FFPE namunalarini parafindan tozalash va ulardan oqsillarni ajratib olish

VialTweeter koʻp probirkali ultratovush qurilmasi yordamida parafindan tozalash, eruvchan holatga keltirish va ultratovush bilan ishlov berishning optimallashtirilgan kombinatsiyasidan foydalanib, formalinda fiksatsiyalangan va parafinga quyilgan (FFPE) toʻqima kesmalaridan oqsillarni ajratib olishni osonlashtiring. Ushbu protokol keyingi mass-spektrometriyaga asoslangan proteomik tahlillarni qoʻllab-quvvatlaydi hamda SP3 bilan tozalash va fermentativ parchalash ish jarayonlariga mos keladi.

Ushbu standart operatsion tartib (SOP) yuqori samarali ultratovush bilan ishlov berish yordamida FFPE toʻqima namunalarining proteomik tahlilini amalga oshiradigan laboratoriya xodimlari uchun moʻljallangan. U VialTweeter koʻp probirkali ultratovush qurilmasi yordamida oʻntagacha FFPE namunasiga parallel ishlov berish uchun optimallashtirilgan.

Protokol: VialTweeter yordamida FFPE namunalaridan oqsillarni ajratib olish

Materiallar va reagentlar

Reagentlar

• Ksilol (gistologiya uchun mos sifatdagi)
• Etanol (absolyut 96%)
• Lizis buferi:

6 M guanidin gidroxlorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-karboksietil)fosfin)
40 mM CAA (2-xloroatsetamid)

• Proteaza ingibitori (ixtiyoriy; masalan, cOmplete™ mini EDTA-free)

Uskunalar

• VialTweeter koʻp probirkali ultratovush qurilmasi
• Moddalar yuzasiga kam bogʻlanadigan 1,5 mL yoki 2,0 mL mikrotsentrifuga probirkalari
• Isitish bloki yoki inkubator (95°C va 80°C sozlamalari)
• Mikrotsentrifuga
• Termomikser (ixtiyoriy, ammo tavsiya etiladi)

Boshlangʻich namuna miqdori

• Har bir namuna (yaʼni har bir flakon) uchun qalinligi 10 µm boʻlgan FFPE toʻqimasining 1–2 ta kesmasi

YOKI

• Har bir namuna (yaʼni har bir flakon) uchun jami ~100 µg toʻqima

Izoh: Parafin qoldiqlari bilan ifloslanishni minimallashtirish uchun mikrotomiyada yangi tigʻlardan foydalaning.

Amalga oshirish tartibi

1. Parafindan tozalash
   1. FFPE kesmalarini moddalar yuzasiga kam bogʻlanadigan mikrotsentrifuga probirkalariga oʻtkazing.
   2. 1 mL ksilol qoʻshing va vorteksda qisqa vaqt aralashtiring.
   3. Xona haroratida 10 daqiqa inkubatsiya qiling.
   4. 14 000 × g da 2 daqiqa tsentrifugalang; choʻkma ustidagi suyuqlikni tashlab yuboring.
   5. Ksilol bilan yuvishni yana bir marta takrorlang (2–4-bosqichlar).
   6. Choʻkmani 1 mL 96% etanol bilan yuving, vorteksda aralashtiring, soʻng 14 000 × g da 2 daqiqa tsentrifugalang. Choʻkma ustidagi suyuqlikni tashlab yuboring.
   7. Etanol bilan yuvishni yana bir marta takrorlang (jami 2 marta etanol bilan yuvish).
   8. Qoldiq etanolni bugʻlatish uchun qopqoqlarni ochiq qoldirib, choʻkmani xona haroratida 10 daqiqa havoda quriting.
2. Oqsillarni ajratib olish va ultratovush bilan ishlov berish
   1. Har bir quruq choʻkmaga 200 µL lizis buferi qoʻshing.

      Izoh: Ultratovush qurilmasi 1 mL gacha sigʻdirsa-da, keyingi ishlov berish uchun 200 µL optimal hisoblanadi.

   2. Vorteksda yoki pipetka yordamida ehtiyotkorlik bilan aralashtiring.
3. Birinchi termik inkubatsiya
   1. Termomikser yoki isitish blokidan foydalanib, probirkalarni 95 °C da 30 min davomida 400 rpm tezlikda aralashtirib inkubatsiya qiling.
   2. Namunalarni xona haroratida 5 min soviting.
4. VialTweeter yordamida birinchi ultratovush bilan ishlov berish
   1. Probirkalarni VialTweeter ichiga joylashtiring.
   2. VialTweeter UP200St qurilmasini quyidagi qiymatlarga sozlang va ultratovush bilan ishlov bering.
Ultratovush qurilmasi sozlamalari
• Amplitudani (A) 100% ga sozlang
• Pulsatsiya rejimini (C) 100% ga sozlang
• Davr taymeri: Yoqilgan
• Yoqilgan holatdagi vaqt: 60s
• Oʻchirilgan holatdagi vaqt: 30s
• Chegaraviy qiymat: 15 min (10 ta siklga toʻgʻri keladi)
(Hisoblash boʻyicha izoh: (60 s yoqilgan holat + 30 s oʻchirilgan holat) × 10 ta sikl = 900 s = 15 min)
5. Ikkinchi termik inkubatsiya
   Probirkalarni chiqarib oling va yana 95 °C da 15 min davomida 400 rpm tezlikda inkubatsiya qiling.
6. Ikkinchi ultratovush bilan ishlov berish
   Xuddi shu sozlamalardan (yuqorida koʻrsatilganidek) foydalanib, VialTweeter qurilmasida ultratovush bilan ishlov berishni qoʻshimcha 10 ta sikl davomida takrorlang (jami 15 min).
7. Lizatni tiniqlashtirish
   1. Namunalarni 23°C da (xona harorati) 13 000 × g da 10 min tsentrifugalang.
   2. Choʻkma ustidagi suyuqlikni ehtiyotkorlik bilan yangi 2,0 mL Safe-lock Eppendorf probirkasiga yigʻing. Choʻkmani qoʻzgʻatib yubormang.
8. Keyingi ishlov berish
   Lizat endi SP3 bilan tozalash va fermentativ parchalash uchun tayyor.

Izohlar va eng yaxshi amaliyotlar

1. Ultratovush bilan ishlov berish paytida haddan tashqari qizish xavfi dasturlashtirilgan yoqish/oʻchirish sikllari orqali kamaytiriladi.
2. Oqsillar agregatsiyasining oldini olish uchun ultratovush bilan ishlov bergandan keyin vorteksda aralashtirmang.

Chiqindilarni yoʻq qilish va xavfsizlik

Quyidagi jadval laboratoriya oʻlchamidagi ultratovush qurilmalarimizning taxminiy ishlov berish quvvati haqida maʼlumot beradi: