Hielscher Ultrasonics
Jarayoningizni muhokama qilishdan mamnun bo'lamiz.
Bizga qo'ng'iroq qiling: +49 3328 437-420
Bizga xat yuboring: [email protected]

FFPE dan deparafinizatsiya va oqsil ekstraktsiyasi

VialTweeter ko'p quvurli ultratovush apparati bilan deparafinizatsiya, eritish va sonikatsiyaning optimallashtirilgan kombinatsiyasidan foydalangan holda formalin bilan o'rnatilgan kerosin bilan o'rnatilgan (FFPE) to'qimalar bo'limlaridan oqsillarni ajratib olishni osonlashtiring. Ushbu protokol quyi oqim massa spektrometriyasiga asoslangan proteomikani qo'llab-quvvatlaydi va SP3 tozalash va fermentativ hazm qilish jarayonlari bilan mos keladi.

Ushbu SOP yuqori samarali sonikatsiya yordamida FFPE to'qimalarining namunalarini proteomik tahlil qilish bilan shug'ullanadigan laboratoriya xodimlari uchun mo'ljallangan. U VialTweeter Multi-Tube Sonicator yordamida parallel ravishda qayta ishlangan o'ntagacha FFPE namunalari uchun optimallashtirilgan.

Ma'lumot so'rovi



UP200ST ultratovush protsessorida VialTweeter

VialTweeter sonikatori 10 ta namunani bir vaqtning o'zida sonikatsiya qilish uchun, masalan, FFPE namunalaridan liziz va oqsil olish uchun

Protokol: VialTweeter yordamida FFPE namunalaridan oqsil olish

Materiallar va reaktivlar

reaktivlar

  • Ksilen (gistologiya darajasi)
  • Etanol (mutlaq 96%)
  • Lizis buferi:

    • 6 M guanidin gidroxloridi
    50 mM Tris-HCl, pH 8,5
    10 mM TCEP (Tris (2-karboksietil) fosfin)
    40 mM CAA (2-xloroasetamid)

  • Proteaz inhibitori (ixtiyoriy; masalan, cOmplete™ mini EDTAsiz)

 
 

Uskunalar

  • VialTweeter Multi-Tube Ultrasonikator
  • 1,5 ml yoki 2,0 ml past bog'lovchi mikrotsentrifuga naychalari
  • Issiqlik bloki yoki inkubator (95 ° C va 80 ° C sozlamalari)
  • Mikrotsentrifuga
  • Termomikser (ixtiyoriy, lekin tavsiya etiladi)

Kirish namunasi

  • Har bir namuna uchun 10 mkm qalinlikdagi FFPE to'qimalarining 1-2 bo'limi (ya'ni, flakon uchun)

    • yoki

  • Har bir namuna uchun jami ~100 mkg to'qima (ya'ni, flakon uchun)

Eslatma: Parafin qoldiqlari bilan ifloslanishni minimallashtirish uchun mikrotomiya uchun yangi pichoqlardan foydalaning.

Jarayon

  1. deparafinizatsiya
    1. FFPE bo'limlarini past bog'lovchi mikrosentrifuga naychalariga o'tkazing.
    2. 1 ml ksilen qo'shing, qisqa vaqt ichida aylantiring.
    3. Xona haroratida 10 daqiqa inkubatsiya qiling.
    4. 14000 × g da 2 daqiqa davomida santrifüj qiling; supernatantni tashlang.
    5. Ksilen yuvishni yana bir marta takrorlang (2-4-qadamlar).
    6. Peletni 1 ml 96% etanol bilan yuving, vorteks qiling, so'ngra 14000 × g da 2 daqiqa davomida santrifüj qiling. Supernatantni tashlang.
    7. Etanol bilan yuvishni yana bir marta takrorlang (jami 2 ta etanol yuvish).
    8. Qoldiq etanolni bug'lantirish uchun ochiq qopqoqlar bilan xona haroratida 10 daqiqa davomida quruq pelet.
  2. Protein ekstraktsiyasi va sonikatsiya
    1. Har bir quruq pelletga 200 µL lizis buferi qo‘shing.
      Eslatma: Sonikator 1 ml gacha sig'imga ega bo'lsa-da, quyi oqim uchun 200 µL optimal hisoblanadi.

    2. Vortekslash yoki yumshoq pipetleme orqali aralashtiring.
  3. Birinchi termal inkubatsiya
    1. Naychalarni 95 °C haroratda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling, termomikser yoki issiqlik bloki yordamida 400 aylanish tezligida aralashtiriladi.
    2. Namunalarni xona haroratida 5 daqiqa sovutib turing.
  4. VialTweeter bilan birinchi sonikatsiya
    1. Naychalarni VialTweeter-ga joylashtiring.
    2. VialTweeter UP200St ni quyidagi qiymatlarga sozlang va sonikatsiya qiling.
    5. Sonikator sozlamalari
    • Amplitudani (A) 100% ga sozlang
    • Pulsatsiya rejimini (C) 100% ga sozlang
    • Davr soati: Yoqilgan
    • Vaqtida: 60s
    • O'chirish vaqti: 30s
    • Cheklangan qiymat: 15 daqiqa (10 tsiklga to'g'ri keladi)
    (Hisoblash uchun eslatma: (60 s On + 30 s Off) × 10 tsikl = 900 s = 15 min)
  5. Ikkinchi termal inkubatsiya
    Naychalarni olib tashlang va yana 95 °C da 15 daqiqa, 400 rpm davomida inkubatsiya qiling.
  6. Ikkinchi sonikatsiya
    Qo'shimcha 10 tsikl (jami 15 daqiqa) uchun bir xil sozlamalar (yuqoridagi kabi) yordamida VialTweeter-da sonikatsiyani takrorlang.
  7. Lizatning aniqlanishi
    1. Namunalarni 13000 × g da 10 daqiqa davomida 23 ° C da (xona harorati) santrifüj qiling.
    2. Ehtiyotkorlik bilan supernatantni yangi 2,0 ml xavfsiz qulflangan Eppendorf naychasiga to'plang. Peletni bezovta qilishdan saqlaning.
  8. Pastga ishlov berish
    Lizat endi SP3 ni tozalash va fermentativ hazm qilish uchun tayyor.

 

VialTweeter - bu o'zaro ifloslanishsiz bir xil sharoitlarda 10 flakongacha sonikatsiya qilish uchun noyob ultratovush tizimi.

Yopiq flakonlarni sonikatsiya qilish uchun VialTweeter bilan UP200St

Video eskizi

 

Steril sharoitda ishonchli namuna tayyorlash uchun 2,0 ml Eppendorf naychalari bilan VialTweeter

Hielscher VialTweeter 10 ta Eppendorf naychalari bilan

Ma'lumot so'rovi



Eslatmalar va eng yaxshi amaliyotlar

  1. Sonikatsiya paytida haddan tashqari qizib ketish xavfi dasturlashtirilgan ON/OFF tsikli orqali yumshatiladi.
  2. Protein to'planishini oldini olish uchun sonikatsiyadan keyin vortekslashdan saqlaning.

Chiqindilarni utilizatsiya qilish va xavfsizlik

  • Ksilen va guanidin gidroxlorid xavfli kimyoviy moddalardir; dudbo'ron ostida tuting.
  • Barcha hal qiluvchi va biologik chiqindilarni institutsional bioxavfsizlik va kimyoviy gigiena protokollariga muvofiq yo'q qiling.

    •  
     

    Quyidagi jadvalda laboratoriya o'lchamidagi ultratovush apparatlarining taxminiy qayta ishlash quvvati ko'rsatilgan:

    Tavsiya etilgan qurilmalar To'plam hajmi Oqim darajasi
    UIP400MTP 96-quduqli plitali sonikator ko'p quduqli / mikrotitrli plitalar na
    Ultrasonik kubok Flakonlar yoki stakan uchun CupHorn na
    GDmini2 ultratovushli mikro-oqimli reaktor na
    VialTweeter 0,5 dan 1,5 ml gacha na
    UP100H 1 dan 500 ml gacha 10 dan 200 ml / min
    UP200Ht, UP200St 10 dan 1000 ml gacha 20-200 ml/min
    UP400St 10 dan 2000 ml gacha 20 dan 400 ml / min
    Ultrasonik elak silkitgich na na

    Qo'shimcha ma'lumot olish uchun so'rang

    Ultrasonik protsessorlar, ilovalar va narx haqida qo'shimcha ma'lumot so'rash uchun quyidagi shakldan foydalaning. Biz sizning jarayoningizni siz bilan muhokama qilishdan va sizning talablaringizni qondiradigan ultratovush tizimini taklif qilishdan mamnun bo'lamiz!




    Ultrasonik yuqori kesish gomogenizatorlari laboratoriya, dastgoh, uchuvchi va sanoat ishlov berishda qo'llaniladi.

    Hielscher Ultrasonics laboratoriya, uchuvchi va sanoat miqyosida ilovalar, dispersiya, emulsifikatsiya va ekstraktsiyani aralashtirish uchun yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqaradi.

    Aloqador mavzular

    Adabiyot / Adabiyotlar

    tez-tez so'raladigan savollar

    Nima uchun to'qimalar namunalari FFPE sifatida o'rnatiladi?

    Formalin bilan biriktirilgan kerosin bilan o'rnatilgan (FFPE) saqlanishi formaldegid orqali kovalent o'zaro bog'lanishlarni hosil qilish orqali to'qimalar morfologiyasi va oqsil tuzilmalarini barqarorlashtiradi. Parafinga singdirish retrospektiv tahlillar uchun gistologik va molekulyar yaxlitlikni saqlab, xona haroratida uzoq muddatli saqlash imkonini beradi.

    FFPE namunalarini qanday deparafinlashim mumkin?

    Deparafinizatsiya parafinni olib tashlash uchun ketma-ket erituvchi yuvishni o'z ichiga oladi: odatda ksilen bilan ikki marta inkubatsiya, so'ngra etanol (96%) bilan ikki marta yuvish. Santrifüjlash va quritishdan so'ng, to'qima quyi oqimda ekstraktsiyaga tayyor. Bu jarayon lizis va fermentativ hazm qilish uchun namunaga kirish imkoniyatini tiklaydi.

    Termal inkubatsiyaning maqsadi nima?

    Termal inkubatsiya biokimyoviy yoki fizik o'zgarishlarni keltirib chiqarish uchun namunaning ma'lum bir vaqt davomida ma'lum bir haroratga boshqariladigan ta'sirini anglatadi. Proteomikada u odatda oqsillarni denatüratsiya qilish, FFPE to'qimalarida formaldegid o'zaro bog'lanishlarini teskari qilish yoki lizis buferining samaradorligini oshirish uchun ishlatiladi. Harorat va davomiylik maqsadli reaktsiya yoki namuna turiga moslashtirilgan muhim parametrlardir.

    SP3 hazm qilish nima?

    Bitta qozonli qattiq fazali yaxshilangan namuna tayyorlash (SP3) boncuklarga asoslangan proteomika ish oqimidir. U oqsillarni bog'lash uchun paramagnit boncuklardan foydalanadi, bu denaturatsiya sharoitida samarali tozalash, konsentratsiya va boncuk ustidagi fermentativ hazm qilish imkonini beradi. SP3 namuna yo'qotilishini minimallashtiradi va kam kirish va FFPE namunalari bilan juda mos keladi.

    Yuqori samarali ultratovush! Hielscher mahsulot assortimenti ixcham laboratoriya ultratovush qurilmasidan to'liq sanoat ultratovush tizimlariga qadar to'liq spektrni qamrab oladi.

    Hielscher Ultrasonics kompaniyasi yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqaradi laboratoriya uchun sanoat hajmi.

    Jarayoningizni muhokama qilishdan mamnun bo'lamiz.

    ✕