Ultrazvučna liza uzoraka drosofila melanogastera

Drosophila melanogaster is widely used in laboratories as model organism. Therefore, pre-analytical preparation steps such as lysis, cell disruption, protein extraction and DNA shearing of Drosophila melanogaster samples must be frequently carried out. Ultrasonic dismembrators are reliable and efficient and can used to perform various tasks such as lysis, protein extraction or DNA fragmentation at ease by only adjusting ultrasonic process parameters. Ultrasonic homogenizers are thereby flexible tools with a broad range of applications.

Ultrazvučna liza i vađenje proteina

Liza, rastvorljivost ćelija, homogenizacija tkiva i vađenje proteina su tipični zadaci za ultrazvučne dismebratore u biološkim laboratorijama. Ultrazvučni dismebratori i poremećaji ćelija dobro odgovaraju homogenizovanju životinjskih tkiva, insekata (npr. Drosofila melanogastera, C. elegans) ili biljnih primeraka. Naknadna primena ultrazvučnosti je liza ćelijskih vešanja i kuglica kao i vađenje intracelularnih proteina.
Ultrazvučna liza i vađenje proteina su veoma pouzdani i reproduktivni procesi, koji se mogu obavljati na osnovu utvrđenih protokola. Pošto se intenzitet ultrazvučnog procesa može tačno prilagoditi putem parametara sonication kao što su amplitude, ciklus / puls, temperatura i volumen uzoraka, jednom kada se provereni protokoli ponove sa istim ishodom iznova i iznova.

Ultrazvučna DNK i fragmentacija RNK

After cell lysis and protein extraction, a common required step in sample preparation is the shearing and fragmentation of DNA, RNA, and chromatin, e.g. before chromatin immunoprecipitation (ChIP). DNA and RNA fragmentation can be reliably achieved by breaking the covalent bonds that hold the DNA together by physical forces. Using physical shearing such as sonication, at first the DNA strands are broken, then the DNA is fragmented into smaller pieces.
Ultrazvučna DNK fragmentacija je pouzdana i efikasna u prelivanju DNK do ciljane dužine, npr. 500bp (osnovni parovi). Glavne prednosti ultrazvučne DNK fragmentacije uključuju preciznu kontrolu parametara ultrazvučnog procesa i intenziteta. Parametri ultrazvučnog procesa mogu se podesiti intenzitetom podešavanja sonication, ciklusa i vremena precizno. To omogućava stvaranje željenih veličina DNK i ciljana dužina DNK se može pouzdano proizvesti, kao i reprodukovana. Ultrazvučno DNK prelivanje je takođe idealno za stvaranje delova DNK visoke molekularne težine.

Protocols for Ultrasonic Lysis of Drosophila melanogaster

U nastavku možete pronaći razne protokole za ultrasonično potpomognute lize, vađenje proteina i DNK ili fragmentaciju uzoraka drosofila.

Ultrazvučna liza za unakrsno povezivanje imunoprecipitacije (CLIP) Assay

CLIP assay was performed as previously reported with some modifications. Approximately 20 mg ovaries from 0- to 1-day-old wild-type females were UV crosslinked (3 × 2000 μJ/cm2), homogenized on ice in 1 mL RCB buffer (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) supplemented with 300 U RNAseOUT and placed on ice for 30 min. The homogenate was sonicated on ice, at 80% power, five times in 20 s bursts with a 60 s rest in between using the Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) i centrifuged (16000 × g za 5 min na 4°C). Rastvorljiv ekstrakt je bio preklinjen sa 20 μl Protein-G dinabeads za 20 min na 4°C. Nakon uklanjanja uzoraka za imunoboltaciju i količinu RNK unosa (1%), HP1 je imunoprecipovan anti-HP1 9A9 antitelom iz 450 μl precleared extract by incubation for 4 h with 50 μl Protein-G dynabeads. Imunoprecigiti su oprani 4 puta sa RCB- om. Da bi se izmakao imunopreciziranim RNAsima, kuglice su prokuvane u 100 μL UltraPure DEPC tretirane vode za 5 min. 900 μL Qiazol Reagent je dodat supernatant oporavljen za RNK pripremu. RNK pročišćen je kao predložak za sintezu CDNA pomoću oligo dT, slučajnih heksamera i SuperScript obrnutog transkripta III prema protokolu proizvođača.
(Cassale et al. 2019)

Ultrazvučna liza za Chromatin Immunoprecipitation Assay

Chromatin immunoprecipitation was performed according to the method described by Menet with minor modifications. Approximately 20 mg ovaries from 0- to 1-day-old wild-type females were homogenized in 1 mL of NEB buffer (10 mM HEPES-Na at pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na at pH 8, 0.5 mM EDTA-Na at pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM Spermidine, 0.15 mM Spermine, 1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors) with a homogenizer / immersion disperser 1 min (at 3000 rpm). The homogenate was transferred to a pre-chilled glass dounce and 15 full strokes were applied with a tight pestle. Free nuclei were then centrifuged at 6000xg for 10 min at 4°C. The nuclei-containing pellets were resuspended in 1 mL of NEB and centrifuged at 20000 × g for 20 min on sucrose gradient (0.65 mL of 1.6 M sucrose in NEB, 0.35 mL of 0.8 M sucrose in NEB). The pellet was resuspended in 1 mL of NEB and formaldehyde to a final concentration of 1%. Nuclei were cross-linked for 10 min at room temperature and quenched by adding 1/10 vol of 1.375 M glycine. The nuclei were collected by centrifugation at 6000 × g for 5 min. Nuclei were washed twice in 1 mL of NEB and resuspended in 1 mL of Lysis Buffer (15 mM HEPES-Na at pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, 1 mM EDTA at pH 8, 1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% Na Deoxycholate, 0.1% SDS, 0.5% N-lauroylsarcosine and 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors). Nuclei were sonicated using a Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) љest puta za 20 na i 1 min na ledu. Sonicated nuclei su centrifugirani na 13000 × g za 4 min na 4°C. Većina soničnih hromatina bila je dužine 500 do 1000 baznih parova (bp). Za svaku imunoprecipitaciju, 15 μg hromatina je inkubirano u prisustvu 10 μg HP1 9A9 monoklonalnog antitela (3 h na 4°C u rotirajućeg točka). Zatim je dodato 50 μl dinabeads proteina G i inkubacija je nastavljena preko noći na 4°C. Supernatantsi su odbačeni i uzorci su dva puta oprani u Lysis Baferu (svaki pere 15 min na 4 °C) i dva puta u TE Baferu (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl na pH 8). Hromatin je izmicao iz beadsa u dva koraka; prvo u 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl na pH 8) na 65°C za 15 min, nakon čega sledi centrifugacija i oporavak supernatanta. Materijal od beads je ponovo izdvojen u 100 μl TE + 0,67% SDS. Kombinovani eluate (200 μl) je inkubiran preko noći na 65°C da bi se obrnule ukrštene veze i tretiralo 50 μg/ml RNaseA za 15 min na 65°C i za 500 μg/ml Proteinase K za 3 h na 65°C. Uzorci su izvađeni fenol-hloroform i etanol je prenagljen. DNK je ponovo zamenjena u 25 μl vode. Za maksimiziranje molekularnih analiza sa DNK imunoprecipited, geni kandidata su pojačani u parovima kroz optimizovani duplex-PCR protokol korišćenjem dva različita seta prajmera koji imaju slične temperature topljenja u jednoj reakciji.
(Casale et al. 2019)

Ultrazvučni poremećaji ultrazvučnih ćelija visokih performansi za biološke uzorke

Hielscher Ultrasonics je vaš dugo iskusan partner kada su u pitanju ultrazvučni uređaji visokih performansi za prekid ćelija, lizu, vađenje proteina, DNK, RNK i fragmentaciju hromatina kao i druge korake pripreme pre-analitičkog uzorka. Nudeći sveobuhvatan portfolio ultrazvučnih laboratorijskih homogenizatora i jedinica za pripremu uzoraka, Hielscher ima idealan ultrazvučni uređaj za vašu biološku primenu i zahteve.
Klasičan ultrazvučni tip sonde sa mikro-savetom kao što je УП200Ст (200W; pogledajte sliku levo) ili jednu od jedinica za pripremu ultrazvučnih uzoraka ВиалТвеетер или UP200ST_TD_CupHorn sa VialHolder-om su omiljeni modeli u istraživačkim i analitičkim laboratorijama. Klasična ultrazvučna sonda je idealna, kada se pripremi manje uzoraka mora biti lisnato, izdvojeno ili fragmentirano. Jedinice za pripremu uzoraka VialTweeter i UP200St_TD_CupHorn omogućavaju istovremenu sonikuaciju do 10 odnosno 5 bočica.
Ako se moraju obraditi visoki brojevi uzoraka (npr. 96-bunarske ploče, mikrotiter ploče itd.) UIP400MTP je idealna postavka sonication. UIP400MTP funkcioniše kao veći cuphorn, koji je ispunjen vodom i ima dovoljno prostora za držanje mikro-bunarskih ploča. Napajan snažnim ultrazvučnim procesorom od 400 vati, UIP400MTP isporučuje veoma ujednačenu i intenzivnu sonikuaciju više bunarskih ploča u cilju ometanja ćelija, uzoraka lize, rastvorljivih kuglica, vađenja proteina ili DNK.

Precizna kontrola putem pametnog softvera

Sva Hielscher sonication rešenja od 200 vati naviše opremljena su digitalnim ekranom osetljivim na dodir u boji i inteligentnim softverom. Putem pametnih podataka koji protokolišu sve parametre ultrazvučnog procesa automatski se čuvaju kao CSV datoteka na ugrađenoj SD-kartici čim se pokrene ultrazvučni. Ovo čini istraživanje i protokolarstvo mnogo pogodnijim. Nakon ispitivanja sonikacije ili pripreme uzorka, možete jednostavno da pregledate parametre sonication svake sonication run i uporedite ih.
Via the intuitive menu, numerous parameter can be preset before sonication: For instance, to control the temperature in the sample and to prevent its thermal degradation, an upper limit of sample temperature can be set. A pluggable temperature sensor, which comes with the ultrasonic unit, gives the ultrasonic processor feedback on the actual sonication temperature. When the upper temperature limit is reached, the ultrasonic device pauses until the lower limit of the set ∆T is reached and starts then automatically sonicating again.
Ako je potrebna sonicija sa određenim energetskim unosom, možete unapred da konkretizovanje ultrazvučne energije sonifikacije pokrene. Naravno, ultrazvučna pulsacija i režim ciklusa takođe mogu da se postave pojedinačno.
Da biste ponovo koristili svoje najuspešnije parametre sonication-a, možete sačuvati razne sonication modove (npr. vreme sonikacije, intenzitet, režim ciklusa itd.) kao unapred podešene režime, tako da se mogu lako i brzo ponovo pokrenuti.
Radi veće operativne pogodnosti, svim digitalnim ultrazvučnim jedinicama može se upravljati preko daljinskog upravljača pregledača u bilo kom zajedničkom pregledaču (npr. InternetExplorer, Safari, Chrome itd.). LAN veza je jednostavno podešavanje plug-n-play i ne zahteva dodatnu instalaciju softvera.
Mi u Hielscheru znamo da uspešna sonicija bioloških uzoraka zahteva preciznost i ponavljanje. Stoga smo naše ultrazvučnike osmislili kao pametne uređaje sa svim funkcijama koje omogućavaju efikasan, pouzdan, reproduktivo i pogodan preparat uzorka.

The table below gives you an indication of the approximate processing capacity of our ultrasonic systems from ultrasonic micro-tips and classic ultrasonic homogenizers to MultiSample ultrasonicators for the convenient, reliable preparation of numerous samples: