Sonication bilan xromatin qirqish
Xromatinni qirqish ko'plab epigenetika va molekulyar biologiya ish oqimlarida, ayniqsa xromatin immunoprecipitatsiyasi (ChIP), ChIP-seq va shunga o'xshash tahlillarda muhim bosqichdir. Maqsad xromatinni epitop yaxlitligini saqlab qolish va namunalarni yo'qotishni minimallashtirish bilan birga takrorlanadigan DNK-oqsil komplekslariga parchalashdir. Mavjud usullar orasida ultratovushli xromatin parchalanishi keng qo'llaniladigan yondashuvga aylandi, chunki u ajoyib takrorlanuvchanlik bilan ishonchli, reagentsiz parchalanishni ta'minlaydi.
Xromatinni qirqishda nimani e'tiborga olishim kerak?
Xromatinni samarali qirqish eksperimental parametrlarni diqqat bilan nazorat qilishni talab qiladi. Noto'g'ri parchalanish juda katta, haddan tashqari parchalangan yoki namunalar orasida nomuvofiq bo'lgan parchalarni hosil qilish orqali ChIP dan keyingi tajribalarni xavf ostiga qo'yishi mumkin.
Eng muhim omillardan biri bu kerakli fragment o'lchamining taqsimoti. Ko'pgina ChIP va ChIP-seq ilovalari uchun 100 dan 600 gacha asos juftliklari orasidagi xromatin fragmentlari optimal hisoblanadi. Ushbu o'lcham diapazoni samarali immunoprecipitatsiyani ta'minlaydi va shu bilan birga genomik xaritalash uchun yetarli aniqlikni ta'minlaydi.
Yana bir muhim omil - bu sonikatsiyadan oldingi o'zaro bog'lanish samaradorligi. Ko'pgina ChIP ish oqimlari oqsil-DNK o'zaro ta'sirini barqarorlashtirish uchun formaldegid fiksatsiyasini o'z ichiga oladi. Biroq, haddan tashqari o'zaro bog'lanish xromatinni parchalanishga chidamliroq qilishi mumkin, bu esa sonikatsiya vaqtini ko'proq talab qiladi va issiqlik ta'sirini kuchaytirishi mumkin.
Haroratni nazorat qilish ham juda muhimdir. Sonikatsiya namuna haroratini ko'tarishi mumkin bo'lgan mahalliy energiyani ishlab chiqaradi. Ko'tarilgan harorat DNKga zarar etkazishi yoki oqsillarni denaturatsiya qilishi mumkin, bu esa ChIP paytida antikorlarni aniqlashga ta'sir qiladi. Shuning uchun ko'plab tadqiqotchilar namunaning barqarorligini saqlab qolish uchun sovutish intervallari bilan birgalikda impulsli sonikatsiya sikllarini amalga oshiradilar.
Namuna konsentratsiyasi va hajmi ham parchalanish samaradorligiga ta'sir qiladi. Yuqori konsentratsiyalangan xromatin suspenziyalari uzoqroq ultratovush tekshiruvi vaqtini talab qilishi mumkin, kichik namunaviy hajmlar esa ortiqcha ishlov berishning oldini olish uchun aniq energiya yetkazib berishni talab qiladi.
Nihoyat, ultratovush moslamasini tanlash eksperimental takrorlanuvchanlikka kuchli ta'sir qiladi. Xromatinni kesish uchun mo'ljallangan qurilmalar odatda boshqariladigan ultratovush energiyasini va standartlashtirilgan namunalarni qayta ishlashni ta'minlaydi, bu esa bir nechta namunalar bo'ylab izchil parchalanishni ta'minlaydi.
ChIP paytida ultratovushli DNKni kesish – kromatin immunopresipitsiyasi
Xromatinni kesish uchun qaysi sonikatorni tanlashim kerak?
Turli laboratoriya ish oqimlari turli xil ultratovush konfiguratsiyalarini talab qiladi. Optimal tizim asosan namunaviy o'tkazuvchanlik, hajm va eksperimental formatga bog'liq.
Prob tipidagi sonikator
Zond tipidagi sonikator ultratovush energiyasini to'g'ridan-to'g'ri namunaga titan zond orqali yetkazib beradi. Ushbu konfiguratsiya juda yuqori energiya zichligini ta'minlaydi va shuning uchun alohida namunalarda kuchli xromatin buzilishi uchun mos keladi.
Zond sonikatörlari ayniqsa quyidagilar uchun foydalidir:
- Kichik va o'rta namunaviy raqamlar
- Parchalanishi qiyin bo'lgan xromatin
- Moslashuvchan eksperimental protokollar
Ko'p trubkali sonikator – VialTweeter
Bir vaqtning o'zida bir nechta namunalarni qayta ishlaydigan laboratoriyalar uchun VialTweeter ko'p naychali sonikatori yuqori darajada takrorlanadigan yechimni taqdim etadi. Tizim ultratovush energiyasini flakon ushlagichi orqali bilvosita uzatadi, bu esa bir xil sharoitlarda bir nechta muhrlangan naychalarni parchalashga imkon beradi.
Ushbu konfiguratsiya muhim afzalliklarni taqdim etadi:
- Bir nechta namunalarni parallel ravishda xromatin bilan kesish
- Zond ifloslanishini bartaraf etish
- Naychalar orasida yuqori takrorlanuvchanlik
- ChIP namunalarini tayyorlash uchun soddalashtirilgan ish jarayoni
Bunday ko'p trubkali tizimlar odatiy ChIP tajribalari va o'rtacha o'tkazuvchanlikdagi tadqiqotlar uchun juda mos keladi.
Mikroplitali sonikator – UIP400MTP
Yuqori samarali epigenetika tadqiqotlari tobora ko'proq mikroplitalar asosidagi namunalarni qayta ishlashga tayanmoqda. UIP400MTP mikroplitalar sonikatori namunalarni o'tkazmasdan to'g'ridan-to'g'ri standart mikroplitalar ichida xromatinni parchalash uchun mo'ljallangan.
Ushbu yondashuv quyidagilarni ta'minlaydi:
- O'nlab yoki yuzlab namunalarni bir vaqtning o'zida qayta ishlash
- Avtomatlashtirishga qulay ish oqimlari
- Quduqlar bo'ylab ultratovush energiyasining bir xil taqsimlanishi
- Namunalarni qayta ishlash bosqichlarida sezilarli darajada kamayish
Katta ChIP-seq skrining loyihalari yoki yuqori o'tkazuvchanlikdagi epigenetik tadqiqotlar uchun mikroplastinka sonikatsiyasi ajoyib miqyoslanish va samaradorlikni ta'minlaydi. UIP400MTP ko'p quduqli plastinka sonikatori quyidagilar uchun juda mos keladi suyuqlikni qayta ishlash tizimlariga va avtomatlashtirilgan laboratoriya ish jarayonlariga integratsiya.
Nima uchun boshqa xromatin qirqish usullaridan ko'ra sonikatsiyani tanlash kerak?
Fermentativ yondashuvlar bilan taqqoslaganda, ChIP uchun ultratovush tekshiruvi xolis parchalanishni ta'minlaydi, chunki jarayon ketma-ketlikka xos ferment faolligiga bog'liq emas. Bu, ayniqsa, genom bo'ylab epigenetik tadqiqotlar uchun muhimdir, bu yerda bir xil qamrov zarur.
Yana bir muhim afzallik - bu masshtablash imkoniyati. Ultratovush tizimlari bitta namunalarni, bir nechta naychalarni yoki butun mikroplastinkalarni joylashtirishi mumkin, bu esa laboratoriyalarga eksperimental o'tkazish qobiliyati uchun eng mos konfiguratsiyani tanlash imkonini beradi.
Nihoyat, ultratovush tekshiruvi parchalanish parametrlari ustidan ajoyib nazoratni ta'minlaydi. Impuls sikllarini, davomiyligini va quvvat darajalarini sozlash orqali tadqiqotchilar kerakli parcha o'lchamining taqsimotiga ishonchli tarzda erishishlari mumkin.
ChIP namunalarini optimallashtirilgan sonikatsiya qilish orqali xromatin parchalanishi.
(a) qirqim yo'q (geldagi uzun bo'laklar);
(b) optimal parchalanish profili (parchalarni 200–600 bp bilan boyitish);
(c) DNKning ortiqcha parchalanishi (200 bp dan qisqaroq fragmentlarning ortiqcha ifodalanishi)
© Jarillo va boshqalar, 2018
Xromatinni qirqish texnikasini taqqoslash
| Xromatinni qirqish usuli | Printsip | Afzalliklar | Cheklovlar |
| sonikatsiya | Yuqori chastotali akustik energiya xromatinni mexanik ravishda parchalaydi. | Reagentsiz parchalanish, yuqori darajada takrorlanadigan natijalar, sozlanishi mumkin bo'lgan parcha o'lchamlari taqsimoti, o'zaro bog'langan xromatin bilan mos keladi, bitta naychadan ko'p namunali va mikroplastinka formatlariga qadar kengaytirilishi mumkin. | Sonikatsiya uskunalari va sonikatsiya parametrlarini optimallashtirishni talab qiladi. |
| Enzimatik hazm qilish (MNase) | Mikrokokk nukleazasi nukleosomalar orasidagi DNKni parchalaydi. | Yumshoq parchalanish va mahalliy xromatin tahlili uchun foydali. | Fermentlarning tarafkashligi, ketma-ketlikni afzal ko'rish, hazm qilishni nazorat qilish qiyin, tajribalar orasidagi potentsial o'zgaruvchanlik. |
| Mexanik qirqish (igna / shprits) | Xromatin takroriy jismoniy kuch ta'sirida buziladi. | Minimal uskunalarni talab qiladigan oddiy usul. | Qayta ishlab chiqarish qobiliyati past, parcha hajmi ustidan cheklangan nazorat, bir nechta namunalar uchun mehnat talab etiladi. |
| Nebulizatsiya | Siqilgan havo DNKni mayda teshiklar orqali parchalanishga olib keladi. | Tez parchalanish jarayoni. | Namuna yo'qotilishi mumkinligi, cheklangan miqyoslanishi, maxsus uskunalarni talab qiladi. |
Ultratovush parchalanishidan keyin xromatin hosilini qanday qilib miqdoriy va malakali deb bilaman?
ChIP uchun sonikatsiyadan so'ng, tadqiqotchilar parchalangan xromatinning miqdorini ham, sifatini ham baholashlari kerak. Ushbu tekshirish bosqichi xromatin parchalanishining ChIP-qPCR yoki ChIP-seq kabi quyi oqimdagi ilovalar talablariga javob berishini ta'minlaydi.
Miqdorlash odatda DNK konsentratsiyasini o'lchash bilan boshlanadi. Nanodrop tahlili kabi spektrofotometrik usullar yoki Qubit DNK miqdorini aniqlash kabi fluorometrik tahlillar dekrosslinking va tozalashdan keyin xromatin hosildorligini ishonchli baholash imkonini beradi.
Biroq, DNK konsentratsiyasining o'zi parchalanish muvaffaqiyatli bo'lganligini ko'rsatmaydi. Shuning uchun tadqiqotchilar elektroforetik usullar yordamida parcha hajmining taqsimlanishini baholaydilar. Agaroza gel elektroforezi DNK parchalarini vizualizatsiya qilish va ularning aksariyati maqsadli o'lcham oralig'iga to'g'ri kelishini tekshirish uchun keng tarqalgan usul bo'lib qolmoqda.
Keyinchalik ilg'or laboratoriyalar ko'pincha Agilent Bioanalyzer yoki TapeStation kabi kapillyar elektroforez tizimlaridan foydalanadilar. Ushbu platformalar aniq o'lcham taqsimoti profillarini taqdim etadi va tadqiqotchilarga ortiqcha parchalanish yoki to'liq bo'lmagan qirqishni aniqlash imkonini beradi.
Ultratovush parchalanishidan keyin xromatin sifatini baholashda tadqiqotchilar odatda quyidagilarni tasdiqlaydilar:
- DNK fragmentlarining aksariyati 100-600 bp oralig'ida bo'ladi
- Parchalarning taqsimlanishi replikatsiya namunalari bo'ylab izchil
- DNKning parchalanishi minimal
- Rejalashtirilgan ChIP tahlili uchun umumiy xromatin miqdori yetarli
To'g'ri sifat nazorati ultratovushli xromatin kesish bosqichi takrorlanadigan va biologik jihatdan mazmunli natijalarni berishini ta'minlaydi.
Xulosa: Ishonchli tadqiqotlar uchun ultratovushli xromatin qirqish
Ishonchli xromatin qirqish muvaffaqiyatli ChIP va epigenetika tadqiqotlari uchun juda muhimdir. Ultratovush parchalanishi kuchli yechimni taklif etadi, chunki u turli xil eksperimental formatlarda aniq, takrorlanadigan va reagentsiz xromatin parchalanishini ta'minlaydi.
Sonikatsiya parametrlarini diqqat bilan optimallashtirish, parcha o'lchamining taqsimlanishini tekshirish va tegishli sonikatsiya tizimini tanlash orqali – zond tipidagi sonikator, ko'p trubkali VialTweeter yoki yuqori o'tkazuvchanlikdagi UIP400MTP mikroplastinka sonikatormi – Tadqiqotchilar yuqori sifatli ChIP va ChIP-seq natijalarini qo'llab-quvvatlaydigan izchil xromatin parchalanishiga erishishlari mumkin.
Epigenetika tadqiqotlari yuqori o'tkazuvchanlik va eksperimental takrorlanuvchanlikni oshirish yo'lida kengayishda davom etar ekan, ultratovushli xromatin qirqish zamonaviy molekulyar biologiya laboratoriyalari uchun mavjud bo'lgan eng ko'p qirrali va ishonchli usullardan biri bo'lib qolmoqda.
Dizayn, ishlab chiqarish va konsalting – Germaniyada ishlab chiqarilgan sifat
Hielscher ultrasonikatorlari eng yuqori sifat va dizayn standartlari bilan mashhur. Mustahkamlik va qulay foydalanish ultratovush qurilmalarimizni sanoat ob'ektlariga silliq integratsiya qilish imkonini beradi. Qo'pol sharoitlar va talabchan muhit Hielscher ultrasonikatorlari tomonidan osonlik bilan hal qilinadi.
Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatiga ega kompaniya bo'lib, eng zamonaviy texnologiya va foydalanuvchilarga qulaylik bilan ajralib turadigan yuqori samarali ultratovush apparatlariga alohida e'tibor beradi. Albatta, Hielscher ultrasonikatorlari Idoralar talablariga javob beradi va UL, CSA va RoHs talablariga javob beradi.
Tube rack sonified in the UIP400MTP for chromatin shearing
Adabiyot / Adabiyotlar
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
tez-tez so'raladigan savollar
Xromatin nima?
Xromatin - bu eukaryotik hujayralar yadrosida genetik materialni tashkil etuvchi DNK va unga bog'liq oqsillarning strukturaviy kompleksi. Xromatindagi asosiy oqsillar gistonlar bo'lib, ularning atrofida DNK nukleosomalarni hosil qilish uchun o'ralgan. Bu tashkilot DNKni siqadi va shu bilan birga transkripsiya, replikatsiya va DNKni tiklash kabi jarayonlar uchun genetik ma'lumotlarga kirishni tartibga soladi.
Xromatinning turlari qanday?
Xromatin odatda ikkita asosiy shaklga bo'linadi: evromatin va geteroxromatin. Evromatin bo'shashgan holda joylashgan va transkripsiya jihatidan faol bo'lib, transkripsiya mexanizmi tomonidan genlarga osongina kirish imkonini beradi. Geteroxromatin zichroq joylashgan va transkripsiya jihatidan faol emas, odatda takrorlanuvchi DNK ketma-ketliklari yoki jim bo'lgan genlarni o'z ichiga oladi. Geteroxromatinni doimiy ravishda zichlashib qoladigan konstitutiv geteroxromatin va hujayra sharoitlariga qarab faol va nofaol holatlar o'rtasida almashinishi mumkin bo'lgan fakultativ geteroxromatinga bo'lish mumkin.
O'zaro bog'lanish nima?
O'zaro bog'lanish - bu biomolekulalar o'rtasida kovalent bog'lanishlarni hosil qilish orqali o'zaro ta'sirlarni barqarorlashtirish uchun ishlatiladigan biokimyoviy jarayon. Xromatin tadqiqotlarida tahlildan oldin xromatin ichidagi oqsil-DNK o'zaro ta'sirini saqlab qolish uchun o'zaro bog'lanish odatda qo'llaniladi. Formaldegid kabi kimyoviy moddalar odatda DNK va unga bog'liq oqsillar o'rtasida qaytariladigan kovalent bog'lanishlarni samarali yaratish uchun ishlatiladi. “muzlash” Muayyan vaqtdagi molekulyar o'zaro ta'sirlar. Bu barqarorlashtirish xromatin komplekslarini DNK va tartibga soluvchi oqsillar o'rtasidagi mahalliy bog'liqlikni yo'qotmasdan parchalash va qayta ishlash imkonini beradi, bu esa xromatin immunoprecipitatsiyasi (ChIP) kabi usullar uchun juda muhimdir.
ChIP nima?
Xromatin immunoprecipitatsiyasi (ChIP) - bu xromatin ichidagi oqsillar va DNK o'rtasidagi o'zaro ta'sirlarni o'rganish uchun ishlatiladigan molekulyar biologiya usuli. Ushbu usulda DNK-oqsil komplekslari avval odatda o'zaro bog'lanish orqali barqarorlashtiriladi va keyin xromatin parchalanadi. Maqsadli oqsilga xos antikorlar oqsil-DNK komplekslarini immunoprecipitatsiya qilish uchun ishlatiladi, bu esa tegishli DNK ketma-ketliklarini ajratib olish va tahlil qilish imkonini beradi.
ChIP nima uchun ishlatiladi?
ChIP transkripsiya omillari, giston modifikatsiyalari yoki xromatin bilan bog'liq tartibga soluvchi oqsillar kabi ma'lum DNK bilan bog'liq oqsillar bilan bog'langan genom mintaqalarini aniqlash uchun ishlatiladi. Ushbu usul genlarni tartibga solish, epigenetik modifikatsiyalar, transkripsiya omillarining bog'lanish joylari va xromatin tuzilishini o'rganish uchun keng qo'llaniladi. Miqdoriy PCR (ChIP-qPCR) yoki yuqori o'tkazuvchanlik ketma-ketligi (ChIP-seq) kabi analitik usullar bilan birlashtirilganda, u oqsil-DNK o'zaro ta'sirini genom bo'ylab xaritalash imkonini beradi.
CHIP turlari qanday?
Eksperimental dizayn va keyingi tahlilga qarab, xromatin immunoprecipitatsiyasining bir nechta variantlari mavjud. Eng keng tarqalgan yondashuvlar orasida ma'lum genom mintaqalarini boyitishni miqdoriy jihatdan aniqlaydigan ChIP-qPCR; genom bo'ylab oqsil-DNK o'zaro ta'sirini xaritalash uchun keyingi avlod ketma-ketligini ishlatadigan ChIP-seq; va ChIP ni DNK mikroarray tahlili bilan birlashtiradigan ChIP-chip mavjud. O'zaro bog'lanmagan xromatinni tahlil qiladigan native ChIP (N-ChIP) va oqsil-DNK o'zaro ta'sirini barqarorlashtirish uchun kimyoviy o'zaro bog'lanishdan foydalanadigan o'zaro bog'langan ChIP (X-ChIP) kabi qo'shimcha variantlar ham o'rganilayotgan biologik savolga qarab keng qo'llaniladi.
UIP400MTP mikroplastinka sonikatori yordamida yuqori o'tkazuvchanlikdagi xromatin qirqish
Hielscher Ultrasonics kompaniyasi yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqaradi laboratoriya uchun sanoat hajmi.