96-quduqli Sonicator UIP400MTP bilan hujayradan tashqari matritsani ekstraktsiya qilish

An'anaviy hujayradan tashqari matritsa (EM) ekstraktsiya usullari ko'pincha biofilm matritsasini buzish uchun bir necha bosqichlarni o'z ichiga oladi. Biroq, bu usullar ko'p vaqt talab qiladigan va nomuvofiq bo'lishi mumkin, bu esa natijalarning o'zgaruvchanligiga olib keladi. 96-quduqli plastinka sonikatori UIP400MTP bilan EM ekstraktsiya jarayoni sezilarli darajada osonlashtiriladi, bu esa yuqori o'tkazuvchanlik formatlarida yuqori samarali, aniq va bir xil biofilm buzilishini ta'minlaydi. UIP400MTP boshqariladigan kavitatsiyani yaratish uchun fokuslangan ultratovushdan foydalanadi, biofilm matritsasini samarali ravishda parchalab, biofilm o'rnatilgan hujayralarning hayotiyligi va yaxlitligini saqlaydi. UIP400MTP dan foydalanish metabolomik va proteomik tahlillar, hayotiylik testlari va mikroblarga qarshi sezuvchanlik tadqiqotlari kabi quyi oqim tahlillarining takrorlanishi va aniqligini oshiradi. EM ekstraktsiyasini soddalashtirish orqali UIP400MTP tadqiqotchilarga biofilm dinamikasi va tashqi agentlar bilan o'zaro ta'sirlar haqida chuqurroq tushunchalarni taklif qilib, izchil va yuqori sifatli natijalarga erishish imkonini beradi.

hujayradan tashqari matritsaning ekstraktsiyasi

Hujayradan tashqari matritsa (EM) Candida albicans kabi mikroorganizmlar tomonidan hosil qilingan biofilmlarning muhim tarkibiy qismidir. Polisaxaridlar, oqsillar, lipidlar va hujayradan tashqari DNKdan tashkil topgan EM strukturaviy yaxlitlikni ta'minlaydi, sirtlarga yopishishda vositachilik qiladi va mikroblarga qarshi qarshilikka sezilarli hissa qo'shadi. EMni ajratib olish va tahlil qilish biofilm biologiyasini tushunish, dorilarga chidamlilik mexanizmlarini tushuntirish va yangi terapevtik maqsadlarni aniqlash uchun juda muhimdir.

UIP400MTP yordamida Candida albicans biofilmlaridan hujayradan tashqari matritsani (EM) olish protokoli

Ushbu protokol statik Candida albicans biofilmlarining hujayradan tashqari matritsasini (EM) ajratib olishga qaratilgan. Samaradorlik va takror ishlab chiqarishni yaxshilash uchun an'anaviy qirib tashlash yoki fermentga asoslangan qadamlarni almashtirish uchun UIP400MTP sonikatorini birlashtirish.

Kerakli materiallar

EM chiqarish bo'yicha bosqichma-bosqich ko'rsatmalar

1. Statik biofilmning shakllanishi
   Statik biofilmlar uchun C. albicans ni RPMI-1640 muhiti yordamida 96 quduqli plastinkaning quduqlariga seping. Har bir quduqda bir xil hajmdagi inokulum bo'lishi kerak (masalan, har bir quduq uchun 200 mkl).
   Quduq yuzalarida biofilm hosil bo'lishini ta'minlash uchun plastinkani statik sharoitda 24 soat davomida 37 ° C da inkubatsiya qiling.
2. Ekstraksiya uchun biofilm tayyorlash
   Inkubatsiyadan so'ng, biofilmni buzmasdan, har bir quduqdan sarflangan muhitni muloyimlik bilan aspiratsiya qiling va tashlang.
   Bo'shashgan hujayralar va plankton qoldiqlarini olib tashlash uchun har bir quduqni steril PBS (masalan, 200 µL) bilan yaxshilab yuvib tashlang. Ushbu qadamni ikki marta takrorlang.
   Sonikatsiyaga tayyorgarlik ko'rish uchun har bir quduqqa yangi PBS yoki ekstraksiya buferini (masalan, 200 µL) qo'shing.
3. UIP400MTP bilan sonikatsiya
   PBS yoki ekstraksiya buferini o'z ichiga olgan 96-quduqli plastinkani UIP400MTP sonikator patnisiga joylashtiring. Ko'p quduqli plastinkani to'g'ri joylashtirish uchun qo'llanmadagi ko'rsatmalarga amal qiling.
   Yumshoq rejimda (60% amplituda, impuls rejimi) 5-6 daqiqa davomida sonikatsiya qiling, bu biofilm tuzilishining bir xil buzilishini va EM komponentlarini chiqarishni ta'minlaydi.
   Haddan tashqari qizib ketish yoki namunaning shikastlanishiga yo'l qo'ymaslik uchun UIP400MTP sonikatorining harorat nazoratidan foydalaning (harorat sensori va sozlamalari).
4. Kation almashinuvi qatroni (CER) bilan davolash
   Har bir quduqdan tovushli suyuqlikni yangi 96-quduqli plastinkaga o'tkazing.
   Har bir quduqqa CER suspenziyasining ikki barobar hajmini (PBS yoki buferda tayyorlangan) qo'shing (masalan, har bir quduq uchun umumiy hajm 400 µL).
   Plastinani yoping va EM komponentlarini bog'lash va izolyatsiya qilish uchun 3 soat davomida 400 aylanish tezligida plastinka silkitgich yoki rotatorda inkubatsiya qiling.
5. Ajratish va filtrlash
   Qatronlar va hujayralarni supernatantdan ajratish uchun plastinkani 2000 × g da 10 daqiqa santrifuga qiling.
   Ehtiyotkorlik bilan EM o'z ichiga olgan supernatantni har bir quduqdan yangi 96 quduqli plastinkaga o'tkazing.
   Toza EM ekstrakti olish uchun plastinka asosidagi vakuumli manifold tizimi yoki ekvivalenti yordamida supernatantni 0,22 mkm filtr orqali filtrlang.
6. EM tahlili
   Maqsadsiz metabolitlarni aniqlash uchun UPLC-Q-TOF-MS kabi usullardan foydalaning yoki EM komponentlarini tavsiflash uchun maxsus tahlillardan foydalaning (masalan, oqsillar, triglitseridlar va uglevod miqdorini aniqlash to'plamlari uchun BCA).

Hujayradan tashqari matritsaning yuqori mahsuldorligi

UIP400MTP sonikatori yordamida hujayradan tashqari matritsa (EM) ekstraktsiyasining yuqori samaradorligi biofilm xususiyatlarini aniq tahlil qilishni talab qiladigan tahlillar uchun namuna tayyorlashni inqilob qildi. UIP400MTP ultratovush to'lqinlaridan biofilm matritsasini aniq va bir xilda buzish uchun foydalanadi, bu hujayra hayotiyligi va yaxlitligini saqlab, EM komponentlarini samarali chiqarish imkonini beradi. Ushbu yondashuv biofilmning hayotiyligi testlari, proteomik va metabolomik tadqiqotlar va antimikrobiyal sezuvchanlikni baholash kabi tahlillarning ishonchliligini sezilarli darajada oshiradi.

Koloniya hosil qiluvchi birlikni (CFU) hisoblash kabi biofilmni qayta tiklash tahlillari uchun UIP400MTP bilan EM ekstraktsiyasi reagentlarning biofilm o'rnatilgan hujayralarga to'siqsiz kirishini ta'minlaydi. Xuddi shunday, UPLC-Q-TOF-MS kabi proteomik va metabolomik tahlillar oqsillar, lipidlar va metabolitlarning yuqori rentabellikdagi izolyatsiyasidan foyda oladi. UIP400MTP shuningdek, biofilm MIC va MBEC qiymatlarini aniq aniqlash imkonini beruvchi aniq mikroblarga qarshi sezuvchanlik testini qo'llab-quvvatlaydi. Bundan tashqari, UIP400MTP tomonidan osonlashtirilgan samarali ekstraksiya ferment faolligini tahlil qilish, komponentlar miqdorini aniqlash va strukturaviy tadqiqotlarda yordam beradi, bu biofilm arxitekturasida hujayradan tashqari matritsalarning roli, yopishqoqlik va qarshilik mexanizmlari haqida qimmatli ma'lumotlarni taqdim etadi.

Ushbu yuqori mahsuldorlikka ega, takrorlanadigan ekstraksiya usuli EM tayyorlashni optimallashtiradi va biofilm bilan bog'liq bir qator tahlillar bo'yicha yuqori natijalarni ta'minlaydi.