FFPE namunalarini yuqori unumdorlikda tayyorlash: oqsillarni ajratib olish va nuklein kislotalarni siljish kuchlari bilan parchalash

Koʻp beriladigan savollar
Quyida FFPE toʻqimalarini tayyorlash va FFPE namunalariga ultratovush bilan ishlov berishga oid koʻp beriladigan savollarga javob beramiz.

FFPE toʻqimasi qanday tayyorlanadi?

FFPE toʻqimasini tayyorlash bosqichlari: yangi toʻqima bilan ehtiyotkorlik bilan ishlash va unga puxta ishlov berish yuqori sifatli FFPE namunalarini olish uchun nihoyatda muhim. Keyingi tahlillarning aniqligi uchun hujayra tuzilishi, nuklein kislotalar va oqsillarning saqlanishini taʼminlash zarur. Har bir bosqich – yigʻib olishdan parafinga singdirishgacha – turli tahlillar, jumladan, gistologik tekshiruv, immunogistokimyo va molekulyar tadqiqotlar uchun namunaning yaxlitligini saqlashda aniqlikni talab qiladi. Toʻgʻri bajarilgan fiksatsiyalash va parafinga singdirish jarayoni saqlangan toʻqimaning in vivo holatini aniq aks ettirishini taʼminlab, ishonchli diagnostika va tadqiqot natijalarini olish imkonini beradi.
Biz sizni FFPE toʻqima namunalarini parafinga singdirish jarayonining 6 asosiy bosqichi bilan tanishtiramiz.

• Toʻqimani yigʻib olish
  Tirik sutemizuvchilardan olingan biopsiyalar ham, toʻqima kulturalari ham FFPE namunalarini tayyorlash uchun yangi toʻqima olishga yaroqli manbalardir.
  Aseptik usuldan foydalanish muhim: kontaminatsiyani oldini olish uchun steril asboblar va qoʻlqoplardan foydalaning. Eng maʼquli, toʻqimalarni operatsiya xonasi yoki laminar oqim shkafi kabi steril muhitda yigʻib oling.
  Namuna juda nozik boʻlgani uchun u bilan ehtiyotkorlik bilan ishlash zarur: ishlov berishdagi kechikishlarni eng kam darajaga tushiring va kesib olingandan soʻng toʻqimaga keyingi ishlov berishni darhol boshlang. Bu autoliz va degradatsiyaning oldini olish uchun nihoyatda muhim. Toʻqimani xona haroratida saqlang; muzlatishdan saqlaning, chunki bu muz kristallari hosil boʻlishiga va toʻqima shikastlanishiga sabab boʻlishi mumkin.
• Toʻqimani fiksatsiyalash
  Avval toʻqimaga fiksator eritmasi bilan ishlov beriladi: neytral pH gacha buferlangan, suvdagi 4% formaldegidga teng boʻlgan 10% neytral buferlangan formalindan (NBF) foydalaning.
  Toʻqimani formalin ichiga toʻliq botiring. Fiksator hajmining toʻqima hajmiga nisbati kamida 10:1 boʻlishini taʼminlang. Fiksatsiyalash vaqti odatda toʻqima turi va oʻlchamiga qarab 6 dan 24 soatgacha boʻladi. Fiksatorning toʻqimaga toʻliq kirib borishi muhim. Biroq ortiqcha fiksatsiyalash antigenlarni qayta ochishni qiyinlashtiradigan oʻzaro koʻndalang bogʻlanishlarga olib kelishi mumkin, yetarli darajada fiksatsiyalamaslik esa toʻqimaning yomon saqlanishiga sabab boʻlishi mumkin.
• Toʻqimani kesib kichraytirish
  Ikkinchidan, fiksatorning yetarli darajada kirib borishi uchun toʻqimani taxminan 3–5 mm qalinlikda kesing. Tegishli gistologik tuzilmalarni qamrab olish uchun toʻqimaning toʻgʻri yoʻnalishda joylashtirilishini taʼminlang. Bu toʻqima keyinchalik tahlil uchun ishlatilganda ajratib olish jarayonini osonlashtiradi.
• Fiksatsiyalangan namunaga ishlov berish
  Endi fiksatsiyalangan toʻqimani suvsizlantirish kerak: fiksatsiyalashdan soʻng parafinning toʻqimaga toʻliq kirib borishini taʼminlash uchun toʻqimani suvsizlantirish zarur. Suvni chiqarib tashlash uchun toʻqimani konsentratsiyasi bosqichma-bosqich oshib boradigan etanol eritmalaridan (70%, 80%, 90% va 100%) oʻtkazing.
  Ksilol bilan tiniqlashtirish: parafin suvda erimaydi, ammo ksilolda eriydi. Shu sababli toʻqimadagi suv ksilol bilan almashtirilishi kerak. Biroq ksilolning oʻzi suvda erimaydi, lekin spirtda eriydi, shuning uchun avval suv spirt bilan almashtiriladigan oraliq bosqich zarur. Etanolni chiqarib tashlash va toʻqimani parafin infiltratsiyasiga tayyorlash uchun toʻqimani ksilol yoki ksilol oʻrnini bosuvchi moddaga botiring.
  Parafin yordamida infiltratsiyalash: toʻliq infiltratsiyani taʼminlagan holda toʻqimani eritilgan parafinga singdiring. Bu bosqich odatda toʻliq shimilishni taʼminlash uchun parafinni bir necha marta almashtirishni oʻz ichiga oladi.
• Toʻqimani parafinga quyish
  Bu bosqichda toʻqima toʻqima blokiga shakllantiriladi: toʻqimani kerakli yoʻnalishda qolipga joylashtiring va ustiga eritilgan parafin quying. Xona haroratida yoki sovuq plastinada sovitib, parafinning qotishiga imkon bering.
• Kesimlar tayyorlash va joylashtirish
  Mikrotomiya: parafinga singdirilgan toʻqimani kesish uchun mikrotom yordamida parafin blokidan yupqa kesimlar (odatda 4–5 mikrometr) oling. Soʻngra keyingi boʻyash va mikroskopik tahlil uchun kesimlarni buyum oynalariga joylashtirib, namuna oʻrnatiladi.
  Nihoyat, gistologik sifatni tekshiring: fiksatsiyalash va ishlov berish toʻgʻri bajarilganini tasdiqlash uchun dastlabki kesimlarni mikroskop ostida baholang. Toʻqima turi va kuzatilgan sifatga qarab protokollarni zaruratga koʻra moslashtiring.

 
FFPE toʻqimalaridan RNA, DNA va oqsillarni ajratib olish, shuningdek, saraton yoki boshqa kasallik belgilarini aniqlash uchun foydalanish mumkin. Ular yillar davomida saqlanishi mumkin va tadqiqotchilar hamda shifokorlarning diagnostika va tadqiqot uchun toʻqima namunalaridan foydalanishida muhim oʻrin tutadi.

FFPE toʻqimalari bilan bogʻliq keng tarqalgan muammolar va qiyinchiliklar nimalardan iborat?

Formalinda fiksatsiyalangan, parafinga singdirilgan (FFPE) toʻqima namunalari tadqiqot va diagnostikada keng qoʻllanadi, ammo ular bir qator qiyinchiliklar va keng tarqalgan muammolarni keltirib chiqaradi:

• Biomolekulalarning degradatsiyasi: Uzoq davom etgan fiksatsiyalash DNA, RNA va oqsillarning degradatsiyasiga olib kelishi mumkin, bu esa keyingi qoʻllanishlar uchun yuqori sifatli nuklein kislotalar yoki oqsillarni ajratib olishni qiyinlashtiradi. Toʻqimani saqlash uchun toʻgʻri fiksatsiyalash (yetarli boʻlmagan va ortiqcha fiksatsiyalashdan saqlanish) zarur.

Oʻzaro koʻndalang bogʻlanish: Formalinda fiksatsiyalash oqsillar va nuklein kislotalarning oʻzaro koʻndalang bogʻlanishiga sabab boʻladi, bu molekulyar tahlilga toʻsqinlik qilishi hamda immunogistokimyo va boshqa tahlillarning aniqligiga taʼsir qilishi mumkin.

• Antigenlarning niqoblanishi: Fiksatsiyalash jarayoni antigen sohalarini niqoblab, immunogistokimyo va boshqa immunologik tahlillarda antitanalar bogʻlanishining samaradorligini pasaytirishi mumkin. Bu koʻpincha antigenlarni qayta ochishni talab qiladi; ushbu muolaja orqali epitopning niqoblanishi bartaraf etiladi va epitop–antitana bogʻlanishi tiklanadi. Biroq toʻliq antigenlik har doim ham tiklanmasligi mumkin.
• Fiksatsiyalash sifatining oʻzgaruvchanligi: Fiksatsiyalash vaqti va sharoitlaridagi farqlar namuna sifatining bir xil boʻlmasligiga olib kelib, natijalarning takrorlanuvchanligi va taqqoslanuvchanligiga taʼsir qilishi mumkin. Ishonchli fiksatsiyalash protokollaridan foydalaning va yetarli boʻlmagan hamda ortiqcha fiksatsiyalashdan saqlaning.
• DNA shikastlanishi va fragmentatsiyasi: FFPE namunalarini formalinda fiksatsiyalash DNA ning turli xil shikastlanishlariga, jumladan, sitozin dezaminatsiyasiga (C dan T ga mutatsiyalar), oksidlanish orqali shikastlanishga (masalan, G dan T ga mutatsiyalarga olib keladigan 8-okso-guanin), shuningdek, DNA polimeraza faolligiga toʻsqinlik qiladigan bir zanjirli uzilishlar, boʻshliqlar va asossiz sohalar kabi fizik shikastlanishlarga sabab boʻlishi mumkin. Formalinda fiksatsiyalash jarayoni DNA fragmentatsiyasiga sabab boʻlib, PCR va sekvenslash kabi genetik va genomik tahlillarni qiyinlashtirishi mumkin.
• RNA sifati: FFPE toʻqimalaridan ajratib olingan RNA koʻpincha fragmentatsiyalangan va kimyoviy jihatdan modifikatsiyalangan boʻladi, bu esa yuqori sifatli transkriptomik tahlillarni oʻtkazishni qiyinlashtiradi.
• Oqsil modifikatsiyalari: Formalin oqsillarda kimyoviy modifikatsiyalarni keltirib chiqarib, ularning tuzilishi va funksiyasiga taʼsir qilishi mumkin, bu esa proteomik tahlillarga xalaqit berishi mumkin.
• Namunaga ishlov berish artefaktlari: Parafinga singdirish va kesimlar tayyorlash jarayonida mexanik zoʻriqish va issiqlik artefaktlarni yuzaga keltirishi hamda toʻqimani qoʻshimcha ravishda shikastlashi mumkin.
• Partiyalar oʻrtasidagi oʻzgaruvchanlik: Turli partiyalar oʻrtasida fiksatsiyalash va parafinga singdirish protokollaridagi farqlar natijalarning sezilarli oʻzgaruvchanligiga olib kelib, tadqiqotlar oʻrtasidagi taqqoslashlarni qiyinlashtirishi mumkin.
• Saqlash bilan bogʻliq muammolar: FFPE bloklarini uzoq muddat saqlash vaqt oʻtishi bilan qoʻshimcha degradatsiyaga va nuklein kislotalar yaxlitligining yoʻqolishiga olib kelishi mumkin, bu esa arxiv namunalarining retrospektiv tadqiqotlar uchun yaroqliligiga taʼsir qiladi.

Optimallashtirilgan protokollardan foydalanish, namunalar bilan ehtiyotkorlik bilan ishlash va ilgʻor usullarni qoʻllash FFPE toʻqimalaridan olingan maʼlumotlarning sifati va ishonchliligini yaxshilashga yordam beradi.

FFPE va muzlatilgan toʻqima oʻrtasidagi farq nima?

FFPE (formalinda fiksatsiyalangan, parafinga singdirilgan) toʻqimasi avval formalin yordamida fiksatsiyalanib, soʻng parafinga singdirish orqali saqlanadi; bu toʻqima morfologiyasini saqlagan holda xona haroratida uzoq muddat saqlash imkonini beradi. Muzlatilgan toʻqima esa muzlatish orqali tez saqlab qolinadi, bu nuklein kislotalar va oqsillarning yaxlitligini yaxshiroq saqlaydi, ammo juda past haroratlarda saqlashni talab qiladi.

FFPE toʻqimalarini parafinga singdirish uchun qanday kimyoviy moddalar ishlatiladi?

FFPE toʻqimalarini parafinga singdirishda ishlatiladigan kimyoviy moddalar odatda fiksatsiyalash uchun formalin va singdirish uchun parafinni oʻz ichiga oladi. FFPE toʻqimalarini parafinga singdirish uchun ular odatda 10% (v/v) neytral buferlangan formalin (FA) yoki paraformaldegid kukunidan yangi tayyorlangan 4% (w/v) formaldegid eritmasi (PFA) yordamida fiksatsiyalanadi. Formaldegidning suvdagi eritmasi boʻlgan formalin toʻqima morfologiyasini saqlash va haddan tashqari oʻzaro koʻndalang bogʻlanishning oldini olish uchun neytral pH gacha buferlanadi. Paraformaldegid asosidagi eritma ham oqsillarni oʻzaro koʻndalang bogʻlash orqali samarali fiksatsiyalashni taʼminlaydi va shu tariqa keyinchalik parafinga singdirish uchun toʻqima tuzilishini barqarorlashtiradi. Ushbu kimyoviy moddalar fiksatsiyalash va parafinga singdirish jarayonida toʻqimaning yaxlitligi va morfologiyasini saqlash uchun zarur.

FFPE namunalaridan parafin qanday chiqarib tashlanadi?

FFPE namunalaridan parafinni chiqarib tashlash uchun toʻqima kesimlari odatda ksilolda ketma-ket yuviladi, soʻng konsentratsiyasi bosqichma-bosqich oʻzgaradigan spirt eritmalari va nihoyat suv orqali qayta gidratatsiyalanadi. Ksilol juda zaharli boʻlib, nafas olish muammolari, teri tirnashishi va takroriy taʼsirlanishda yuzaga kelishi mumkin boʻlgan uzoq muddatli oqibatlar kabi sogʻliq uchun xavflarni tugʻdirgani sababli, koʻplab laboratoriyalarda parafinni ultratovush yordamida chiqarib tashlash istiqbolli muqobil usul sifatida rivojlanmoqda. Ushbu usul ksilol kabi zaharli erituvchilarga ehtiyoj sezmasdan parafinni samarali va xavfsiz chiqarib tashlash uchun kuchli ultratovush toʻlqinlaridan foydalanadi, shu tariqa laboratoriya xodimlari uchun xavfni kamaytiradi va xavfsizroq ish muhitini yaratadi.

Yaxshi sifatli FFPE namunalarini olish uchun toʻqimalarimni qancha vaqt fiksatsiyalashim kerak?

Fiksatsiyalash davomiyligi boʻyicha umumiy tavsiyalar odatda toʻqima namunalarini formalinda 24 dan 48 soatgacha fiksatsiyalashni taklif qiladi. Bu muddat odatda toʻqima morfologiyasi va hujayra tuzilmalarini saqlash uchun yetarli boʻlib, haddan tashqari oʻzaro koʻndalang bogʻlanish hamda nuklein kislotalar va oqsillar degradatsiyasiga olib kelishi mumkin boʻlgan ortiqcha fiksatsiyalashni eng kam darajaga tushiradi. Biroq optimal fiksatsiyalash vaqti toʻqimaning oʻlchami va turiga qarab oʻzgarishi mumkin; kichikroq yoki nozikroq namunalar qisqaroq fiksatsiyalash vaqtini talab qiladi. Toʻqima autolizi va degradatsiyasining oldini olish uchun yetarli fiksatsiyalashni taʼminlash bilan birga, keyingi molekulyar tahlillarni qiyinlashtirishi mumkin boʻlgan uzoq davom etadigan fiksatsiyalashdan saqlanish oʻrtasida muvozanatni saqlash nihoyatda muhim.