Ултразвучна фрагментација ДНК за секвенцирање следеће генерације

Секвенцирање следеће генерације (НГС) захтева поуздано смицање и фрагментацију геномске ДНК како би се секвенционирали ланци геномске ДНК и креирале библиотеке генома. Контролисана фрагментација ДНК у фрагменте ДНК је суштински корак припреме узорка који је потребан пре секвенцирања ДНК. Ултразвучна метода је доказана као ефикасна и поуздана техника за фрагментацију ДНК одређене дужине. Ултразвучни протоколи за фрагментацију ДНК постижу поновљиве резултате фрагментације. Хиелсцхер ултрасоникатори су у стању да произведу широк спектар дистрибуција величине фрагмената геномске ДНК, које се прецизно контролишу преко радних параметара. Пошто су Хиелсцхер ултразвучни системи за смицање ДНК доступни за појединачне и вишеструке бочице, као и за микроплоче, припрема узорка постаје веома ефикасна.

Секвенцирање следеће генерације: ултразвучна фрагментација ДНК за припрему библиотеке

Да би се извршило секвенцирање следеће генерације, морају се извршити три основна корака: (1) припрема библиотеке, (2) секвенционирање и (3) анализа података. Током припреме библиотеке, ДНК се фрагментира, затим се крајеви фрагмената поправљају (полирају) додавањем једне базе аденина и циљни фрагменти се претварају у дволанчану ДНК. Коначно, такозвани адаптери се причвршћују лигацијом, ПЦР-ом или тагментацијом тако да се коначни ДНК производ библиотеке може квантификовати за секвенцирање.
Фрагментација ДНК помоћу соникације: Нарочито када се ради о технологијама секвенционирања кратког читања, као што је Иллумина, која не може лако да чита дуже фрагменте ДНК, ДНК штандови морају бити фрагментисани до одређене величине која се може поуздано постићи ултразвучном обрадом.
Ултразвук се може поуздано користити за фрагментацију ДНК, РНК и хроматина.

Секвенционирање следеће генерације – припрема библиотеке

Ултразвучна фрагментација ДНК се обично користи у припреми библиотека за секвенцирање ДНК за платформе за секвенцирање следеће генерације (НГС). Ова техника се користи за разбијање молекула ДНК на мање фрагменте жељеног опсега величина, што олакшава наредне кораке у припреми библиотеке. Ултразвучна фрагментација ДНК је обично потребна током корака припреме библиотеке НГС радних токова да би се фрагментирала геномска ДНК на мање делове погодне за низводну обраду и секвенцирање. Он игра кључну улогу у обезбеђивању успеха експеримента секвенцирања генерисањем ДНК фрагмената одговарајуће величине за специфичну платформу секвенцирања која се користи.

Следеће генерације секвенцирања – Кораци процеса:

• Ултразвучна фрагментација ДНК: Пре изградње библиотеке, геномска ДНК се фрагментира на мање делове којима се лакше управља. Ултразвучна фрагментација укључује коришћење високофреквентних звучних таласа да би се молекули ДНК срезали у фрагменте жељеног опсега величине. Овај корак је кључан јер помаже да се осигура да ће читања секвенционирања која се генеришу касније бити одговарајуће дужине за платформу секвенцирања која се користи. Опсег величине фрагмената може се подесити на основу специфичних захтева експеримента секвенционирања.
• Клонална амплификација помоћу ПЦР-а: Након ултразвучне фрагментације, фрагменти ДНК се подвргавају крајњој поправци, везивању адаптера и ПЦР амплификацији да би се генерисале коначне библиотеке секвенцирања ДНК. Ови кораци припремају фрагментисане молекуле ДНК за процес секвенцирања додавањем секвенци адаптера неопходних за везивање за платформу за секвенцирање и обезбеђивањем прајминг места за ПЦР амплификацију.
• Секвенцирање ДНК синтезом: Када се припреме библиотеке секвенцирања, почиње процес секвенцирања ДНК синтезом (СБС). Током СБС, секвенца ДНК се одређује узастопним додавањем нуклеотида комплементарном ланцу. Овај корак укључује цикличне реакције инкорпорације нуклеотида, снимања и цепања, омогућавајући одређивање секвенце ДНК на основу флуоресцентних сигнала које емитују уграђени нуклеотиди.
• Масивно паралелно секвенцирање: У последњем кораку, просторно одвојени, амплификовани ДНК шаблони се секвенцирају истовремено на масовно паралелан начин. Овај приступ секвенционирања високе пропусности омогућава генерисање милиона до милијарди читања секвенцирања у једном циклусу секвенцирања, омогућавајући ефикасно и брзо одређивање секвенци ДНК.

Како функционише ултразвучна фрагментација ДНК?

Соникација, такође позната као акустична обрада узорака, је широко коришћена метода за фрагментацију ДНК. За ултразвучно смицање ДНК, узорци су изложени ултразвучним таласима под контролисаним условима. Принцип рада ултразвучне фрагментације ДНК заснива се на вибрацијама и кавитацији коју стварају ултразвучни таласи. Силе смицања које су резултат ултразвучне (акустичне) кавитације разбијају молекуле ДНК високе молекуларне тежине. Поставка соникације као што су интензитет (амплитуда, трајање), режим пулсирања и температура омогућавају прецизну фрагментацију ДНК до одређене жељене дужине фрагмената ДНК. Док се ДНК често смањује на 100 до 600 бп коришћењем ултразвука, дужи фрагменти ДНК до 1300 бп се могу добити када се примењују блажи ултразвучни услови.

Контрола температуре за спречавање деградације ДНК

Дволанчани молекуларни облик ДНК је веома осетљив на повишене температуре, тако да је тачна контрола температуре током корака припреме узорка кључни фактор за поуздане резултате анализе.
Без обзира да ли користите ултрасоникаторе Хиелсцхерове сонде, ВиалТвеетер или УИП400МТП – континуирано праћење и контрола температуре је осигурана захваљујући сензору температуре који се може прикључити и софтверу паметног уређаја. Да бисте одржали температуру у одређеном опсегу, можете поставити горњу и доњу температурну границу. Сходно томе, ултрасоникатор ће паузирати чим се прекорачи ово ограничење температуре и аутоматски ће наставити да врши соникацију када се температура спусти за подешени ∆Т.
Софистицирани софтвер Хиелсцхер ултрасоникатора осигурава поуздано одржавање идеалних услова обраде узорка.

Фрагментација масовног узорка ДНК са ултрасоникатором за плоче УИП400МТП са више бунара

Број узорака у науци о животу значајно се повећао у последњој деценији. То значи да се веома велики број узорака (нпр. 384, 1536 или 3456 отвора по микроплочи) мора обрадити током припреме узорка и анализе под доследно једнаким условима како би се добили упоредиви и валидни резултати. Са УИП400МТП, Хиелсцхер Ултрасоницс прати тренд масовне обраде узорака. УИП400МТП је ултразвучни апарат за припрему узорака помоћу микроплоча. УИП400МТП може да обрађује плоче са 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 или 3456 отвора. У зависности од типа микроплоче, сваки бунар обично може да садржи запремине узорка од десетина нанолитара до неколико милилитара. Широко коришћен у истраживању науке о животу, УИП400МТП се веома често користи за припрему узорака пре тестова као што су ЕЛИСА (ензимски имуносорбентни тест) или ПЦР, пре анализе протеина, као и за припрему хроматина пре ЦХиП и ЦХиП-сек, модификације хистона идентификацију и друге аналитичке третмане (нпр. гел електрофореза, масена спектрометрија).

ВиалТвеетер за припрему узорака до 10 бочица

ВиалТвеетер је широко коришћен лабораторијски ултразвучни апарат ВиалТвеетер који омогућава ефикасну и удобну соникацију до 10 бочица истовремено. Пошто се бочице и епрувете (нпр. Епендорф бочице, крио бочице, епрувете за центрифугирање) обрађују индиректно ултразвуком, избегава се свака унакрсна контаминација. Пошто се исти ултразвучни интензитет испоручује сваком узорку, сви резултати соникације су хомогени и поновљиви. ВиалТвеетер нуди све паметне функције као што су наши други дигитални уређаји (нпр. паметни мени, програмабилна подешавања, контрола температуре, даљинско управљање итд.) тако да је осигурана највећа удобност за корисника.

Сонде са више прстију за микробунасте плоче

Доступне за ултразвучне хомогенизаторе сонде УП200Хт и УП200Ст, сонде са више прстију са 4 или 8 прстију су удобна опција за ултразвучну обраду више узорака у исто време под истим условима. На пример, сонотрода МТП-24-8-96 је сонда са осам прстију, која је идеална за интеграцију у аутоматизоване системе или ефикасну мануелну припрему узорака бунара плоча са више бунара. Сонотрода са више прстију је идеална за аутоматизоване лабораторије, где се углавном обрађују чаше и епрувете које користе стандардну ултразвучну сонотроду. Сонде са више прстију и стандардне сонде могу се брзо заменити у року од неколико минута, претварајући ултразвучни апарат са једном сондом у ултразвучни дисруптор са више сонди.

Хиелсцхер Ултрасоницаторс фор ДНК Фрагментатион

Хиелсцхер Ултрасоницс нуди различите платформе засноване на ултразвуку за фрагментацију ДНК, РНК и хроматина. Ове различите платформе укључују ултразвучне сонде (сонотроде), решења за индиректну соникацију за истовремену припрему узорака више епрувета или плоча са више јажица (нпр. плоче са 96 бунара, микротитарске плоче), сонореакторе и ултразвучне чаше. Све платформе за смицање ДНК покрећу се фреквенцијски подешеним ултразвучним процесорима високих перформанси, који се могу прецизно контролисати и дају поновљиве резултате.

Ултразвучни процесори за било који број и величину узорка

Са Хиелсцхеровим ултразвучним апаратима за више узорака ВиалТвеетер (за до 10 епрувета) и УИП400МТП (за микроплоче/плоче са више јажица) постаје лако могуће смањити време обраде узорка због интензивне и прецизно контролисане ултразвучне обраде док се постиже жељена дистрибуција и принос фрагмента ДНК. . Ултразвучна фрагментација ДНК чини припрему узорка ефикасном, поузданом и скалабилном. Протоколи се могу линеарно скалирати од једног до бројних узорака применом константно контролисаног ултразвука.
Ултрасоникатори сонде са једним до пет прстију идеални су за припрему мањег броја узорака. Хиелсцхерови лабораторијски ултрасоникатори доступни су у различитим величинама тако да вам можемо препоручити идеалан уређај за вашу примену и захтеве.

прецизна контрола процеса

Прецизно контролисана подешавања соникације су пресудна јер исцрпна сонификација може уништити ДНК, РНК и хроматин, али неадекватно ултразвучно смицање резултира предугачким фрагментима ДНК и хроматина. Хиелсцхер-ови дигитални ултрасоникатори могу се лако подесити на прецизан параметар соникације. Специфична подешавања соникације могу се такође сачувати као програмирана подешавања за брзо понављање исте процедуре.
Сва соникација се аутоматски протоколира и чува као ЦСВ датотека на уграђеној СД картици. Ово омогућава прецизну документацију изведених испитивања и омогућава лаку ревизију соникационих извођења.
Преко даљинског управљача претраживача, свим дигиталним ултразвучним апаратима се може управљати и надгледати преко било ког стандардног претраживача. Инсталација додатног софтвера није потребна, пошто ЛАН веза омогућава врло једноставно плуг-н-плаи подешавање.

Највећа лакоћа за употребу у ултразвучној припреми узорака

Сви Хиелсцхер ултрасоникатори су дизајнирани да испоруче ултразвук високих перформанси, док су у исто време увек веома лаки за употребу и лаки за руковање. Сва подешавања су добро структурирана у јасном менију, коме се лако може приступити преко обојеног екрана на додир или даљинског управљача претраживача. Паметни софтвер са програмибилним подешавањима и аутоматским снимањем података обезбеђује оптималне поставке соникације за поуздане и поновљиве резултате. Чист и једноставан за коришћење интерфејс менија претвара Хиелсцхер ултрасоникаторе у лаке и ефикасне уређаје.
Табела испод даје вам индикацију приближног капацитета обраде наших лабораторијских ултразвучних апарата, који су идеални за задатке припреме узорака као што су фрагментација ДНК и РНК, лиза ћелија као и екстракција протеина: