Ултразвучна фрагментација ДНК за секвенцирање нове генерације

Секвенцирање нове генерације (NGS) захтева поуздано смицање и фрагментацију геномске ДНК ради секвенцирања ланаца геномске ДНК и стварања геномских библиотека. Контролисана фрагментација ДНК на фрагменте ДНК представља неопходан корак у припреми узорака пре секвенцирања ДНК. Ултразвучна обрада је доказано ефикасна и поуздана техника за добијање фрагмената ДНК одређене дужине. Протоколи за ултразвучну фрагментацију ДНК дају репродуцибилне резултате фрагментације. Ултразвучни уређаји Hielscher могу да произведу широк спектар расподела величине фрагмената геномске ДНК, које се могу прецизно контролисати помоћу радних параметара. Пошто су системи Hielscher за ултразвучно смицање ДНК доступни за појединачне и вишеструке бочице, као и за микроплоче, припрема узорака постаје веома ефикасна.

Секвенцирање нове генерације: ултразвучна фрагментација ДНК за припрему библиотека

За спровођење секвенцирања нове генерације морају се извршити три основна корака: (1) припрема библиотеке, (2) секвенцирање и (3) анализа података. Током припреме библиотеке, ДНК се фрагментише, затим се крајеви фрагмената поправљају (углачавају) додавањем једне аденинске базе, а циљни фрагменти се претварају у дволанчану ДНК. На крају се такозвани адаптери везују лигацијом, ПЦР-ом или тагментацијом како би се коначни ДНК производ библиотеке могао квантитативно одредити за секвенцирање.
Фрагментација ДНК соникацијом: Нарочито када се користе технологије секвенцирања кратких очитавања, као што је Illumina, које не могу лако да очитају дуже фрагменте ДНК, ланци ДНК морају се фрагментисати до одређене величине, што се поуздано може постићи ултразвучном обрадом.
Ултразвучна обрада може се поуздано користити за фрагментацију ДНК, РНК и хроматина.

Секвенцирање нове генерације – припрема библиотеке

Ултразвучна фрагментација ДНК често се примењује у припреми библиотека за секвенцирање ДНК на платформама за секвенцирање нове генерације (NGS). Ова техника се користи за разбијање молекула ДНК на мање фрагменте у жељеном опсегу величина, чиме се олакшавају наредни кораци у припреми библиотеке. Ултразвучна фрагментација ДНК обично је неопходна током корака припреме библиотеке у радним токовима NGS-а како би се геномска ДНК фрагментисала на мање делове погодне за даљу обраду и секвенцирање. Она има кључну улогу у обезбеђивању успеха експеримента секвенцирања стварањем фрагмената ДНК у опсегу величина који одговара конкретној платформи за секвенцирање која се користи.

Секвенцирање нове генерације – кораци процеса:

• Ултразвучна фрагментација ДНК: Пре конструисања библиотеке, геномска ДНК се фрагментише на мање делове којима је лакше руковати. Ултразвучна фрагментација подразумева употребу високофреквентних звучних таласа за смицање молекула ДНК на фрагменте у жељеном опсегу величина. Овај корак је кључан јер помаже да очитавања добијена каснијим секвенцирањем буду одговарајуће дужине за платформу за секвенцирање која се користи. Опсег величина фрагмената може се подесити у складу са специфичним захтевима експеримента секвенцирања.
• Клонална амплификација ПЦР-ом: Након ултразвучне фрагментације, фрагменти ДНК подвргавају се поправци крајева, лигацији адаптера и PCR амплификацији како би се добиле коначне библиотеке за секвенцирање ДНК. Ови кораци припремају фрагментисане молекуле ДНК за процес секвенцирања додавањем адаптерских секвенци неопходних за везивање за платформу за секвенцирање и обезбеђивањем места за везивање прајмера за PCR амплификацију.
• Секвенцирање ДНК синтезом: Када се припреме библиотеке за секвенцирање, почиње процес секвенцирања ДНК синтезом (SBS). Током SBS, секвенца ДНК одређује се узастопним додавањем нуклеотида комплементарном ланцу. Овај корак обухвата цикличне реакције уградње нуклеотида, снимање и одсецање, што омогућава одређивање секвенце ДНК на основу флуоресцентних сигнала које емитују уграђени нуклеотиди.
• Масовно паралелно секвенцирање: У завршном кораку, просторно раздвојене, амплификоване ДНК матрице секвенцирају се истовремено, на масовно паралелан начин. Овај приступ секвенцирању високог капацитета омогућава добијање милиона до милијарди секвенцијских очитавања у једном циклусу секвенцирања, што омогућава ефикасно и брзо одређивање секвенци ДНК.

