychani old tomonga bosish mumkin.
jarayonni aniq nazorat qilish
Aniq nazorat qilinadigan sonikatsiya sozlamalari juda muhim, chunki to'liq sonifikatsiya DNK, RNK va xromatinni yo'q qilishi mumkin, ammo ultratovushning noto'g'ri kesishi juda uzun DNK va xromatin bo'laklariga olib keladi. Hielscher raqamli ultrasonikatorlari aniq sonication parametriga osongina o'rnatilishi mumkin. Muayyan sonikatsiya sozlamalari xuddi shu protsedurani tez takrorlash uchun dasturlashtirilgan sozlamalar sifatida ham saqlanishi mumkin.
Barcha sonikatsiya avtomatik ravishda protokollanadi va o'rnatilgan SD-kartada CSV fayli sifatida saqlanadi. Bu amalga oshirilgan sinovlarni aniq hujjatlashtirishga imkon beradi va sonikatsiya ishlarini osongina qayta ko'rib chiqish imkonini beradi.
Brauzerning masofadan boshqarish pulti orqali barcha raqamli ultrasonikatorlarni har qanday standart brauzer orqali boshqarish va kuzatish mumkin. Qo'shimcha dasturiy ta'minotni o'rnatish talab qilinmaydi, chunki LAN ulanishi juda oddiy plug-n-play sozlamasidir.
Ultrasonik DNKni tayyorlash paytida foydalanuvchi uchun eng qulaylik
Barcha Hielscher ultrasonikatorlari yuqori samarali ultratovushni etkazib berish uchun mo'ljallangan, shu bilan birga har doim juda qulay va ishlatish uchun qulay. Barcha sozlamalar aniq menyuda yaxshi tuzilgan, ularga rangli sensorli displey yoki brauzerning masofadan boshqarish pulti orqali osongina kirish mumkin. Dasturlashtiriladigan sozlamalar va avtomatik ma'lumotlarni yozib olish bilan aqlli dastur ishonchli va takrorlanadigan natijalar uchun optimal sonikatsiya sozlamalarini ta'minlaydi. Toza va ishlatish uchun qulay menyu interfeysi Hielscher ultrasonikatorlarini foydalanuvchilar uchun qulay va samarali qurilmalarga aylantiradi.
Quyidagi jadvalda hujayra lizisi va DNK parchalanishi uchun laboratoriyamiz ultratovush apparatlarining taxminiy qayta ishlash quvvati ko'rsatilgan:
| To'plam hajmi | Oqim darajasi | Tavsiya etilgan qurilmalar |
|---|---|---|
| ko'p quduqli plitalar | yo'q | UIP400MTP |
| flakonlar, kichik stakan | yo'q | Ultrasonik kubok |
| 10 flakongacha | yo'q | VialTweeter |
| 1 dan 500 ml gacha | 10 dan 200 ml / min | UP100H |
| 10 dan 2000 ml gacha | 20 dan 400 ml / min | UP200Ht, UP400St |
Biz bilan bog'lanish! / Bizdan so'rang!
Adabiyot / Adabiyotlar
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
Bilishga arziydigan faktlar
Plazmidlar nima?
Plazmid - bu xromosoma DNKsidan jismoniy jihatdan ajralib turadigan va mustaqil ravishda replikatsiya qilinadigan kichik dumaloq DNK molekulasi. Plazmidlar ko'pincha organizmning omon qolishiga hissa qo'shadigan va o'ziga xos afzalliklarni beruvchi genlar bilan bog'liq, masalan, antibiotiklarga qarshilik. Plazmidlar ko'pincha bakteriyalarda kichik dumaloq, ikki zanjirli DNK molekulalari sifatida topiladi; ammo plazmidlar ba'zan arxeya va eukaryotik organizmlarda mavjud. Plazmidlar molekulyar biologiya, genetika, biokimyo va hayot haqidagi fanlarning muhim vositalaridir. Gen muhandisligida vektorlar sifatida tanilgan plazmidlar ma'lum genlarni ko'paytirish yoki ifodalash uchun ishlatiladi. Vektorning maqsadli o'zgarishi vektor dizayni deyiladi.
Hujayra tadqiqotlarida GFP tahlili
Yashil lyuminestsent oqsil (GFP) fiziologik jarayonlarni kuzatish, oqsil lokalizatsiyasini vizualizatsiya qilish va in vivo transgen ifodasini aniqlash uchun ko'p qirrali biologik markerdir. GFP 488 nm lazer chizig'i tomonidan qo'zg'atilishi mumkin va 510 nm da optimal tarzda aniqlanadi.
Hielscher Ultrasonics kompaniyasi yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqaradi laboratoriya uchun sanoat hajmi.