Ultrazvučna liza uzoraka drosofila melanogastera

Drosophila melanogaster se široko koristi u laboratorijama kao model organizma. Zbog toga se često moraju sprovoditi pre-analitički koraci pripreme kao što su liza, poremećaj ćelija, vađenje proteina i DNK prelivanje uzoraka drosofila melanogastera. Ultrazvučni dismebratori su pouzdani i efikasni i mogu se koristiti za obavljanje različitih zadataka kao što su liza, vađenje proteina ili fragmentacija DNK tako što se samo prilagođavaju parametri ultrazvučnog procesa. Ultrazvučni homogenizeri su time fleksibilni alati sa širokim spektrom primena.

Ultrazvučna liza i vađenje proteina

Liza, rastvorljivost ćelija, homogenizacija tkiva i vađenje proteina su tipični zadaci za ultrazvučne dismebratore u biološkim laboratorijama. Ultrazvučni dismebratori i poremećaji ćelija dobro odgovaraju homogenizovanju životinjskih tkiva, insekata (npr. Drosofila melanogastera, C. elegans) ili biljnih primeraka. Naknadna primena ultrazvučnosti je liza ćelijskih vešanja i kuglica kao i vađenje intracelularnih proteina.
Ultrazvučna liza i vađenje proteina su veoma pouzdani i reproduktivni procesi, koji se mogu obavljati na osnovu utvrđenih protokola. Pošto se intenzitet ultrazvučnog procesa može tačno prilagoditi putem parametara sonication kao što su amplitude, ciklus / puls, temperatura i volumen uzoraka, jednom kada se provereni protokoli ponove sa istim ishodom iznova i iznova.

Ultrazvučna DNK i fragmentacija RNK

Nakon ćelijske lize i vađenja proteina, uobičajeni zahtevani korak u pripremi uzoraka je šištanje i fragmentacija DNK, RNK i hromatina, npr. pre imunoprecipitacije hromatina (CHIP). DNK i RNK fragmentacija se pouzdano može postići razbijanjem kovalentnih veza koje drže DNK zajedno fizičkim silama. Koristeći fizičko prelivanje kao što je sonication, u početku su DNK pramenovi razbijeni, a onda je DNK fragmentirana na manje delove.
Ultrazvučna DNK fragmentacija je pouzdana i efikasna u prelivanju DNK do ciljane dužine, npr. 500bp (osnovni parovi). Glavne prednosti ultrazvučne DNK fragmentacije uključuju preciznu kontrolu parametara ultrazvučnog procesa i intenziteta. Parametri ultrazvučnog procesa mogu se podesiti intenzitetom podešavanja sonication, ciklusa i vremena precizno. To omogućava stvaranje željenih veličina DNK i ciljana dužina DNK se može pouzdano proizvesti, kao i reprodukovana. Ultrazvučno DNK prelivanje je takođe idealno za stvaranje delova DNK visoke molekularne težine.

Protocols for Ultrasonic Lysis of Drosophila melanogaster

U nastavku možete pronaći razne protokole za ultrasonično potpomognute lize, vađenje proteina i DNK ili fragmentaciju uzoraka drosofila.

Ultrazvučna liza za unakrsno povezivanje imunoprecipitacije (CLIP) Assay

CLIP asay je izvršen kao što je ranije prijavljeno uz neke izmene. Oko 20 mg jajnika od 0 do 1 dan starih ženki divljeg tipa bili su UV ukršteni (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizovani na ledu u 1 mL RCB baferu (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) dopunjen sa 300 URNAseOUT i stavljen na led za 30 min. Homogenate je bio soničan na ledu, sa 80% snage, pet puta u 20-oj eksploziji sa 60%, između korišćenja Hielscher ultrazvučnog procesora UP100H (100 W, 30 kHz) i centrifuged (16000 × g za 5 min na 4°C). Rastvorljiv ekstrakt je bio preklinjen sa 20 μl Protein-G dinabeads za 20 min na 4°C. Nakon uklanjanja uzoraka za imunoboltaciju i količinu RNK unosa (1%), HP1 je imunoprecipovan anti-HP1 9A9 antitelom iz 450 μl precleared extract by incubation for 4 h with 50 μl Protein-G dynabeads. Imunoprecigiti su oprani 4 puta sa RCB- om. Da bi se izmakao imunopreciziranim RNAsima, kuglice su prokuvane u 100 μL UltraPure DEPC tretirane vode za 5 min. 900 μL Qiazol Reagent je dodat supernatant oporavljen za RNK pripremu. RNK pročišćen je kao predložak za sintezu CDNA pomoću oligo dT, slučajnih heksamera i SuperScript obrnutog transkripta III prema protokolu proizvođača.
(Cassale et al. 2019)