Како функционише ултразвучна фрагментација ДНК?

Соникација, позната и као акустична обрада узорака, широко је коришћена метода за фрагментацију ДНК. За ултразвучно смицање ДНК, узорци се излажу ултразвучним таласима у контролисаним условима. Принцип рада ултразвучне фрагментације ДНК заснива се на вибрацијама и кавитацији које стварају ултразвучни таласи. Силе смицања које настају услед ултразвучне (акустичне) кавитације разграђују молекуле ДНК велике молекулске масе. Подешавања соникације, као што су интензитет (амплитуда, трајање), пулсни режим и температура, омогућавају прецизну фрагментацију ДНК на фрагменте одређене жељене дужине. Док се ултразвучном обрадом ДНК често скраћује на 100 до 600 bp, дужи фрагменти ДНК, до 1300 bp, могу се добити применом блажих услова ултразвучне обраде.

Контрола температуре ради спречавања деградације ДНК

Дволанчана молекулска структура ДНК веома је осетљива на повишене температуре, па је прецизна контрола температуре током корака припреме узорака кључни фактор за поуздане резултате анализе.
Без обзира на то да ли користите Hielscher ултразвучне уређаје са сондом, VialTweeter или UIP400MTP – непрекидно праћење и контрола температуре обезбеђени су захваљујући прикључивом температурном сензору и паметном софтверу уређаја. Да бисте одржавали температуру у одређеном опсегу, можете подесити горњу и доњу температурну границу. Сходно томе, ултразвучни уређај ће паузирати чим се ова температурна граница прекорачи и аутоматски ће наставити соникацију када се температура снизи за подешену вредност ∆T.
Напредни софтвер Hielscher ултразвучних уређаја обезбеђује поуздано одржавање идеалних услова обраде узорака.

Фрагментација ДНК у великом броју узорака помоћу ултразвучног уређаја UIP400MTP за плоче са више бунарчића

Број узорака у наукама о животу значајно се повећао током последње деценије. То значи да се веома велики број узорака (нпр. 384, 1536 или 3456 бунарчића по микроплочи) мора обрадити током припреме и анализе узорака под доследно једнаким условима како би се добили упоредиви и валидни резултати. Са уређајем UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics прати тренд масовне обраде узорака. UIP400MTP је ултразвучни уређај за припрему узорака у микроплочама. UIP400MTP може да обрађује плоче са 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 или 3456 бунарчића. У зависности од типа микроплоче, сваки бунарчић обично може да прими узорке запремине од неколико десетина нанолитара до неколико милилитара. UIP400MTP, који се широко примењује у истраживањима у наукама о животу, веома често се користи за припрему узорака пре анализа као што су ELISA (ензимски имуносорбентни тест) или PCR, пре анализе протеина, као и за припрему хроматина пре CHiP и CHiP-seq, идентификацију модификација хистона и друге аналитичке поступке (нпр. гел-електрофорезу, масену спектрометрију).
Прочитајте више о обради PCR плоча са великим протоком узорака!

VialTweeter за припрему узорака у до 10 бочица

VialTweeter је широко коришћен лабораторијски ултразвучни уређај VialTweeter који омогућава ефикасну и практичну истовремену соникацију до 10 бочица. Пошто се бочице и епрувете (нпр. Eppendorf бочице, криобочице, епрувете за центрифугирање) соницирају индиректно, избегава се свака унакрсна контаминација. Како се сваком узорку доводи ултразвук истог интензитета, сви резултати соникације су уједначени и репродуктивни. VialTweeter нуди све паметне функције као и наши други дигитални уређаји (нпр. паметни мени, програмабилна подешавања, контролу температуре, даљинско управљање итд.), чиме се обезбеђује највећа удобност коришћења.

Сонде са више кракова за плоче са микробунарчићима

Сонде са 4 или 8 кракова, доступне за ултразвучне хомогенизаторе са сондом UP200Ht и UP200St, представљају практичну опцију за истовремену соникацију више узорака под истим условима. На пример, сонотрода MTP-24-8-96 је сонда са осам кракова, идеална за интеграцију у аутоматизоване системе или ефикасну ручну припрему узорака у бунарчићима плоча са више бунарчића. Сонотрода са више кракова идеална је за аутоматизацију у лабораторијама у којима се углавном обрађују узорци у лабораторијским чашама и епруветама помоћу стандардне ултразвучне сонотроде. Сонде са више кракова и стандардне сонде могу се брзо међусобно заменити за неколико минута, чиме се ултразвучни уређај са једном сондом претвара у ултразвучни дезинтегратор са више сонди.

Hielscher ултразвучни уређаји за фрагментацију ДНК

Hielscher Ultrasonics нуди различите платформе засноване на ултразвуку за фрагментацију ДНК, РНК и хроматина. Ове различите платформе обухватају ултразвучне сонде (сонотроде), решења за индиректну соникацију ради истовремене припреме узорака у више епрувета или у плочама са више бунарчића (нпр. плочама са 96 бунарчића, микротитарским плочама), сонореакторе и чашасте ултразвучне реакторе. Све платформе за смицајно уситњавање ДНК покрећу ултразвучни процесори високих перформанси са подешеном фреквенцијом, који омогућавају прецизну контролу и дају репродуктивне резултате.

Ултразвучни процесори за било који број и величину узорака

Уз Hielscher ултразвучне уређаје за више узорака VialTweeter (за до 10 епрувета) и UIP400MTP (за микроплоче/ плоче са више бунарчића), могуће је смањити време обраде узорака захваљујући интензивној ултразвучној обради која се може прецизно контролисати, уз истовремено постизање жељене расподеле величина и приноса фрагмената ДНК. Ултразвучна фрагментација ДНК чини припрему узорака ефикасном, поузданом и скалабилном. Протоколи се могу линеарно скалирати са једног на велики број узорака применом ултразвука који је под сталном контролом.
Ултразвучни уређаји са сондом са једним до пет кракова идеални су за припрему мањег броја узорака. Hielscher лабораторијски ултразвучни уређаји доступни су у различитим величинама, тако да вам можемо препоручити идеалан уређај за вашу примену и захтеве.

Прецизна контрола процеса

Могућност прецизне контроле подешавања соникације је кључна јер прекомерна соникација може уништити ДНК, РНК и хроматин, док недовољно ултразвучно смицање доводи до предугих фрагмената ДНК и хроматина. Дигитални ултразвучни уређаји компаније Hielscher могу се лако подесити на прецизне параметре соникације. Одређена подешавања соникације могу се сачувати и као програмирано подешавање ради брзог понављања истог поступка.
Све соникације се аутоматски евидентирају и чувају као CSV датотека на уграђеној SD картици. То омогућава прецизно документовање изведених огледа и лак преглед спроведених соникација.
Путем даљинског управљања преко прегледача, свим дигиталним ултразвучним уређајима може се управљати и њихов рад пратити преко било ког стандардног прегледача. Инсталација додатног софтвера није потребна јер LAN веза омогућава веома једноставно подешавање по принципу „прикључи и користи“.


Највећа једноставност употребе при ултразвучној припреми узорака

Сви ултразвучни уређаји компаније Hielscher пројектовани су да испоручују ултразвук високих перформанси, а да истовремено увек буду веома прилагођени кориснику и једноставни за руковање. Сва подешавања су јасно организована у прегледном менију, коме се лако приступа преко екрана у боји осетљивог на додир или даљинским управљањем преко прегледача. Паметни софтвер са програмабилним подешавањима и аутоматским бележењем података обезбеђује оптимална подешавања соникације за поуздане и поновљиве резултате. Прегледан интерфејс менија, једноставан за коришћење, чини ултразвучне уређаје компаније Hielscher прилагођеним кориснику и ефикасним.
Табела у наставку даје преглед приближног капацитета обраде наших лабораторијских ултразвучних уређаја, који су идеални за поступке припреме узорака као што су фрагментација ДНК и РНК, лиза ћелија и екстракција протеина: