Ултразвучна солубилизација протеинских талога
У протеомици припрема узорака никада није споредан детаљ. Она је основа на којој почивају тачност идентификације, поузданост квантификације и репродуктивност. Један од најупорнијих изазова у припреми протеинских узорака јесте ефикасно поновно растварање протеинских талога након корака преципитације или концентровања. Управо ту ултразвучна солубилизација протеинских талога добија све већи значај. Применом контролисане соникације лабораторије могу да повећају степен искоришћења протеина, убрзају растварање талога и ефикасније припреме узорке за накнадну масену спектрометрију и биохемијску анализу.
Солубилизација протеина: зашто је соникација важна у савременој протеомици
Протеински талози често настају током преципитације ацетоном, етанолом, смешом метанола и хлороформа, амонијум-сулфатом или TCA. Ови радни поступци широко се користе за уклањање контаминаната, концентровање протеина и пречишћавање екстраката пре анализе. Међутим, када се преципитација заврши, настали талог може бити тешко поново солубилизовати. Густи агрегати, хидрофобни домени, протеини повезани са мембранама и протеински комплекси са снажним међусобним интеракцијама често се опиру конвенционалном мешању или вортексирању. Непотпуна солубилизација тада може довести до губитка узорка, пристрасне заступљености протеина и слабе репродуктивности између експеримената.
Соникација решава управо ово уско грло. Стварањем механичке енергије у течном медијуму соникација разара компактне структуре талога, подстиче продирање пуфера и диспергује агрегирани материјал у раствор. Резултат је брже и често потпуније поновно растварање протеина, што је посебно драгоцено при раду са ограниченим количинама узорака, сложеним лизатима или захтевним протеомским метама.
Соникатор за микроплоче UIP400MTP за екстракцију протеина и солубилизацију талога
Зашто је протеинске талоге тешко солубилизовати
Преципитација протеина је ефикасна јер приморава протеине да се издвоје из раствора. Међутим, исти процес који преципитацију чини корисном ствара и проблем повраћаја протеина из талога. Када се исталоже, протеини могу постати густо збијени и делимично денатурисани. Хидрофобне интеракције могу се појачати, међумолекулско везивање може се повећати, а неки протеини могу заробити соли, липиде, нуклеинске киселине или друге компоненте матрикса. Чак и када се користи пуфер са снажним солубилизујућим дејством, пасивно ресуспендовање је често споро и непотпуно.
У протеомици је то важно јер непотпуно растварање талога не смањује само укупан принос. Оно може селективно искључити одређене класе протеина, нарочито мембранске протеине, структурне протеине или врсте склоне агрегацији. То значи да коначни аналитички резултат можда више не одражава стварни састав првобитног узорка. У протеомици високе резолуције, где суптилне разлике у заступљености или посттранслационим модификацијама могу бити биолошки пресудне, таква пристрасност услед припреме представља озбиљно ограничење.
Како соникација побољшава солубилизацију протеинских талога
Ултразвучни третман побољшава солубилизацију уношењем високофреквентне механичке енергије у узорак. Ова енергија помаже у разбијању компактног материјала талога и повећава контакт између пуфера за солубилизацију и протеина заробљених у талогу. Уместо да се ослања само на дифузију и ручно мешање, процес активно диспергује талог у мање фракције које се лакше растварају.
Практични ефекат је значајан. Соникација може да:
- убрза растварање густих или тешко растворљивих протеинских талога
- повећа степен искоришћења слабо растворљивих и агрегираних протеина
- скрати време припреме у протеомским радним поступцима
- допринесе добијању хомогенијих узорака за дигестију и анализу
Овако побољшано дисперговање посебно је корисно када се талози ресуспендују у пуферима који садрже уреу, тиоуреу, детерџенте, хаотропне агенсе или друге реагенсе који се уобичајено користе у протеомици. Соникација помаже овим компонентама да ефикасније допру до талога и солубилизују га, чиме се добија уједначенији раствор узорка.
Предности ултразвучне солубилизације у протеомици
Кључна предност ултразвучне солубилизације јесте то што често потцењиван корак припреме претвара у процес који се може контролисати и који је ефикасан. У протеомици то има непосредне последице по анализу.
- Прво, побољшана солубилизација повећава вероватноћу да узорак који се подвргава ензимској дигестији буде репрезентативан за целокупну популацију протеина. Дигестија трипсином, на пример, зависи од тога да ли су протеини довољно развијени и доступни у раствору. Ако делови талога остану нерастворени, ти протеини су практично искључени из стварања пептида, а тиме и из детекције.
- Друго, соникација може побољшати репродуктивност. Ручно ресуспендовање талога је по својој природи променљиво, нарочито када су укључени различити оператери, величине талога или матрице узорака. Контролисани ултразвучни третман стандардизује физичку енергију која се примењује на узорак, што може смањити варијабилност између појединачних припрема и побољшати доследност у наредним поступцима који користе LC-MS или гелове.
- Треће, ултразвучни третман је веома драгоцен за узорке са малом почетном количином материјала и драгоцене узорке. Клиничка протеомика, откривање биомаркера, експерименти са ћелијским културама и истраживања ткива често се ослањају на ограничену количину материјала. Сваки губитак протеина током солубилизације смањује информациону вредност узорка. Ефикасно поновно растварање ултразвуком помаже да се сачува што више аналита.
- На крају, соникација доприноси брзини радног поступка. Протеомичким лабораторијама које обрађују више узорака потребне су поуздане методе припреме које ефикасно користе време. Талог који се брзо и потпуно раствара није само погодан за рад; он смањује кашњења, умањује ризик од грешака при руковању и повећава број узорака који се могу обрадити у јединици времена.
Соникација у поређењу са конвенционалним методама ресуспендовања
Традиционалне методе ресуспендовања талога обично обухватају пипетирање, мешање, вортексирање, продужену инкубацију или поновљене кораке загревања. Иако ове технике могу бити делотворне код слабо збијених талога, често нису довољно ефикасне код веома збијеног или хидрофобног протеинског материјала. Само механичко мешање можда неће потпуно разградити структуру талога, па могу заостати видљиве честице или невидљиве нерастворљиве фракције.
Соникација пружа активнији и усмеренији приступ. Уместо да зависи од споре дифузије пуфера, она физички разграђује талог и поспешује брзу хомогенизацију. Тиме се не уклања потреба за одговарајућим пуфером за ресуспендовање, али се знатно повећава његова делотворност.
У поређењу са искључиво ручним методама, ултразвучна солубилизација често пружа бољу контролу процеса, већу ефикасност и бољу погодност за захтевне примене у протеомици. За лабораторије које теже и аналитичком квалитету и поузданости рада, то чини соникацију привлачним избором.
Најпогодније примене ултразвучне солубилизације протеинских талога
Ултразвучна солубилизација је посебно корисна у радним поступцима који обухватају:
- преципитацију протеина пре масене спектрометрије,
- реконституцију талога из ћелијских лизата или екстраката ткива,
- издвајање протеина богатих мембранама или склоних агрегацији,
- и припрему узорака за квантитативну протеомику, у којој је репродуктивност од суштинског значаја.
Такође је веома значајна када су талози били складиштени, прекомерно осушени или добијени из сложених биолошких матрица. У таквим случајевима пасивно ресуспендовање може постати нарочито неефикасно, док соникација помаже да узорак поново постане употребљив уз мање ручних интервенција.
Соникатор VialTweeter за истовремену соникацију 10 узорака, нпр. за екстракцију и солубилизацију протеина
Пронађите најбољи соникатор за свој поступак солубилизације протеина!
За лабораторије које раде са драгоценим узорцима, малим количинама полазног материјала или у области протеомике са великим протоком узорака, Hielscher нуди неколико формата соникације који се могу прецизно прилагодити радном поступку.
Било да изаберете Hielscher соникатор са сондом, соникатор за више епрувета VialTweeter или соникатор за микроплоче UIP400MTP – сваки модел ултразвучног уређаја намењен је другачијем сценарију припреме узорака, уз исту основну предност: репродуктивну ултразвучну енергију за ефикасну и контролисану обраду узорака.
Соникатори са сондом
Ултразвучне сонде као што је UP200Ht посебно су погодне за директну соникацију појединачних узорака. За протеомске лабораторије, UP200Ht је одличан избор када је потребно интензивно ресуспендовати протеинске талоге у малим до средњим запреминама, нарочито када су контрола методе и поновљивост важне. Директна соникација сондом може брзо да разбије компактан материјал талога и помогне пуферима за солубилизацију да допру до протеина који би иначе остали делимично нерастворени.
Преглед свих соникатора са сондом!
Соникатор за више епрувета VialTweeter
Када је потребно обрадити више затворених бочица под идентичним условима, соникатор за више епрувета VialTweeter нуди посебну предност. VialTweeter омогућава интензивну соникацију малих запремина обрадом неколико затворених бочица ултразвуком у стерилним условима. Истовремена припрема узорака у више епрувета под истим условима, као и смањен ризик од унакрсне контаминације, губитка узорка и стварања аеросола током обраде у затвореним бочицама, чине VialTweeter поузданим алатом за припрему узорака. За протеомику је ово веома значајно при раду са драгоценим талозима из више репликата или клиничких узорака, где је уједначеност између епрувета пресудна.
Сазнајте више о уређају VialTweeter!
Соникатор за микроплоче UIP400MTP
За лабораторије са великим протоком узорака, соникатор за микроплоче UIP400MTP проширује предности соникације на радне поступке засноване на плочама. UIP400MTP као соникатор за микроплоче и плоче са више бунарчића за равномерну ултразвучну обраду широм стандардних плоча, укључујући формате са 96 бунарчића, и наглашава његову погодност за аутоматизовану припрему узорака у областима као што су протеомика, дијагностика и откривање лекова. Платформа је пројектована за истовремену обраду великог броја узорака, уз предности као што су смањен ризик од унакрсне контаминације, мање потребног рада, боље искоришћење узорака и интеграција у аутоматизоване радне поступке.
У практичној протеомици то значи да се обим солубилизације талога, лизе ћелија, екстракције и сродних корака припреме може повећавати много ефикасније. Уместо обраде узорака једног по једног, лабораторије могу да соницирају целе плоче уз уједначен унос енергије. Ово је драгоцено кад год радни поступци треба да обједине велики проток узорака и аналитичку ригорозност, на пример у скрининг студијама, квантитативној протеомици или стандардизованим токовима припреме узорака. UIP400MTP стога није само алат који олакшава рад; то је платформа која подржава шири тренд ка аутоматизацији, репродуктивности и робусној протеомици са великим протоком узорака.
Сазнајте више о соникатору за микроплоче UIP400MTP!
VialTweeter у расхладној комори – контролисани параметри процеса током соникације.
Екстракција и солубилизација протеина уз велики проток узорака помоћу соникатора за микроплоче UIP400MTP
Пројектовање, производња и саветовање – квалитет произведен у Немачкој
Hielscher ултразвучни уређаји добро су познати по највишим стандардима квалитета и пројектовања. Робусност и једноставно руковање омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних уређаја у индустријска постројења. Hielscher ултразвучни уређаји лако подносе тешке услове и захтевна окружења.
Hielscher Ultrasonics је компанија са ISO сертификатом и посебан нагласак ставља на ултразвучне уређаје високих перформанси који се одликују најсавременијом технологијом и једноставном употребом. Наравно, Hielscher ултразвучни уређаји су усаглашени са CE захтевима и испуњавају захтеве UL, CSA и RoHs.
Литература / Референце
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
- Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
- Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.
Често постављана питања
Зашто ултразвучне каде нису погодне за солубилизацију протеина?
У ултразвучним кадама кавитација, принцип на којем се заснива соникација, јавља се веома неравномерно, излажући узорке различитим третманима соникације. У зависности од положаја епрувета са узорцима у ултразвучној кади, на сваки узорак делују различити интензитети. Протеомика зависи од упоредивости. Ако је један талог непотпуно растворен, док је други потпуно ресуспендован, добијени подаци могу одражавати пристрасност услед припреме уместо стварног биолошког стања. За разлику од ултразвучних када, бесконтактни соникатори као што су VialTweeter или соникатор за микроплоче UIP400MTP омогућавају стандардизованији рад тако што омогућавају паралелну обраду више узорака под истоветним ултразвучним условима, што може помоћи у побољшању поновљивости између експеримената. То је посебно корисно у истраживањима биомаркера, упоредној протеомици и радним поступцима са више биолошких или техничких репликата.
Који су најчешћи тестови у протеомици?
Најчешћи тестови у протеомици су тестови за квантификацију протеина и методе карактеризације протеина које се користе током припреме и анализе узорака. Често коришћени тестови обухватају Бредфордов тест, BCA тест, Лоријев тест и мерење UV апсорбанце на 280 nm за одређивање концентрације протеина. У ширим протеомичким радним поступцима, SDS-PAGE, вестерн блотинг, ELISA, дигестија у гелу и анализе засноване на масеној спектрометрији такође се широко користе за процену заступљености, чистоће, молекулске масе и идентитета протеина.
Шта је Кумаси бриљантно плаво?
Кумаси бриљантно плаво је трифенилметанска боја која се широко користи у науци о протеинима за бојење протеина у геловима и за колориметријску квантификацију протеина. Везује се првенствено за базне и ароматичне аминокиселинске остатке, посебно аргинин, а при везивању за протеине долази до спектралног померања. Ово својство чини је корисном и за визуализацију протеина након електрофорезе и за Бредфордов тест за протеине.
Како функционише Бредфордов тест?
Бредфордов тест се заснива на мешању протеинског узорка са бојом Кумаси бриљантно плаво у киселим условима. Када се боја веже за протеине, њен максимум апсорбанце помера се са око 465 nm на 595 nm, што изазива мерљиву промену боје из црвенкастосмеђе у плаву. Пораст апсорбанце на 595 nm пропорционалан је концентрацији протеина унутар дефинисаног опсега, што омогућава квантификацију поређењем са стандардном кривом, која се обично припрема помоћу говеђег серумског албумина.
Фокусирана соникација узорака у плочама са више бунарчића
Hielscher Ultrasonics производи ултразвучне хомогенизаторе високих перформанси од лабораторијских до индустријских размера.