Ултразвучна лиза узорака Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster се широко користи у лабораторијама као моделни организам. Због тога се често морају спроводити кораци преаналитичке припреме узорака Drosophila melanogaster, као што су лиза, разарање ћелија, екстракција протеина и смицање ДНК. Ултразвучни дезинтегратори су поуздани и ефикасни и могу се користити за лако обављање различитих задатака, као што су лиза, екстракција протеина или фрагментација ДНК, само подешавањем параметара ултразвучног процеса. Ултразвучни хомогенизатори су стога флексибилни инструменти са широким спектром примена.

Ултразвучна лиза и екстракција протеина

Лиза, солубилизација ћелија, хомогенизација ткива и екстракција протеина типични су задаци ултразвучних дезинтегратора у биолошким лабораторијама. Ултразвучни дезинтегратори и уређаји за разарање ћелија веома су погодни за хомогенизацију животињских ткива, инсеката (нпр. Drosophila melanogaster, C. elegans) или биљних узорака. Даље примене ултразвучне обраде обухватају лизу ћелијских суспензија и талога, као и екстракцију унутарћелијских протеина.
Ултразвучна лиза и екстракција протеина веома су поуздани и поновљиви процеси који се могу спроводити на основу утврђених протокола. Пошто се интензитет ултразвучног процеса може прецизно подесити помоћу параметара соникације, као што су амплитуда, циклусни / импулсни режим, температура и запремина узорка, једном проверени протоколи могу се изнова понављати са истим исходом.

Ултразвучна фрагментација ДНК и РНК

Након лизе ћелија и екстракције протеина, чест неопходан корак у припреми узорака јесте смицање и фрагментација ДНК, РНК и хроматина, нпр. пре имунопреципитације хроматина (ChIP). Фрагментација ДНК и РНК може се поуздано постићи раскидањем ковалентних веза које држе ДНК на окупу, деловањем физичких сила. При физичком смицању, као што је соникација, најпре се прекидају ланци ДНК, а затим се ДНК фрагментише на мање делове.
Ултразвучна фрагментација ДНК поуздана је и ефикасна у смицању ДНК до циљне дужине, нпр. 500bp (парова база). Главне предности ултразвучне фрагментације ДНК обухватају прецизну контролу параметара и интензитета ултразвучног процеса. Параметри ултразвучног процеса могу се подесити прецизним подешавањем интензитета, циклуса и трајања соникације. То омогућава добијање жељених величина ДНК, а циљна дужина ДНК може се поуздано постићи и поново добити. Ултразвучно смицање ДНК такође је идеално за добијање фрагмената ДНК велике молекулске масе.

Протоколи за ултразвучну лизу Drosophila melanogaster

У наставку можете пронаћи различите протоколе за лизу, екстракцију протеина и фрагментацију ДНК или хроматина из узорака Drosophila уз помоћ ултразвука.

Ултразвучна лиза за анализу имунопреципитацијом уз унакрсно повезивање (CLIP)

CLIP анализа је изведена као што је претходно описано, уз извесне измене. Приближно 20 mg јајника женки дивљег типа старости 0–1 дан подвргнуто је унакрсном повезивању УВ зрачењем (3 × 2000 μJ/cm2), хомогенизовано на леду у 1 mL RCB пуфера (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM сахарозе, 1 mM DTT, 1× Complete инхибитори протеаза без EDTA, 1 mM PMSF) са додатком 300 U RNAseOUT и остављено на леду 30 min. Хомогенат је соникован на леду, при 80% снаге, пет пута у импулсима од 20 s са паузама од 60 s између њих, помоћу ултразвучног процесора Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) и центрифугиран (16.000 × g током 5 min на 4°C). Растворљиви екстракт је претходно пречишћен помоћу 20 μl Protein-G dynabeads током 20 min на 4°C. Након издвајања узорака за имуноблотинг и квантификацију улазне РНК (1%), HP1 је имунопреципитиран антителом anti-HP1 9A9 из 450 μl претходно пречишћеног екстракта инкубацијом током 4 h са 50 μl Protein-G dynabeads. Имунопреципитати су испрани 4 пута пуфером RCB. Ради елуирања имунопреципитираних РНК, исталожене куглице су куване у 100 μL воде UltraPure третиране DEPC-ом током 5 min. У супернатант прикупљен за припрему РНК додато је 900 μL реагенса Qiazol. Пречишћена РНК је коришћена као матрица за синтезу cDNA помоћу олиго dT, насумичних хексамера и реверзне транскриптазе SuperScript III, према протоколу произвођача.
(Cassale et al. 2019)

Ултразвучна лиза за анализу имунопреципитације хроматина

Имунопреципитација хроматина изведена је према методи коју је описао Menet, уз мање измене. Приближно 20 mg јајника женки дивљег типа старих од 0 до 1 дана хомогенизовано је у 1 mL пуфера NEB (10 mM HEPES-Na при pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na при pH 8, 0,5 mM EDTA-Na при pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM спермидина, 0,15 mM спермина, 1× инхибитори протеаза Complete без EDTA) помоћу хомогенизатора / потапајућег диспергатора током 1 min (при 3000 rpm). Хомогенат је пренет у претходно охлађени стаклени Даунсов хомогенизатор и примењено је 15 пуних потеза тучком који тесно належе. Слободна једра су затим центрифугирана при 6000xg током 10 min на 4°C. Талози који садрже једра ресуспендовани су у 1 mL пуфера NEB и центрифугирани при 20.000 × g током 20 min на градијенту сахарозе (0,65 mL 1,6 M сахарозе у пуферу NEB, 0,35 mL 0,8 M сахарозе у пуферу NEB). Талог је ресуспендован у 1 mL пуфера NEB уз додатак формалдехида до коначне концентрације од 1%. Једра су унакрсно повезивана током 10 min на собној температури, а реакција је заустављена додавањем 1/10 запремине 1,375 M глицина. Једра су прикупљена центрифугирањем при 6000 × g током 5 min. Једра су испрана два пута у 1 mL пуфера NEB и ресуспендована у 1 mL пуфера за лизу (15 mM HEPES-Na при pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA при pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% натријум-деоксихолата, 0,1% SDS, 0,5% N-лауроилсаркозина и 1× инхибитори протеаза Complete без EDTA). Једра су соницирана помоћу ултразвучног процесора Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) шест пута, уз 20 s рада и 1 min на леду. Соницирана једра су центрифугирана при 13.000 × g током 4 min на 4°C. Већи део соницираног хроматина имао је дужину од 500 до 1000 базних парова (bp). За сваку имунопреципитацију, 15 μg хроматина инкубирано је у присуству 10 μg моноклонског антитела HP1 9A9 (3 h на 4°C на ротирајућем точку). Затим је додато 50 μl dynabeads protein G и инкубација је настављена преко ноћи на 4°C. Супернатанти су одбачени, а узорци су испрани два пута пуфером за лизу (свако испирање по 15 min на 4 °C) и два пута пуфером TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl при pH 8). Хроматин је елуиран са куглица у два корака; прво у 100 μl пуфера за елуцију 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl при pH 8) на 65°C током 15 min, након чега су уследили центрифугирање и прикупљање супернатанта. Материјал са куглица је поново екстрахован у 100 μl TE + 0,67% SDS. Обједињени елуат (200 μl) инкубиран је преко ноћи на 65°C ради раскидања унакрсних веза и третиран са 50 μg/ml RNaseA током 15 min на 65°C и са 500 μg/ml протеиназе K током 3 h на 65°C. Узорци су екстраховани фенолом–хлороформом и преципитирани етанолом. ДНК је ресуспендована у 25 μl воде. Ради максималног искоришћења имунопреципитиране ДНК за молекуларне анализе, гени кандидати су амплификовани у паровима према оптимизованом протоколу дуплекс PCR-а, коришћењем два различита сета прајмера са сличним температурама топљења у једној реакцији.
(Casale et al. 2019)
 

Ултразвучни разарачи ћелија високих перформанси за биолошке узорке

Hielscher Ultrasonics је ваш партнер са дугогодишњим искуством када су у питању ултразвучни уређаји високих перформанси за разарање ћелија, лизу, екстракцију протеина, фрагментацију ДНК, РНК и хроматина, као и друге кораке преаналитичке припреме узорака. Са свеобухватном понудом лабораторијских ултразвучних хомогенизатора и уређаја за припрему узорака, Hielscher има идеалан ултразвучни уређај за вашу биолошку примену и захтеве.
Класични ултразвучни уређај са сондом и микроврхом, као што је UP200St (200W; погледајте слику лево), или један од ултразвучних уређаја за припрему узорака VialTweeter или UP200ST_TD_CupHorn са држачем VialHolder омиљени су модели у истраживачким и аналитичким лабораторијама. Класична ултразвучна сонда је идеална када је потребно лизирати, екстраховати или фрагментисати мањи број узорака. Уређаји за припрему узорака VialTweeter и UP200St_TD_CupHorn омогућавају истовремену соникацију до 10, односно до 5 бочица.
Ако је потребно обрадити велики број узорака (нпр. плоче са 96 бунарчића, микротитарске плоче итд.), UIP400MTP је идеална поставка за соникацију. UIP400MTP функционише као већа чашаста сонотрода која се пуни водом и има довољно простора за смештање плоча са микробунарчићима. Покретан снажним ултразвучним процесором од 400 вати, UIP400MTP обезбеђује веома равномерну и интензивну соникацију плоча са више бунарчића ради разарања ћелија, лизе узорака, солубилизације талога, екстракције протеина или фрагментације ДНК смицањем.

Прецизна контрола помоћу паметног софтвера

Сва Hielscher решења за соникацију снаге од 200 вати навише опремљена су дигиталним екраном у боји осетљивим на додир и интелигентним софтвером. Захваљујући паметном бележењу података, сви параметри ултразвучног процеса аутоматски се чувају у CSV датотеци на уграђеној SD картици чим се ултразвучни уређај покрене. То знатно олакшава истраживање и бележење података. Након испитивања соникације или припреме узорака, можете једноставно прегледати параметре сваког циклуса соникације и упоредити их.
Путем интуитивног менија могуће је унапред подесити бројне параметре пре соникације: на пример, ради контроле температуре у узорку и спречавања његове термичке деградације, може се подесити горња граница температуре узорка. Прикључиви температурни сензор, који се испоручује уз ултразвучни уређај, даје ултразвучном процесору повратне информације о стварној температури соникације. Када се достигне горња температурна граница, ултразвучни уређај паузира док се не достигне доња граница подешеног ∆T, а затим аутоматски поново започиње соникацију.
Ако је потребна соникација са одређеним уносом енергије, можете унапред подесити коначну ултразвучну енергију циклуса соникације. Наравно, ултразвучно пулсирање и циклични режим такође се могу појединачно подесити.
Да бисте поново користили своје најуспешније параметре соникације, можете сачувати различите режиме соникације (нпр. време соникације, интензитет, циклични режим итд.) као унапред подешене режиме, тако да се могу лако и брзо поново покренути.
Ради лакшег руковања, свим дигиталним ултразвучним уређајима може се даљински управљати путем било ког уобичајеног веб-прегледача (нпр. InternetExplorer, Safari, Chrome итд.). LAN веза се једноставно успоставља по принципу „прикључи и користи“ и не захтева инсталацију додатног софтвера.
Ми у компанији Hielscher знамо да успешна соникација биолошких узорака захтева прецизност и поновљивост. Зато смо наше ултразвучне уређаје осмислили као паметне уређаје са свим функцијама које омогућавају ефикасну, поуздану, репродуктивну и практичну припрему узорака.

Табела у наставку даје увид у приближан капацитет обраде наших ултразвучних система, од ултразвучних микроврхова и класичних ултразвучних хомогенизатора до ултразвучних уређаја MultiSample за практичну и поуздану припрему великог броја узорака: