Ултразвучна лиза узорака Дросопхила Меланогастер

Дросопхила меланогастер се широко користи у лабораторијама као моделни организам. Због тога се морају често спроводити преданалитички припремни кораци као што су лиза, разбијање ћелија, екстракција протеина и пресецање ДНК узорака Дросопхила меланогастер. Ултразвучни дисмембратори су поуздани и ефикасни и могу се користити за обављање различитих задатака као што су лиза, екстракција протеина или фрагментација ДНК само подешавањем параметара ултразвучног процеса. Ултразвучни хомогенизатори су стога флексибилни алати са широким спектром примена.

Ултразвучна лиза и екстракција протеина

Лиза, солубилизација ћелија, хомогенизација ткива и екстракција протеина су типични задаци за ултразвучне дисмембраторе у биолошким лабораторијама. Ултразвучни дисмембратори и дисруптори ћелија су погодни за хомогенизацију животињских ткива, инсеката (нпр. Дросопхила меланогастер, Ц. елеганс) или биљних узорака. Наредне примене ултразвучне обраде су лиза ћелијских суспензија и пелета, као и екстракција интрацелуларних протеина.
Ултразвучна лиза и екстракција протеина су високо поуздани и поновљиви процеси, који се могу изводити на основу утврђених протокола. Пошто се интензитет ултразвучног процеса може тачно подесити преко параметара соникације као што су амплитуда, циклус/пулсни режим, температура и запремина узорка, једном доказани протоколи могу се понављати са истим исходом изнова и изнова.

Ултразвучна фрагментација ДНК и РНК

Након ћелијске лизе и екстракције протеина, уобичајени потребни корак у припреми узорка је смицање и фрагментација ДНК, РНК и хроматина, нпр. пре имунопреципитације хроматина (ЦхИП). Фрагментација ДНК и РНК се може поуздано постићи разбијањем ковалентних веза које држе ДНК заједно физичким силама. Коришћењем физичког смицања као што је соникација, прво се ланци ДНК ломе, а затим се ДНК фрагментира на мање комаде.
Ултразвучна фрагментација ДНК је поуздана и ефикасна у смицању ДНК до циљане дужине, нпр. 500 бп (базни парови). Главне предности ултразвучне фрагментације ДНК укључују прецизну контролу параметара и интензитета ултразвучног процеса. Параметри ултразвучног процеса могу се подесити прецизним подешавањем интензитета соникације, циклуса и времена. Ово омогућава стварање жељених величина ДНК, а циљана дужина ДНК може се поуздано произвести и репродуковати. Ултразвучно смицање ДНК је такође идеално за стварање фрагмената ДНК високе молекуларне тежине.

Протоколи за ултразвучну лизу Дросопхила меланогастер

У наставку можете пронаћи различите протоколе за ултразвучно потпомогнуту лизу, екстракцију протеина и фрагментацију ДНК или хроматина узорака Дросопхила.

Ултразвучна лиза за испитивање имунопреципитације унакрсног повезивања (ЦЛИП).

ЦЛИП тест је изведен као што је раније објављено са неким модификацијама. Приближно 20 мг јајника женки дивљег типа старих од 0 до 1 дана је УВ умрежено (3 × 2000 μЈ/цм2), хомогенизовано на леду у 1 мЛ РЦБ пуфера (50 мМ ХЕПЕС пХ 7,4, 200 мМ НаЦл, 2,5 мМ МгЦл2, 0,1% Тритон Кс-100, 250 мМ сахарозе, 1 мМ ДТТ, 1 × потпуни инхибитори протеазе без ЕДТА, 1 мМ ПМСФ) допуњен са 300 У РНАсеОУТ и стављен на лед на 30 минута. Хомогенат је обрађен ултразвуком на леду, при 80% снаге, пет пута у рафовима од 20 с са паузом од 60 с између помоћу Хиелсцхер ултразвучног процесора УП100Х (100 В, 30 кХз) и центрифугиран (16000 × г током 5 минута на 4 ° Ц). Растворљиви екстракт је претходно пречишћен са 20 μл Протеин-Г динабеадс током 20 минута на 4 ° Ц. Након уклањања узорака за имуноблотирање и квантитативног одређивања уноса РНК (1%), ХП1 је имунопреципитиран анти-ХП1 9А9 антителом из 450 μл претходно очишћеног екстракта инкубацијом током 4 х са 50 μл Протеин-Г динабеадс. Имунопреципитати су испрани 4 пута са РЦБ. Да би се елуирале имунопреципитиране РНК, пелетиране куглице су куване у 100 μЛ воде третиране УлтраПуре ДЕПЦ током 5 минута. 900 μЛ Киазол реагенса је додато у супернатант који је извучен за припрему РНК. Пречишћена РНК је коришћена као шаблон за синтезу цДНК коришћењем олиго дТ, насумичних хексамера и СуперСцрипт реверзне транскриптазе ИИИ у складу са протоколом произвођача.
(Цассале ет ал. 2019)

Ултразвучна лиза за испитивање имунопреципитације хроматина

Имунопреципитација хроматина је изведена према методи коју је описао Менет уз мање модификације. Приближно 20 мг јајника женки дивљег типа старих од 0 до 1 дана је хомогенизовано у 1 мЛ НЕБ пуфера (10 мМ ХЕПЕС-На при пХ 8,0, 10 мМ НаЦл, 0,1 мМ ЕГТА-На при пХ 8, 0,5 мМ ЕДТА-На на пХ 8, 1 мМ ДТТ, 0,5% НП-40, 0,5 мМ спермидина, 0,15 мМ спермина, 1× потпуни инхибитори протеазе без ЕДТА) са хомогенизатором / имерзионим дисперзером 1 мин (на 3000 о/мин). Хомогенат је пребачен у претходно охлађену стаклену посуду и 15 пуних потеза је нането чврстим тучком. Слободна језгра су затим центрифугирана на 6000кг током 10 минута на 4°Ц. Пелете које садрже језгра су ресуспендоване у 1 мЛ НЕБ и центрифугиране на 20000 × г током 20 минута на градијенту сахарозе (0,65 мЛ 1,6 М сахарозе у НЕБ, 0,35 мЛ 0,8 М сахарозе у НЕБ). Пелет је ресуспендован у 1 мЛ НЕБ и формалдехида до коначне концентрације од 1%. Језгра су умрежена 10 минута на собној температури и угашена додавањем 1/10 вол 1,375 М глицина. Језгра су сакупљена центрифугирањем на 6000 × г током 5 минута. Језгра су два пута испрана у 1 мЛ НЕБ и ресуспендована у 1 мЛ пуфера за лизу (15 мМ ХЕПЕС-На при пХ 7,6, 140 мМ НаЦл, 0,5 мМ ЕГТА, 1 мМ ЕДТА при пХ 8, 1% Тритон0 Кс-100 мМ ДТТ, 0,1% На деоксихолат, 0,1% СДС, 0,5% Н-лауроилсаркозин и 1× ЕДТА-фрее потпуни инхибитори протеазе). Језгра су соникирана коришћењем Хиелсцхер ултразвучног процесора УП100Х (100 В, 30 кХз) шест пута по 20 с на и 1 мин на леду. Соницирана језгра су центрифугирана на 13000 × г током 4 минута на 4 ° Ц. Већина ултразвучног хроматина била је дугачка 500 до 1000 парова база (бп). За сваку имунопреципитацију, 15 μг хроматина је инкубирано у присуству 10 μг ХП1 9А9 моноклонског антитела (3 х на 4 ° Ц у ротирајућем точку). Затим је додато 50 μл динабеадс протеина Г и инкубација је настављена преко ноћи на 4°Ц. Супернатанти су одбачени и узорци су два пута испрани у пуферу за лизу (свако прање 15 мин на 4 °Ц) и два пута у ТЕ пуферу (1 мМ ЕДТА, 10 мМ ТрисХЦл на пХ 8). Хроматин је елуиран из перли у два корака; прво у 100 μл елуиционог пуфера 1 (10 мМ ЕДТА, 1% СДС, 50 мМ ТрисХЦл на пХ 8) на 65°Ц током 15 минута, након чега следи центрифугирање и обнављање супернатанта. Материјал перли је поново екстрахован у 100 μл ТЕ + 0,67% СДС. Комбиновани елуат (200 μл) је инкубиран преко ноћи на 65 ° Ц да би се преокренуле унакрсне везе и третиран са 50 μг / мл РНАсеА током 15 минута на 65 ° Ц и са 500 μг / мл Протеиназе К током 3 сата на 65 ° Ц. Узорци су екстраховани фенол-хлороформом и исталожени етанолом. ДНК је ресуспендована у 25 μл воде. Да би се максимизирале молекуларне анализе са ДНК имунопреципитираном, гени кандидати су амплификовани у паровима кроз оптимизовани дуплекс-ПЦР протокол коришћењем два различита сета прајмера који имају сличне температуре топљења у једној реакцији.
(Цасале ет ал. 2019)
 

Ултразвучни дисруптори ћелија високих перформанси за биолошке узорке

Хиелсцхер Ултрасоницс је ваш партнер са дугогодишњим искуством када су у питању ултразвучни апарати високих перформанси за разбијање ћелија, лизу, екстракцију протеина, ДНК, РНК и фрагментацију хроматина, као и друге кораке пре-аналитичке припреме узорка. Нудећи свеобухватан портфолио ултразвучних лабораторијских хомогенизатора и јединица за припрему узорака, Хиелсцхер има идеалан ултразвучни уређај за вашу биолошку примену и захтеве.
Класични ултрасоникатор типа сонде са микро врхом као што је УП200Ст (200В; погледајте слику лево) или једну од јединица за ултразвучну припрему узорака ВиалТвеетер или УП200СТ_ТД_ЦупХорн са ВиалХолдер-ом су омиљени модели у истраживачким и аналитичким лабораторијама. Класична ултразвучна сонда је идеална, када се за припрему мање узорака мора лизирати, екстраховати или фрагментирати. Јединице за припрему узорака ВиалТвеетер и УП200Ст_ТД_ЦупХорн омогућавају истовремену соникацију до 10 или 5 бочица, респективно.
Ако се мора обрадити велики број узорака (нпр. плоче са 96 јажица, микротитарске плоче итд.), УИП400МТП је идеална поставка соникације. УИП400МТП функционише као већи пехар, који је напуњен водом и има довољно простора за држање микро-бунар плоча. Покренут снажним ултразвучним процесором од 400 вати, УИП400МТП испоручује веома уједначену и интензивну ултразвучну обраду плоча са више јажица како би пореметила ћелије, лизирала узорке, растворила пелете, екстраховала протеине или смицала ДНК.

Прецизна контрола преко Смарт софтвера

Сва решења за соникацију Хиелсцхер од 200 вати навише опремљена су дигиталним екраном осетљивим на додир у боји и интелигентним софтвером. Преко паметног протокола података сви параметри ултразвучног процеса се аутоматски чувају као ЦСВ фајл на уграђеној СД картици чим се ултразвучни апарат покрене. Ово чини истраживање и протоколирање много погоднијим. Након соникационих испитивања или припреме узорка, можете једноставно прегледати параметре соникације сваког покретања соникације и упоредити их.
Преко интуитивног менија, бројни параметри се могу унапред подесити пре ултразвука: На пример, да би се контролисала температура у узорку и да би се спречила његова термичка деградација, може се подесити горња граница температуре узорка. Сензор температуре који се може прикључити, који долази са ултразвучном јединицом, даје ултразвучном процесору повратну информацију о стварној температури ултразвучне обраде. Када се достигне горња граница температуре, ултразвучни уређај се паузира док се не достигне доња граница подешеног ∆Т и почиње, а затим поново аутоматски врши соникацију.
Ако је потребна соникација са одређеним енергетским уносом, можете унапред подесити коначну ултразвучну енергију за соникацију. Наравно, ултразвучно пулсирање и режим циклуса се такође могу индивидуално подесити.
Да бисте поново користили своје најуспешније параметре соникације, можете сачувати различите режиме соникације (нпр. време ултразвука, интензитет, режим циклуса итд.) као унапред подешене режиме, тако да се могу лако и брзо поново покренути.
За већу оперативну погодност, свим дигиталним ултразвучним јединицама се може управљати преко даљинског управљача претраживача у било ком уобичајеном претраживачу (нпр. ИнтернетЕкплорер, Сафари, Цхроме итд.). ЛАН веза је једноставно плуг-н-плаи подешавање и не захтева додатну инсталацију софтвера.
Ми у Хиелсцхеру знамо да успешна соникација биолошких узорака захтева прецизност и поновљивост. Стога смо дизајнирали наше ултразвучне апарате као паметне уређаје са свим карактеристикама које омогућавају ефикасну, поуздану, поновљиву и погодну припрему узорка.

Табела у наставку вам даје индикацију приближног капацитета обраде наших ултразвучних система од ултразвучних микро-врхова и класичних ултразвучних хомогенизатора до МултиСампле ултрасоникатора за практичну и поуздану припрему бројних узорака: