Oʻsma toʻqimasidan ultratovush yordamida oqsillarni ekstraksiya qilish – protokol

Ushbu protokol oʻsma toʻqimasidan ultratovush yordamida oqsillarni ekstraksiya qilish usulini tavsiflaydi. Bu usul toʻqimani parchalash jarayoniga zond orqali boshqariladigan ultratovush bilan ishlov berish bosqichini qoʻshish orqali standart CPTAC karbamidli lizis ish jarayonini takomillashtiradi. Proteom va fosfoproteomni chuqur qamrovda oʻrganish uchun tayyorlashning shakllangan CPTAC strategiyasiga asoslangan ushbu oʻzgartirish hujayralar va subhujayraviy tuzilmalarning parchalanishini yaxshilaydi, namuna qovushqoqligini kamaytiradi va faqat karbamidli lizis bilan ajratib olish odatda qiyinroq boʻlgan oqsillarning, ayniqsa membranaga bogʻlangan hamda DNK bilan bogʻlanuvchi yoki yadro bilan aloqador oqsillarning ajralib chiqishini kuchaytiradi. Asos boʻlgan tadqiqotda ultratovush bilan ishlov berish qoʻshilgan ish jarayoni oqsillar va fosfopeptidlarning aniqlanishini oshirgan, shu bilan birga keyingi CPTAC uslubidagi fermentativ parchalash, TMT bilan belgilash, fraksiyalash, fosfopeptidlarni boyitish va LC-MS/MS tahlili ketma-ketligi bilan moslikni saqlagan.

Chuqur proteomik va fosfoproteomik tahlil uchun oʻsma toʻqimasidan ultratovush yordamida oqsillarni ekstraksiya qilish

Quyidagi protokol kriogen sharoitda kukun holigacha maydalangan oʻsma toʻqimasidan 8 M karbamidli lizis buferida oqsillarni ekstraksiya qilish uchun optimallashtirilgan: qoʻshimcha zondli ultratovush bilan ishlov berish bosqichi fermentativ parchalash va keyingi LC-MS/MS tahlilidan oldin ajratib olish qiyin boʻlgan oqsil sinflarining, ayniqsa membrana hamda DNK/yadro bilan aloqador oqsillarning ajratib olinishini yaxshilaydi. Asos boʻlgan Li va boshq. (2025) tadqiqotida ultratovush bilan ishlov berishni qoʻshish membrana va yadro bilan aloqador oqsillarning aniqlanishini oshirgan va ularning ish jarayoni doirasida >12 000 oqsil hamda >25 000 fosfopeptidni chuqur qamrovda oʻrganishga imkon bergan.

Protokolning qoʻllanish sohasi

Ushbu tartibni quyidagilar uchun qoʻllang:

• yangi holatida muzlatilgan, kriogen sharoitda kukun holigacha maydalangan oʻsma toʻqimasi
• karbamid asosidagi ekstraksiya allaqachon yoʻlga qoʻyilgan hujayra choʻkmalari yoki boshqa biologik namunalar
• tripsin bilan fermentativ parchalash va ixtiyoriy TMT bilan belgilash qoʻllanadigan umumiy proteomika va fosfoproteomika ish jarayonlari

Li va boshq. (2025) tadqiqotida ushbu ish jarayoni hujayra liniyalari, qon va siydik kabi boshqa namuna turlariga ham qoʻllanishi mumkinligi aytilgan, biroq namuna turiga qarab optimallashtirish talab qilinishi mumkin.

Ultratovush bilan ishlov berish bosqichi kiritilgan, optimallashtirilgan namuna tayyorlash ish jarayoni. Optimallashtirilgan ish jarayoni va tajriba dizayni umumiy proteomik va fosfoproteomik tahlil uchun CPTAC namuna tayyorlash protokoliga asoslangan.
Tadqiqot va sxema: ©Li et al., 2025

Ishlash tamoyili

Dastlabki tadqiqotda standart CPTAC karbamidli lizis ish jarayoniga ultratovush bilan ishlov berish qoʻshilgan va membranalar hamda yadrolar bilan aloqador oqsillarning aniqlanishi yaxshilangani kuzatilgan. Mualliflar ultratovush bilan ishlov berish parametrlarini namuna hajmi/konsentratsiyasiga qarab – sonotrod oʻlchami, kiritiladigan energiya va impulslarning vaqt parametrlarini tanlash orqali – aniq moslashtirish zarurligini taʼkidlaydilar.

Masalan, Hielscher UP200Ht va UP200St uchun bu quyidagilarni anglatadi:

• amplituda va impuls rejimini asosiy boshqaruv oʻzgaruvchilari sifatida qoʻllang
• namunalarni butun jarayon davomida sovuq holda (yaʼni muz ustida) saqlang
• ehtiyotkor sozlamalardan boshlang
• namunaning tiniqligi, harorati, oqsil chiqimi va keyingi bosqichlarda olinadigan peptidlar sifatiga qarab optimallashtiring

 
Hielscher kompaniyasining 200 vattli UP200Ht va UP200St ultratovush qurilmasi modellari kichik va oʻrta hajmdagi namunalar uchun moʻljallangan boʻlib, amplituda va impuls sozlamalarini oʻzgartirish imkonini beradi; ikkala ultratovushli gomogenizator ham parametrlarni aniq sozlash uchun raqamli sensorli ekran orqali boshqaruv, maʼlumotlarni avtomatik qayd etish, ulanadigan harorat datchigi, masofadan boshqaruv va namunani yoritish imkoniyatlarini taqdim etadi.
 

Ultratovush yordamida oqsillarni ekstraksiya qilish uchun reagentlar

Karbamidli lizis buferi

Bevosita ishlatishdan oldin yangidan tayyorlang:

• 8 M karbamid
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinin
• 10 µg/mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Qoʻshimchalarni qoʻshishdan oldin karbamid toʻliq eritilishi shart; ingibitorlar bevosita ishlatishdan oldin qoʻshilishi kerak; bufer muz ustida saqlanishi kerak; qoʻshimchalar qoʻshilgandan keyin esa vorteksda kuchli aralashtirish oʻrniga idishni aylantirib aralashtirish tavsiya etiladi.
 

Qoʻshimcha reagentlar:

• BCA oqsil tahlili reagentlari
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Yodoatsetamid
• LysC
• Tripsin
• Chumoli kislotasi
• multipleks miqdoriy proteomika qoʻllansa, TMT reagentlari
• fosfopeptidlarni boyitish amalga oshirilsa, IMAC reagentlari

Ultratovush yordamida oqsillarni ekstraksiya qilish uchun uskunalar

Zarur uskunalar

Zond tanlash boʻyicha tavsiyalar

Taxminan 200–1000 µL hajmdagi namunalar uchun kichik hajmlarga bevosita yuqori intensivlikda ishlov berishga mos, kichik diametrli sonotroddan foydalaning. Hielscher turli diametrdagi sonotrodlarni taklif etadi va uch diametri kichikroq boʻlsa, uchdagi intensivlik yuqoriroq boʻladi.

Amaliy eslatma: ortiqcha koʻpik hosil qilmasdan va idish devoriga tegmasdan samarali aralashtirishni taʼminlaydigan eng kichik zonddan foydalaning.

Agar bir vaqtning oʻzida bir nechta namuna bilan ishlasangiz, quyidagilardan foydalanishni koʻrib chiqishingiz mumkin: koʻp probirkali VialTweeter ultratovush qurilmasi yoki mikroplanshetlar uchun UIP400MTP ultratovush qurilmasi!

Bosqichma-bosqich koʻrsatmalar: ultratovush yordamida oqsillarni ekstraksiya qilish tartibi

A. Oldindan sovitish va tayyorlash

1. Tsentrifugani 4°C gacha soviting.
2. Karbamidli lizis buferini yangidan tayyorlang va muz ustida saqlang.
3. UP200Ht yoki UP200St qurilmasini shovqindan himoyalovchi qobiq ichidagi shtativga oʻrnating.
4. Namuna probirkalarini tik va barqaror holatda ushlab turish uchun yetarlicha katta muzli vanna tayyorlang.

Buferni yangidan tayyorlash va namuna bilan sovuq sharoitda ishlash juda muhim.

B. Karbamid bilan dastlabki ekstraksiya

1. Kriogen sharoitda kukun holigacha maydalangan toʻqimani muz ustida saqlang.
2. Har 50 mg nam toʻqimaga 200 µL sovitilgan karbamidli lizis buferini qoʻshing.
3. Vorteksda yuqori tezlikda 5–10 s aralashtiring.
4. 4°C da 15 min inkubatsiya qiling.
5. Vorteksda aralashtirish va inkubatsiya qilish bosqichini yana bir marta takrorlang.
6. 4°C da 20 000g bilan 10 min tsentrifugalang.
7. Lizat/supernatantni oqsil kam bogʻlanadigan toza probirkaga oʻtkazing.

C. UP200Ht yoki UP200St yordamida ultratovush bilan ishlov berish

Ultratovush bilan ishlov berishning boshlangʻich shartlari

• Amplituda: 20–30% dan boshlang
• Impuls davomiyligi: 5 s YOQILGAN
• Sovitish: impulslar orasida muz ustida 2 min
• Sikllar soni: 4 sikl
• Faol ultratovush bilan ishlov berishning jami davomiyligi: 20 s
• Sovitishni ham hisobga olgan holda jarayonning jami davomiyligi: taxminan 8–10 min

Ultratovush bilan ishlov berish bosqichlari

1. Lizatni ultratovush bilan ishlov berishga mos probirkaga oʻtkazing. Yaxshi issiqlik almashinuvi va zondning xavfsiz botirilishini taʼminlaydigan tor, yupqa devorli probirkadan foydalaning.
2. Probirkani muzli vannaga joylashtiring. Maqolada ultratovush bilan ishlov berish paytida sovitish issiqlik taʼsiridagi shikastlanishning oldini olish uchun juda muhimligi taʼkidlangan.
3. Zond uchini namunaga botiring. Barqaror kavitatsiya uchun uchni yetarlicha chuqur botirilgan holda saqlang, lekin uning probirka devori yoki tubiga tegishiga yoʻl qoʻymang.
4. Boshlangʻich amplitudada bitta 5 s impulsni ishga tushiring.
5. Darhol namunani yana toʻliq muzga joylashtirib, 2 min saqlang.
6. 4 sikl tugaguncha takrorlang.
7. Sikldan keyin lizatni tekshiring.
8. Faqat zarur boʻlsa davom eting, har safar bittadan qoʻshimcha 5 s impuls qoʻllang va har doim undan keyin toʻliq soviting.
9. Lizat bir jinsliroq boʻlib, ipdek choʻzilishi/qovushqoqligi kamaygach, ishlov berishni toʻxtating.
   Yakuniy holat – uzluksiz qovushqoq oqim oʻrniga tomchilar hosil qiladigan, yorugʻlikni koʻproq oʻtkazadigan lizat.
10. 4°C da taxminan 16 000g bilan 15 min tsentrifugalang.
11. Tiniqlashtirilgan supernatantni yangi probirkaga oʻtkazing va oqsil konsentratsiyasini oʻlchang.

Ultratovush bilan ishlov berilgan va ishlov berilmagan namunalar oʻrtasida umumiy proteomika va fosfoproteomikani taqqoslash.
a. Ultratovush bilan ishlov berilgan yoki ishlov berilmagan barcha PDX oʻsma toʻqimalarida aniqlangan oqsillar soni (umumiy proteomika). b. Ultratovush bilan ishlov berilgan yoki ishlov berilmagan barcha PDX oʻsma toʻqimalarida aniqlangan fosfopeptidlar soni (IMAC bilan boyitish). Faqat miqdoriy nisbatlari 25-persentildan katta yoki unga teng boʻlgan oqsillar va fosfopeptidlar hisobga olingan. Miqdoriy nisbat bir xil turdagi namunalar oʻrtasida hisoblangan.
Tadqiqot va grafiklar: ©Li et al., 2025

Keyingi fermentativ parchalash va tahlil

Ultratovush bilan ishlov berish va tiniqlashtirishdan keyin dastlabki CPTAC uslubidagi ish jarayonida tavsiflanganidek davom eting:

1. Karbamid konsentratsiyasini <2 M gacha kamaytirish uchun lizatni 50 mM Tris-HCl pH 8,0 bilan 1:3 (v/v) nisbatda suyultiring.
2. Har 50 µg oqsilga 1 mAU LysC qoʻshing va 25°C da 2 h inkubatsiya qiling.
3. Tripsinni 1:49 ferment:substrat (w/w) nisbatda qoʻshing va 25°C da tun davomida fermentativ parchalang.
4. Chumoli kislotasini yakuniy konsentratsiya 1% boʻlguncha qoʻshib, reaksiyani toʻxtating.
5. Zaruratga koʻra tuzsizlantirish, TMT bilan belgilash, fraksiyalash, fosfopeptidlarni boyitish va LC-MS/MS bosqichlariga oʻting.

TMT bilan belgilangan MS orqali aniqlangan fosfopeptidlarning differensial ekspressiyasi.
a. Bazal kichik tur: ultratovush bilan ishlov berilmagan namunalarga nisbatan ishlov berilgan namunalarda ekspressiyasi oshgan ayrim inson fosfopeptidlari (protein-sequence boshlanishi va oxiri) ajratib koʻrsatilgan. b. Luminal kichik tur: ultratovush bilan ishlov berilmagan namunalarga nisbatan ishlov berilgan namunalarda ekspressiyasi oshgan ayrim inson fosfopeptidlari (protein_sequence boshlanishi va oxiri) ajratib koʻrsatilgan. c. Ultratovush bilan ishlov berilgan bazal kichik turdagi oʻsmalarda ekspressiyasi oshgan fosfopeptidlarning oqsillari asosida boyigan KEGG yoʻllari. d. Ultratovush bilan ishlov berilgan luminal kichik turdagi oʻsmalarda ekspressiyasi oshgan fosfopeptidlarning oqsillari asosida boyigan KEGG yoʻllari.
Tadqiqot va grafiklar: ©Li et al., 2025

Loyihalash, ishlab chiqarish va maslahat – Germaniyada yaratilgan sifat

Hielscher ultratovush qurilmalari eng yuqori sifat va loyihalash standartlari bilan tanilgan. Mustahkamlik va oson boshqaruv ultratovush qurilmalarimizni sanoat obyektlariga muammosiz integratsiya qilish imkonini beradi. Hielscher ultratovush qurilmalari ogʻir sharoitlar va yuqori talab qoʻyadigan muhitlarda ishlashni oson uddalaydi.

Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatiga ega kompaniya boʻlib, eng zamonaviy texnologiya va foydalanish qulayligini oʻzida mujassam etgan yuqori unumdorlikdagi ultratovush qurilmalariga alohida eʼtibor qaratadi. Albatta, Hielscher ultratovush qurilmalari CE talablariga mos keladi va UL, CSA hamda RoHs talablarini bajaradi.

Adabiyotlar / manbalar

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.