Ultrazvučna liza za Chromatin Immunoprecipitation Assay

Hromatinska imunoprecipitacija izvedena je prema metodi koju je Menet opisao sa manjim izmenama. Približno 20 mg jajnika od 0 do 1 dan starih ženki divljeg tipa homogenizovano je u 1 mL NEB bafera (10 mM HEPES-Na na pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na na pH 8, 0,5 mM EDTA-Na na pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidine, 0,15 mM Spermine, 1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors) with a homogenizer / immersioner 1 min (at 300 Homogenat je prebačen u prethodno ohlađenu staklenu stvar i primenjeno je 15 punih udaraca sa tesnom štetočinom. Besplatni jezgro je tada centrifugiran na 6000xg za 10 min na 4°C. Kuglice koje sadrže jezgro ponovo su zamenjene u 1 mL NEB-a i centrifugovane na 20000 × g za 20 min na sucrose prelivu (0,65 mL od 1,6 M sucrose u NEB-u, 0,35 mL od 0,8 M sucrose u NEB-u). Kuglica je ponovo zamenjena u 1 mL NEB-a i formaldehyde do konačne koncentracije od 1%. Jezgro je bilo ukršteno 10 min na sobnoj temperaturi i ugašeno dodavanjem 1/10 vol od 1.375 M glicina. Jezgro je prikupljeno centrifugacijom na 6000 × g za 5 min. Jezgro je oprano dva puta u 1 mL NEB-a i ponovo je zamenjeno u 1 mL Lysis Buffer (15 mM HEPES-Na na pH 7.6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA na pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine and 1× EDTA-free Complete Proteaseors). Nuclei su bili sonični pomoću Hielscher ultrazvučnog procesora UP100H (100 W, 30 kHz) љest puta za 20 na i 1 min na ledu. Sonicated nuclei su centrifugirani na 13000 × g za 4 min na 4°C. Većina soničnih hromatina bila je dužine 500 do 1000 baznih parova (bp). Za svaku imunoprecipitaciju, 15 μg hromatina je inkubirano u prisustvu 10 μg HP1 9A9 monoklonalnog antitela (3 h na 4°C u rotirajućeg točka). Zatim je dodato 50 μl dinabeads proteina G i inkubacija je nastavljena preko noći na 4°C. Supernatantsi su odbačeni i uzorci su dva puta oprani u Lysis Baferu (svaki pere 15 min na 4 °C) i dva puta u TE Baferu (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl na pH 8). Hromatin je izmicao iz beadsa u dva koraka; prvo u 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl na pH 8) na 65°C za 15 min, nakon čega sledi centrifugacija i oporavak supernatanta. Materijal od beads je ponovo izdvojen u 100 μl TE + 0,67% SDS. Kombinovani eluate (200 μl) je inkubiran preko noći na 65°C da bi se obrnule ukrštene veze i tretiralo 50 μg/ml RNaseA za 15 min na 65°C i za 500 μg/ml Proteinase K za 3 h na 65°C. Uzorci su izvađeni fenol-hloroform i etanol je prenagljen. DNK je ponovo zamenjena u 25 μl vode. Za maksimiziranje molekularnih analiza sa DNK imunoprecipited, geni kandidata su pojačani u parovima kroz optimizovani duplex-PCR protokol korišćenjem dva različita seta prajmera koji imaju slične temperature topljenja u jednoj reakciji.
(Casale et al. 2019)

Ultrazvučni poremećaji ultrazvučnih ćelija visokih performansi za biološke uzorke

Hielscher Ultrasonics je vaš dugo iskusan partner kada su u pitanju ultrazvučni uređaji visokih performansi za prekid ćelija, lizu, vađenje proteina, DNK, RNK i fragmentaciju hromatina kao i druge korake pripreme pre-analitičkog uzorka. Nudeći sveobuhvatan portfolio ultrazvučnih laboratorijskih homogenizatora i jedinica za pripremu uzoraka, Hielscher ima idealan ultrazvučni uređaj za vašu biološku primenu i zahteve.
Klasičan ultrazvučni tip sonde sa mikro-savetom kao što je УП200Ст (200W; pogledajte sliku levo) ili jednu od jedinica za pripremu ultrazvučnih uzoraka ВиалТвеетер или UP200ST_TD_CupHorn sa VialHolder-om su omiljeni modeli u istraživačkim i analitičkim laboratorijama. Klasična ultrazvučna sonda je idealna, kada se pripremi manje uzoraka mora biti lisnato, izdvojeno ili fragmentirano. Jedinice za pripremu uzoraka VialTweeter i UP200St_TD_CupHorn omogućavaju istovremenu sonikuaciju do 10 odnosno 5 bočica.
Ako se moraju obraditi visoki brojevi uzoraka (npr. 96-bunarske ploče, mikrotiter ploče itd.) UIP400MTP je idealna postavka sonication. UIP400MTP funkcioniše kao veći cuphorn, koji je ispunjen vodom i ima dovoljno prostora za držanje mikro-bunarskih ploča. Napajan snažnim ultrazvučnim procesorom od 400 vati, UIP400MTP isporučuje veoma ujednačenu i intenzivnu sonikuaciju više bunarskih ploča u cilju ometanja ćelija, uzoraka lize, rastvorljivih kuglica, vađenja proteina ili DNK.

Precizna kontrola putem pametnog softvera

Sva Hielscher sonication rešenja od 200 vati naviše opremljena su digitalnim ekranom osetljivim na dodir u boji i inteligentnim softverom. Putem pametnih podataka koji protokolišu sve parametre ultrazvučnog procesa automatski se čuvaju kao CSV datoteka na ugrađenoj SD-kartici čim se pokrene ultrazvučni. Ovo čini istraživanje i protokolarstvo mnogo pogodnijim. Nakon ispitivanja sonikacije ili pripreme uzorka, možete jednostavno da pregledate parametre sonication svake sonication run i uporedite ih.
Putem intuitivnog menija, brojni parametri se mogu unapred postaviti pre sonicije: na primer, da bi se kontrolisala temperatura u uzorku i sprečila njena toplotna degradacija, može se postaviti gornja granica temperature uzorka. Senzor za dodatnu temperaturu, koji dolazi sa ultrazvučnom jedinicom, daje ultrazvučnom procesoru povratnu informaciju o stvarnoj temperaturi sonication. Kada se dostigne gornja granica temperature, ultrazvučni uređaj pauzira dok se ne dostigne donja granica seta ∆T i počne automatski ponovo da se sonicira.
Ako je potrebna sonicija sa određenim energetskim unosom, možete unapred da konkretizovanje ultrazvučne energije sonifikacije pokrene. Naravno, ultrazvučna pulsacija i režim ciklusa takođe mogu da se postave pojedinačno.
Da biste ponovo koristili svoje najuspešnije parametre sonication-a, možete sačuvati razne sonication modove (npr. vreme sonikacije, intenzitet, režim ciklusa itd.) kao unapred podešene režime, tako da se mogu lako i brzo ponovo pokrenuti.
Radi veće operativne pogodnosti, svim digitalnim ultrazvučnim jedinicama može se upravljati preko daljinskog upravljača pregledača u bilo kom zajedničkom pregledaču (npr. InternetExplorer, Safari, Chrome itd.). LAN veza je jednostavno podešavanje plug-n-play i ne zahteva dodatnu instalaciju softvera.
Mi u Hielscheru znamo da uspešna sonicija bioloških uzoraka zahteva preciznost i ponavljanje. Stoga smo naše ultrazvučnike osmislili kao pametne uređaje sa svim funkcijama koje omogućavaju efikasan, pouzdan, reproduktivo i pogodan preparat uzorka.

Sledeća tabela vam daje nagoveštaj približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih sistema od ultrazvučnih mikro-saveta i klasičnih ultrazvučnih homogenizatora do MultiSample ultrazvučnih za prigodnu, pouzdanu pripremu brojnih uzoraka: