O'simta to'qimasidan sonikatsiya yordamida oqsil olish – protokol
Ushbu protokol o'simta to'qimasi uchun ultratovush yordamida oqsil ekstraksiya usulini tasvirlaydi, bu to'qima buzilishi paytida nazorat ostida zond-sonikatsiya bosqichini qo'shish orqali standart CPTAC karbamid lizisi ish jarayonini rivojlantiradi. O'rnatilgan chuqur miqyosli CPTAC proteom va fosfoproteom tayyorlash strategiyasiga asoslanib, ushbu modifikatsiya hujayra va subhujayra tuzilishining buzilishini yaxshilaydi, namunaning yopishqoqligini pasaytiradi va odatda faqat karbamid lizisi bilan tiklanishi qiyinroq bo'lgan oqsillarning, ayniqsa membrana bilan bog'langan va DNK bilan bog'lanadigan yoki yadro bilan bog'liq oqsillarning ajralib chiqishini kuchaytiradi. Asosiy tadqiqotda ultratovush yordamida ish jarayoni oqsillarni ham, fosfopeptidlarni ham aniqlashni oshirdi, shu bilan birga CPTAC uslubidagi hazm qilish, TMT yorlig'i, fraksiyalash, fosfopeptidlarni boyitish va LC-MS/MS tahlil quvur liniyasi bilan moslikni saqlab qoldi.
Chuqur proteomik va fosfoproteomik tahlil uchun o'sma to'qimasidan sonikatsiya yordamida oqsil olish
The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.
ultratovushli probi UP200St proteomikada oqsil ekstraktsiyasi uchun
Protokolning qo'llanilish sohasi
Ushbu protseduradan quyidagilar uchun foydalaning:
- yangi muzlatilgan, kriopulverizatsiya qilingan o'sma to'qimasi
- karbamid asosidagi ekstraktsiya allaqachon yo'lga qo'yilgan hujayra granulalari yoki boshqa biologik namunalar
- Triptik hazm qilish va ixtiyoriy TMT yorlig'idan foydalangan holda global proteomika va fosfoproteomika ish oqimlari
Li va boshqalar (2025) tomonidan olib borilgan tadqiqotda ish jarayoni hujayra liniyalari, qon va siydik kabi boshqa namunalar turlariga ham tegishli ekanligi ta'kidlangan, ammo namunalar turiga qarab optimallashtirish talab qilinishi mumkin.
Sonikatsiya bosqichi bilan optimallashtirilgan namuna tayyorlash ish jarayoni. Optimallashtirilgan ish jarayoni va eksperimental dizayn global proteomik va fosfoproteomik tahlil uchun CPTAC namuna tayyorlash protokoliga asoslangan.
Tadqiqot va sxema: ©Li va boshqalar, 2025
Ishlash printsipi
Dastlabki tadqiqot standart CPTAC karbamid lizisi ish jarayoniga sonikatsiyani qo'shdi va membranalar va yadrolar bilan bog'liq oqsillarni aniqlashning yaxshilanganligini aniqladi. Mualliflarning ta'kidlashicha, sonikatsiya parametrlari namuna hajmi/konsentratsiyasi bo'yicha aniq sozlanishi kerak. – sonotrode hajmini, energiya kiritishini va impuls vaqtini tanlash orqali.
Misol uchun, Hielscher UP200Ht va UP200St uchun bu quyidagilarni anglatadi:
- asosiy boshqaruv o'zgaruvchilari sifatida amplituda va impuls rejimidan foydalaning
- namunalarni butun vaqt davomida sovuq holda saqlang (masalan, muz ustida)
- konservativ sharoitlardan boshlang
- namunaning tiniqligi, harorati, oqsil hosildorligi va peptidning quyi oqimi sifatiga nisbatan optimallashtirish
Hielscher 200 vattli sonikator modellari UP200Ht va UP200St kichik va o'rta namunaviy hajmlar uchun mo'ljallangan bo'lib, sozlanishi amplituda va impuls sozlamalariga ega; ikkala ultratovushli gomogenizator ham aniq parametrlarni sozlash, avtomatlashtirilgan ma'lumotlarni yozib olish, ulanadigan harorat sensori, masofadan boshqarish pulti, namunaviy yoritish uchun raqamli sensorli ekran boshqaruvini ta'minlaydi.
Sonikatsiya yordamida oqsil olish uchun reagentlar
Karbamid lizisi buferi
Ishlatishdan oldin darhol yangi tayyorlang:
- 8 M karbamid
- 75 mM NaCl
- 50 mM Tris, pH 8.0
- 1 mM EDTA
- 2 µg/ml aprotinin
- 10 µg/ml leupeptin
- 1 mM PMSF
- 10 mM NaF
- 20 µM PUGNAc
- Fosfataza ingibitor kokteyli 2, 1:100 (v/v)
- Fosfataza ingibitor kokteyli 3, 1:100 (v/v)
Qo'shimchalarni qo'shishdan oldin karbamid to'liq erigan bo'lishi kerak; ingibitorlar ishlatishdan oldin darhol qo'shilishi kerak; bufer muz ustida saqlanishi kerak; va qo'shimchalarni qo'shgandan so'ng kuchli vortekslash o'rniga aylanish tavsiya etiladi.
Qo'shimcha reagentlar:
- BCA oqsil tahlili reaktivlari
- 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
- DTT
- Iodoatsetamid
- LysC
- tripsin
- Formik kislota
- Agar multiplekslangan miqdoriy proteomikadan foydalanilsa, TMT reaktivlari
- IMAC reaktivlari, agar fosfopeptidlarni boyitishni amalga oshirayotgan bo'lsa
Ultrasonikator UP200Ht mikrotipli S26d2 namuna tayyorlash uchun
Sonikatsiya yordamida oqsil olish uchun uskunalar
Majburiy
Tavsiya etilgan zond tanlovi
200–1000 µL atrofidagi namunalar uchun kichik hajmlarni to'g'ridan-to'g'ri yuqori intensivlikda qayta ishlash uchun mos keladigan kichik diametrli sonotroddan foydalaning. Hielscher bir nechta sonotrod diametrlarini taklif qiladi va kichikroq uch diametrlari uchida yuqori intensivlikni ta'minlaydi.
Amaliy eslatma: Haddan tashqari ko'piklanish yoki tomir devoriga tegmaslik uchun samarali aralashtirish imkonini beruvchi eng kichik zonddan foydalaning.
Agar siz bir vaqtning o'zida bir nechta namunalar bilan ishlasangiz, quyidagilarni ko'rib chiqishingiz mumkin Ko'p trubkali sonikator VialTweeter yoki Mikroplitali sonikatör UIP400MTP!
Bosqichma-bosqich ko'rsatmalar: Sonikatsiya yordamida oqsilni ajratib olish tartibi
A. Oldindan sovuting va tayyorlang
- Santrifugani 4°C gacha sovuting.
- Yangi karbamid lizisi buferini tayyorlang va uni muz ustida saqlang.
- UP200Ht yoki UP200St ni ovoz qutisi ichidagi stendga o'rnating.
- Namuna naychalarini tik va barqaror ushlab turish uchun yetarlicha katta muzli vanna tayyorlang.
Yangi tampon tayyorlash va sovuq holda saqlash juda muhimdir.
B. Dastlabki karbamid ekstraktsiyasi
- Kriopulverizatsiya qilingan to'qimalarni muz ustida saqlang.
- Har 50 mg ho'l to'qimaga 200 µL sovutilgan karbamid lizisi buferini qo'shing.
- Yuqori tezlikda 5–10 soniya davomida aylaning.
- 4°C da 15 daqiqa inkubatsiya qiling.
- Vorteks-plyus-inkubatsiya bosqichini yana bir bor takrorlang.
- 20 000 g da 4°C da 10 daqiqa davomida santrifuga qiling.
- Lizat/ustun suyuqlikni toza, past bog'lanishli naychaga o'tkazing.
C. UP200Ht yoki UP200St yordamida sonikatsiya
Sonikatsiya uchun boshlang'ich shartlar
- Amplituda: 20–30% dan boshlang
- Puls uzunligi: 5 s ON
- Sovutish: pulslar orasida muz ustida 2 daqiqa
- Tsikllar soni: 4 tsikl
- Jami faol sonikatsiya vaqti: 20 s
- Sovutish bilan birga umumiy jarayon vaqti: taxminan 8-10 daqiqa
Sonikatsiya bosqichlari
- Lizatni sonikatsiya uchun mos keladigan naychaga o'tkazing. Yaxshi issiqlik almashinuvi va xavfsiz zond botirish imkonini beruvchi tor, yupqa devorli naychadan foydalaning.
- Naychani muzli vannaga joylashtiring. Maqolada ultratovush tekshiruvi paytida sovutish issiqlik shikastlanishining oldini olish uchun juda muhim ekanligi aniqlangan.
- Zond uchini namunaga botiring. Barqaror kavitatsiya uchun uchini yetarlicha suvga botiring, lekin uning naycha devoriga yoki tagiga tegishiga yo'l qo'ymang.
- Boshlang'ich amplitudada bitta 5 s impulsni ishga tushiring.
- Namunani darhol 2 daqiqa davomida to'liq muzga qaytaring.
- 4 tsikl tugaguncha takrorlang.
- Lizatni sikldan keyin tekshiring.
- Faqat kerak bo'lganda davom eting, har safar qo'shimcha 5 soniyali impulsdan foydalaning, har doim to'liq sovutishdan so'ng.
- Lizat bir tekisroq va kamroq tor/yopishqoq bo'lgandan keyin to'xtating.
Oxirgi nuqta uzluksiz yopishqoq oqim o'rniga tomchilar hosil qiluvchi shaffofroq lizatdir. - Taxminan 16000 g da 4°C da 15 daqiqa davomida santrifuga qiling.
- Tozalangan supernatantni yangi naychaga o'tkazing va oqsil konsentratsiyasini o'lchang.
Soniklangan va soniklanmagan namunalar o'rtasida global proteomika va fosfoproteomikani taqqoslash.
a. Barcha PDX o'sma to'qimalarida sonikatsiya bilan yoki usiz aniqlangan oqsillar soni (global proteomika). b. Barcha PDX o'sma to'qimalarida sonikatsiya bilan yoki usiz aniqlangan fosfopeptidlar soni (IMAC boyitish). Faqat 25-persentildan katta yoki unga teng bo'lgan oqsillar va fosfopeptidlar hisoblangan. Mo'llik nisbati bir xil turdagi namunalar o'rtasida hisoblangan.
Tadqiqot va grafikalar: ©Li va boshqalar, 2025
Pastki oqimdagi hazm qilish va tahlil
Sonikatsiya va aniqlashtirishdan so'ng, asl CPTAC uslubidagi ish jarayonida tasvirlanganidek davom eting:
- Karbamidni kamaytirish uchun lizat 1:3 (v/v) ni 50 mM Tris-HCl pH 8.0 bilan suyultiring <2 M.
- 50 µg oqsil uchun 1 mAU da LysC qo'shing va 25°C da 2 soat inkubatsiya qiling.
- 1:49 nisbatda tripsin ferment:substratini (w/w) qo'shing va 25°C da bir kechada hazm qiling.
- Formik kislota bilan 1% yakuniy konsentratsiyaga qadar eritib oling.
- Zarur bo'lganda tuzsizlantirish, TMT yorlig'i, fraksiyalash, fosfopeptidlarni boyitish va LC-MS/MS ni davom ettiring.
TMT bilan belgilangan MS dan fosfopeptidlarning differentsial ifodalanishi.
a. Bazal kichik tip, ultratovushli namunalarda ultratovushsiz namunalarga nisbatan yuqori regulyatsiyalangan ba'zi inson fosfopeptidlarini (oqsil ketma-ketligining boshlanishi va oxiri) ta'kidlaydi. b. Bazal kichik tip, ultratovushli namunalarda ultratovushsiz namunalarga nisbatan yuqori regulyatsiyalangan ba'zi inson fosfopeptidlarini (oqsil_ketma-ketligining boshlanishi va oxiri) ta'kidlaydi. c. O'smalarning ultratovushli bazal kichik tipidagi yuqori regulyatsiyalangan fosfopeptidlar oqsillariga asoslangan boyitilgan KEGG yo'llari. d. O'smalarning ultratovushli luminal kichik tipidagi yuqori regulyatsiyalangan fosfopeptidlar oqsillariga asoslangan boyitilgan KEGG yo'llari.
Tadqiqot va grafikalar: ©Li va boshqalar, 2025
Dizayn, ishlab chiqarish va konsalting – Germaniyada ishlab chiqarilgan sifat
Hielscher ultrasonikatorlari eng yuqori sifat va dizayn standartlari bilan mashhur. Mustahkamlik va qulay foydalanish ultratovush qurilmalarimizni sanoat ob'ektlariga silliq integratsiya qilish imkonini beradi. Qo'pol sharoitlar va talabchan muhit Hielscher ultrasonikatorlari tomonidan osonlik bilan hal qilinadi.
Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatiga ega kompaniya bo'lib, eng zamonaviy texnologiya va foydalanuvchilarga qulaylik bilan ajralib turadigan yuqori samarali ultratovush apparatlariga alohida e'tibor beradi. Albatta, Hielscher ultrasonikatorlari Idoralar talablariga javob beradi va UL, CSA va RoHs talablariga javob beradi.
Ko'p quduqli plastinka sonikatori UIP400MTP namunalardan yuqori samarali oqsil olish uchun
Adabiyot / Adabiyotlar
- Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
- Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
- Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.
tez-tez so'raladigan savollar
O'simlik to'qimasidan oqsil olish va sutemizuvchi to'qimalar o'rtasidagi farq nima?
O'simlik to'qimasidan oqsil olish odatda sutemizuvchilar to'qimasidan olishdan ko'ra qiyinroq, chunki o'simlik hujayralarida qattiq tsellyulozaga boy hujayra devori, ko'p miqdorda polisaxaridlar, fenolik birikmalar, pigmentlar va oqsilning erishi jarayoniga xalaqit beradigan, ekstraktlarni ifloslantiradigan yoki oqsilning parchalanishini rag'batlantiradigan faol endogen fermentlar mavjud. Aksincha, sutemizuvchilar to'qimasida hujayra devori yo'q va odatda kimyoviy jihatdan parchalanishi osonroq, garchi u ko'pincha ekstraktsiyani murakkablashtirishi mumkin bo'lgan ko'proq lipidlar, hujayradan tashqari matritsa va proteazalarni o'z ichiga olsa ham. Natijada, o'simlik protokollari odatda kuchliroq mexanik parchalanish, past haroratli maydalash va PVPP, qaytaruvchi vositalar yoki fenol asosidagi tozalash kabi qo'shimchalarni talab qiladi, sutemizuvchilar to'qimasi esa ko'pincha RIPA yoki karbamid asosidagi lizis tizimlari kabi yuvish vositasiga asoslangan buferlar bilan muvaffaqiyatli ishlov beriladi. O'simlik va sutemizuvchilar to'qimalarining ikkalasi ham sonikatsiya orqali samarali lizislanishi mumkin!
RIPA buferi yordamida to'qimalardan oqsil ekstraktsiyasini qanday yaxshilash mumkin?
RIPA buferi yordamida to'qimadan oqsilni ajratib olish namunaning buzilishini ham, himoyasini ham optimallashtirish orqali yaxshilanishi mumkin. Eng muhim choralar to'qima va buferni sovuq holda saqlash, yangi tayyorlangan proteaza va fosfataza ingibitorlaridan foydalanish, lizisdan oldin to'qimalarni yaxshilab maydalash yoki maydalash, mos bufer-to'qima nisbatini saqlab qolish va zich to'qimalarni parchalash va yopishqoqlikni kamaytirish uchun gomogenizatsiya yoki qisqa zond sonikatsiyasi kabi mexanik buzilish bosqichini qo'shishdir. Lizatlar muz ustida vaqti-vaqti bilan aralashtirish bilan inkubatsiya qilinganda, so'ngra erimaydigan qoldiqlarni olib tashlash uchun yuqori tezlikda sovutgichli santrifugalash amalga oshirilganda ham ekstraktsiya samaradorligi yaxshilanadi. Tolali, lipidlarga boy yoki yuqori tuzilgan to'qimalar uchun ekstraktsiyani bir marta takrorlash yoki yuvish vositasining ta'sir qilish vaqtini oshirish tiklanishni yaxshilashi mumkin, ammo ortiqcha sonikatsiya yoki xona haroratida uzoq vaqt ishlashdan saqlanish kerak, chunki ular oqsillarni denaturatsiya qilishi yoki proteolizni kuchaytirishi mumkin.
Ultrasonik oqsilni ekstraktsiya qilish paytida qanday xavfsizlik talablariga rioya qilish kerak?
Zond sonikatsiyasini ovoz himoyasi qutisida yoki mos eshitish himoyasi bilan bajaring. Manba protokoli sonikatsiya paytida hosil bo'ladigan zararli eshitiladigan shovqin haqida maxsus ogohlantiradi.
Ko'zni himoya qilish vositasi, laboratoriya xalati va qo'lqop kiying.
Zondni teridan uzoqroq tuting va hech qachon ochiq idishni chayqalishdan himoya qilmasdan ultratovush bilan ishlamang.
PMSF va boshqa ingibitorlarni mahalliy kimyoviy xavfsizlik qoidalariga muvofiq ishlating.
Issiqlikdan kelib chiqadigan oqsil shikastlanishini kamaytirish uchun namunalarni muz ustida saqlang; maqolada haroratni nazorat qilish juda muhim deb qayta-qayta ta'kidlangan.
VialTweeter sonikatori proteomikada oqsil ekstraktsiyasini tezlashtiradi va yaxshilaydi
Hielscher Ultrasonics kompaniyasi yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqaradi laboratoriya uchun sanoat hajmi.