Biofilm va proteomik tahlilda Hielscher koʻp namunali ultratovush qurilmalaridan foydalanish protokoli

VialTweeter Multi-Tube Sonicator va UIP400MTP Microplate Sonicator kabi koʻp namunali ultratovush qurilmalaridan foydalanish katta miqdordagi namunalarni qayta ishlashga moʻljallangan qoʻllanishlarda laboratoriya ish jarayonlarini soddalashtiradi. Har ikkala qurilma bir nechta namunaga aniq va bir tekis ultratovush bilan ishlov berish imkonini yaratib, oʻzgaruvchanlikni kamaytiradi va natijalarning takrorlanuvchanligini oshiradi. Bu, ayniqsa, namunalarni izchil lizis qilish, biofilmni ajratish, oqsillarni ekstraksiya qilish yoki proteolitik parchalash talab qilinadigan tajribalarda foydalidir, chunki qoʻlda bajariladigan yoki bitta namunaga ishlov beriladigan usullarning samaradorligi pastroq va ularda nomuvofiqliklar yuzaga kelishi ehtimoli koʻproq.

Koʻp namunali ultratovush qurilmalari bilan ish jarayonlarini soddalashtiring

Masalan, UIP400MTP mikroplastinka quduqchalariga bir vaqtda ultratovush bilan ishlov berish imkonini yaratib, biofilmlar yoki hujayra materialining bir tekis ajralishini taʼminlaydi. VialTweeter esa bir nechta probirkadagi namunalarni oʻzaro ifloslanishsiz aniq lizis qilish va gomogenlashtirish imkonini beradi. Ushbu ultratovush qurilmalari ishlov berish vaqtini sezilarli darajada qisqartiradi, tajriba natijalarining takrorlanuvchanligini yaxshilaydi va namunalarning yuqori darajadagi yaxlitligini saqlaydi, shu sababli ular mikrobiologiya, proteomika va molekulyar biologiya tadqiqotlarida ajralmas vositalar hisoblanadi.
Quyida E. coli biofilmining hosil boʻlishi va undan keyingi proteomik tahlilni oʻz ichiga olgan tadqiqotda Hielscher koʻp namunali ultratovush qurilmalari modellari – VialTweeter Multi-Tube Sonicator va Microplate Sonicator UIP400MTP qurilmalaridan foydalanishni koʻrsatuvchi batafsil protokol keltirilgan.

Protokol: Hielscher koʻp namunali ultratovush qurilmalari yordamida biofilm hosil qilish, uni ajratish va proteomik tahlil qilish

1. Bakterial kulturani tayyorlash

• E. coli bakteriyalarini (W3110 shtammi) E. coli biofilmining hosil boʻlishi uchun qulay harorat boʻlgan 30°C da quyidagilarni oʻz ichiga olgan triptonli bulon (TB) muhitida oʻstiring:
  – 10 g/L tripton
  – 5 g/L NaCl
• Plazmidlarning saqlanib qolishini taʼminlash uchun zaruratga qarab antibiotiklar qoʻshing.
• Mikroskopiya va promotor faolligini oʻrganish uchun rplL promotori nazorati ostidagi genomik kuchaytirilgan GFP (eGFP) reporteriga ega W3110 E. coli shtammidan foydalaning.
• Turli promotorlar (masalan, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) faolligini oʻlchash uchun GFP reporter plazmidlaridan foydalaning.

2. Biofilmni oʻstirish va ajratish

• 12 quduqchali plastinkaning (CellStar 12 quduqchali plastinkalari, Greiner Bio-One) har bir quduqchasiga 1,5 mL suyultirilgan bakterial kultura eking.
• Biofilm hosil boʻlishi uchun inkubatsiya qiling.
• Planktonik (yopishmagan) kulturani ehtiyotkorlik bilan olib tashlang.

– Har bir quduqchani 500 µL PBS bilan yuving.
– 12 quduqchali plastinkaga UIP400MTP mikroplastinka ultratovush qurilmasida ultratovush bilan ishlov berib, yopishgan hujayralarni ajrating. UIP400MTP barcha quduqchalarga bir xil ultratovush energiyasini yetkazish orqali bir tekis ajralishni taʼminlaydi.
– Ultratovush bilan ishlov berish sozlamalari: amplituda 60%, sikl rejimi: 60 sec YOQILGAN / 30 sec OʻCHIRILGAN.

3. Hujayralarni yigʻish va lizis qilish

• Ajratilgan biofilm hujayralarini 4 500 g da 5 daqiqa sentrifugalang.
• Choʻkmaga tushirilgan hujayralarni PBS bilan yuving.
• Hujayralarni 100 µL 2% li natriy lauroil sarkosinat (SLS) eritmasida qayta suspenziyalang va 95°C da 15 daqiqa inkubatsiya qiling.
• Hujayralarning toʻliq lizisini taʼminlash uchun VialTweeter Multi-Tube Sonicator yordamida ultratovush bilan ishlov bering.
  – Ultratovush bilan ishlov berish sozlamalari: amplituda 100%, umumiy ishlash vaqti 10 min davomida 50 s YOQILGAN / 10 s OʻCHIRILGAN; namunalarni muz ustida saqlang.

4. Qaytarish va alkillash

• Disulfid bogʻlarini qaytarish uchun 5 mM Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) qoʻshing va 95°C da 15 daqiqa inkubatsiya qiling.
• Oqsillarni 10 mM yodoatsetamid bilan 25°C da 30 daqiqa alkillang.

5. Oqsil miqdorini aniqlash va parchalash

• Qoldiqlarni olib tashlash uchun lizatlarni sentrifugalang.
• Pierce BCA Protein Assay Kit yordamida umumiy oqsil miqdorini aniqlang.
• 50 µg umumiy oqsilni 2% SLS va 100 mM ammoniy bikarbonat saqlovchi eritmada 1 µg tripsin bilan parchalang.
• Parchalash reaksiyasini 30°C da tun davomida inkubatsiya qiling.

6. Peptidlarni tozalash

• 1,5% triftorsirka kislotasi (TFA) qoʻshib SLS ni choʻktiring, soʻng sentrifugalang.
• C18 mikrosentrifugalash kolonkalari yordamida peptidlarni tozalang.
• Tozalangan peptidlarni quriting va 0,1% TFA da qayta suspenziyalang.

7. Suyuqlik xromatografiyasi–mass-spektrometriya (LC-MS/MS)

• Peptidlarni Ultimate 3000 RSLC nano tizimiga ulangan Q-Exactive Plus mass-spektrometrida tahlil qiling.
• Peptidlarni C18 sorbenti (2,4 µm) bilan toʻldirilgan teskari fazali HPLC kolonkasi (75 µm × 42 cm) yordamida ajrating.
• 140 daqiqa davomida B erituvchisi (0,15% chumoli kislotasi saqlovchi atsetonitril) ulushini 2% dan 35% gacha oshiruvchi gradiyentni qoʻllang.
• Yuqori ajrata olish qobiliyatiga ega MS skanerlashlari va undan keyin intensivligi eng yuqori boʻlgan 10 ta ionning tandem MS/MS skanerlashlari yordamida maʼlumotlarni oling.

8. Maʼlumotlarni tahlil qilish

• Dastlabki LC-MS maʼlumotlariga Progenesis dasturiy taʼminoti yordamida ishlov bering.
• .mgf fayllarini eksport qiling va ularni MASCOT yordamida tahlil qiling.
• Sifatni nazorat qilish va yolgʻon aniqlashlar boʻyicha tuzatish kiritish uchun SafeQuant yordamida peptidlar miqdorini aniqlang.
• Natijalarning takrorlanuvchanligini taʼminlash uchun barcha tajribalarni ikki yoki uch takrorda oʻtkazing.

Katta miqdordagi namunalarni tayyorlash uchun koʻp namunali ultratovush qurilmalari

VialTweeter va UIP400MTP koʻp namunali ultratovush qurilmalari modellari tajriba ish jarayonlarining aniqligi va samaradorligini, ayniqsa biofilm tadqiqotlari va proteomikada, sezilarli darajada oshiradi. Ularning bir nechta namunaga bir tekis ishlov berish qobiliyati maʼlumotlar sifatini pasaytirmasdan katta miqdordagi namunalarni qayta ishlash imkonini taʼminlaydi. Ushbu afzalliklar yuqorida bayon qilingan soddalashtirilgan ish jarayonlari bilan birgalikda Hielscher koʻp namunali ultratovush qurilmalarini zamonaviy biologik tadqiqotlar uchun zarur vositalarga aylantiradi.

Loyihalash, ishlab chiqarish va maslahat berish – Germaniyada yaratilgan sifat

Hielscher ultratovush qurilmalari eng yuqori sifat va loyihalash standartlari bilan mashhur. Mustahkamlik va ishlatishning osonligi ultratovush qurilmalarimizni sanoat obyektlariga muammosiz integratsiya qilish imkonini beradi. Hielscher ultratovush qurilmalari ogʻir sharoitlar va yuqori talablar qoʻyiladigan muhitlarda oson ishlaydi.

Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatiga ega kompaniya boʻlib, eng ilgʻor texnologiya va foydalanuvchiga qulaylikni oʻzida mujassamlashtirgan yuqori unumdor ultratovush qurilmalariga alohida eʼtibor qaratadi. Albatta, Hielscher ultratovush qurilmalari CE talablariga muvofiq va UL, CSA hamda RoHs talablariga javob beradi.