Ултразвучна припрема узорака Ц. Елеганс

Ц. елеганс, нематода, је широко коришћен моделни организам у биологији. Припрема узорка пре анализе захтева лизу, екстракцију протеина и липида, као и фрагментацију РНК, што се може поуздано извести ултразвуком. Ултразвучни дисруптори ћелија су поуздани, софистицирани и лаки за употребу уређаји за брзу припрему узорака Ц. елеганс.

Ултразвучна припрема узорака Ц. Елеганс

Ц. елеганс су округли црви, који се широко користе у истраживачким лабораторијама за истраживање геномике, развојне биологије и болести. Многи гени у геному Ц. елеганс имају функционалне парњаке код људи. Стога је црв нематода изузетно користан модел за људске болести. Друге предности за широку употребу Ц. елеганс су лака и јефтина култивација на плочама које садрже бактерије (нпр. Е. цоли), провидност, практично руковање, као и могућност замрзавања и чувања црва на дужи период.
Анализа протеина и липида су редовне процедуре у лабораторијама, а ултразвучна припрема узорака је успостављена метода за лизу нематода Ц. елеганс у свакој фази развоја (тј. ембриона, ларве Л1-Л4, одраслих). Пошто се Ц. елеганс такође користи као систем за експресију протеина за прекомерну експресију циљаних протеина, потребна је поуздана, поновљива метода лизе и екстракције протеина, која даје високе приносе протеина. Ултразвучни системи за разбијање ћелија и екстракцију доступни су као хомогенизатори типа сонде и ултразвучни уређаји за више узорака. Услужујући прикладну припрему узорака и све врсте бројева узорака, Хиелсцхер Ултрасоницс има идеалан ултразвучни дисруптор ћелија за вашу лабораторијску процедуру.

Ултразвучни протоколи за Ц. Елеганс дисрупцију и лизу

Ултразвучна хомогенизација и лиза Ц. елеганс и накнадна екстракција протеина и липида могу се извести коришћењем различитих процедура коришћењем различитих пуфера за хомогенизацију и лизу итд. Свим протоколима за лизу заједничко је да се узорци морају непрекидно држати на леду да би се спречила деградација протеина. У наставку вам представљамо неке поуздане и брзе ултразвучне протоколе за лизу и екстракцију за припрему висококвалитетних узорака Ц. елеганс који садрже протеине или липиде.

Предности ултразвучног Ц. елеганс Лисис

• Поуздан
• репродуцибилан
• прецизно контролисан температуром
• поуздана контрола процеса
• нежна метода
• лако се примењује
• Сафе

Ултразвучна екстракција протеина из узорака Ц. елеганс

Ултразвучна лиза и екстракција протеина црва Ц. елеганс могу се извести коришћењем различитих протокола. У наставку вам представљамо неколико поузданих и брзих протокола за лизу за поновљиве резултате екстракције протеина.

Брза припрема цитосолног екстракта из црва Ц. елеганс ултразвуком

Са следећим протоколом можете припремити лизате Ц. елеганс за мање од 30 минута.
Збирка Ц. елеганс
Изаберите жељене црве Ц. елеганс у епрувету са фосфатним пуфером од 1,5 мл (ПБС) или их исперите са плоче са 1,5 мл ПБС. Центрифугирајте 1 мин на 2000 обртаја у минути до пелета. Држите узорке све време на леду.
Затим, два пута оперите црве са ПБС.
Након тога, два пута оперите црве са ддХ₂О.
Ресуспендујте црве у најмање 500 ул пуфера за хомогенизацију (ХБ). Узорци црва су сада спремни за ултразвучну лизу.
За већи квалитет протеинског екстракта, можда ћете желети да смањите бактеријску контаминацију прањем црва по 5 минута у ПБС и стерилној, ултра чистој води (ддХ₂О) или извршити флоатацију сахарозе. Држите узорке црва непрекидно на леду.

Ултрасониц Ц. елеганс Лисис Протоцол

• Уверите се да сте унапред припремили ултразвучни апарат тако да ултразвучни хомогенизатор буде спреман за употребу (монтирана сонда, програм за соникацију унапред подешен).

Ако је ваш ултрасоникатор постављен на постоље, поставите ледену купку са вашим епруветама за узорке испод ултразвучне сонде и уметните ултразвучну сонду у епрувету од 1,5 мл.

• За лизу Ц. елеганс са УП200Ст или УП200Хт, ултразвук треба да се изведе коришћењем микроврха (нпр. сонде од 2 мм С26д2; види слику лево) при 40% амплитуде током 1 секунде са паузама од 30 секунди између. 5 циклуса соникације за сваку 1 секунду са паузама од 30 секунди су идеални за лизу Ц. елеганс. Ако извршите лизу по први пут, можете проверити напредак лизе у малим аликвотима узорка након сваког импулса помоћу микроскопа.
• Лиза се успешно завршава када се црви поремете. Прекомерна соникација доводи до ломљења језгара и постаје видљива када узорак постане вискозан или се запени. Да бисте спречили деградацију узорка, користите више импулса ако је потребно. Немојте повећавати време сваког ултразвучног пулсног циклуса да бисте добили висококвалитетне протеинске екстракте.
• Очистите ћелијски лизат центрифугирањем ултразвучно лизираних црва на 14.000 обртаја у минути током 10 минута на 4ºЦ.
• Затим, пренесите супернатант у свежу епрувету и припремите се за имунопреципитацију или друге тестове.

Напомена за пуфер за хомогенизацију: Припремите пуфер за хомогенизацију за горњи протокол ултразвучне лизе на следећи начин:

Високопропусна лиза Ц. елеганс у плочама са 96 бунарчића помоћу УИП400МТП Плате Соницатор

Ц. елеганс Лисис (одрасле нематоде)
УИП400МТП 80% амплитуда, 20 циклуса (сваки циклус соникације: 30 секунди укључено, 30 секунди искључено)
пуфер за лизу:

• Опција 1) 4% СДС, 0,1 М Трис/ХЦл пХ 8,0, 1 мМ ЕДТА
• Опција 2) за ко-имунопреципитацију (цо-ИП): 10 мМ Трис ХЦл (пХ 7,5), 150 мМ НаЦл, 0,5 мМ ЕДТА, 0,5 % НП-40 (комплетни коктел инхибитора протеиназе)

Фрагментација ДНК високе пропусности
Ц. елеганс (одрасле нематоде) ДНК 200-300бп: УИП400МТП плочасти соникатор – подесити 80% амплитуде, 30 импулса – сваких 30 секунди укључено, 30 секунди искључено

УИП400МТП соникатор за плоче за припрему узорака високог протока уједначено обрађује узорке у микротитарским плочама са више јажица и плочама са 96 јажица

Ултразвучна лиза Ц. елеганс за квантитативне тестове пречишћавања афинитета

Ембриони Ц. елеганс (∼2 милиона по репликату) су свеже сакупљени у биолошком троструком примерку бељењем младих хермафродита и соницирани на леду (циклус: 0,5 с, амплитуда: 40–45%, 5 потеза по сесији, 5 сесија, интервал између сесија : 30 с; УП200С ултразвучни процесор са микро врхом С26д2 (Хиелсцхер Ултрасоницс ГмбХ)) у пуферу за лизу (укупна запремина: ∼600 μл; 50 мм Трис-ХЦл, пХ 7,4, 100 мм КЦл, 1 мм МгЦл2, 1 мм ЕГТА, 1 мм ДТТ, 10% глицерол , мешавина инхибитора протеазе, 0,1% Нонидет П-40 замена). После соникације, Нонидет П-40 замена је додат до 1% и лизати су инкубирани са ротацијом главе преко репа на 4°Ц током 30 минута, након чега је уследило центрифугирање на 20,000 × г током 20 минута на 4°Ц. Очишћени лизат је затим аспириран без ометања горњег липидног слоја и подељен на пола или на зрнца анти-ГФП агарозе или на блокиране контролне куглице (40–50 μл). Након ротације главе преко репа на 4°Ц у трајању од 60-90 минута, перле су једном испране пуфером за лизу који је садржао 0,1% замене Нонидет П-40, након чега је уследило два пута испирање у било ком пуферу И (25 мм Трис-ХЦл, пХ 7,4, 300 мм НаЦл, 1 мм МгЦл2) или пуфер ИИ (1 мм Трис-ХЦл, пХ 7,4, 150 мм НаЦл, 1 мм МгЦл2) или обоје. За ГФП:МБК-2 падајуће, два одвојена експеримента су изведена користећи различите услове прања. Протеини су елуирани орбиталним мућкањем у 50 μл 6 м урее/2 М тиоуреје на собној температури. За експерименте са МБК-1::ГФП повлачењем, протеини су елуирани два пута мућкањем у 50 μл 8 м гванидинијум хлорида на 90°Ц, након чега је уследило таложење етанолом. Елуирани узорци протеина су затим дигестирани у раствору.
(уп. Цхен ет ал., 2016)

Ултразвучна хомогенизација и лиза црва

За Ц.елеганс лизу и процедуру екстракције протеина, сакупљено је 30.000 немотода релевантног стадијума по узорку и испрано у ледено хладном С-базалу, концентровано центрифугирањем на 1500 рпм током 2 минута, испрано шест пута ледено хладним С-базалом. базал за уклањање остатака бактерија, а затим се чува на леду док не буде спреман за употребу. За екстракцију протеина, гравидно одраслим црвима је дозвољено да формирају компактну куглицу након последњег С-базалног прања. Пелете црва су затим ресуспендоване у 1 мл ледено хладног пуфера за екстракцију [20 мМ калијум фосфат, пХ 7,4, 2 мМ ЕДТА, 1% Тритон-Кс-100, инхибитори протеазе (Сигма П2714)] и одмах обрађене.
∼30.000 гравидних одраслих црва (што одговара мокрој тежини од ∼100 мг), соникирано је на леду помоћу ултразвучног апарата типа сонде (нпр. УП50Х са микроврхом МС2) при 40% амплитуде током 10 циклуса од 3 секунде укључено, 30 секунди искључено, 1 мл ледено хладног пуфера за екстракцију. (уп. Баскхаран ет ал. 2012)

Ултразвучна екстракција липида из Ц. елеганс

У липидомици, грани метаболомике, карактерише се и анализира липидни комплемент биолошких система. Ц. елеганс се широко користи у липидомици за истраживање интеракције метаболичких липида и њиховог утицаја на здравље и животни век.
Ултразвучна лиза и екстракција се користе за ослобађање липида као што су сфинголипиди из ембриона, ларви и одраслих црва Ц. елеганс. Ултразвук се користи за припрему хомогената црва и затим за екстракцију липида из узорка.
Протокол за ултразвучну екстракцију липида из Ц. елеганс
Одмрзните пелету Ц. елеганс на леду и ресуспендујте са 0,5 мл ултраводе. Соницирајте узорке Ц. елеганс у епруветама од 1,5 мЛ, док узорке држите континуирано на леду.
Соникација се може извести помоћу сонде-ултразвучног уређаја као што је УП200Хт, јединица за ултразвучну припрему узорака ВиалТвеетер (истовремена соникација 10 узорака) или УИП400МТП (за соникацију плоча са више бунара као што су плоче са 96 бунара). За ултразвучну лизу са УП200Хт користите микро-врх С26д2. Унапред подесите режим ултразвучног циклуса у дигиталном менију. Подесите амплитуду на 10% и режим циклуса соникације од 2 секунде импулса од 20 циклуса са паузом од 30 секунди. између сваке ултразвучне пулсације.
Пребаците супернатанте у стаклене епрувете са поклопцем на навој. Извршите Фолцх екстракцију додавањем 1 мл ултраводе у сваку стаклену епрувету, а затим додавањем 6 мл мешавине хлороформ/метанол (однос = 2:1) у сваку стаклену епрувету.
Вртљајте сваку стаклену епрувету 30 секунди 4 пута. Центрифугирајте епрувете на 1,258 кг током 15 минута (Еппендорф, 5810 Р) да бисте додатно побољшали раздвајање фаза. Пребаците доњу хидрофобну фракцију у чисту стаклену епрувету помоћу стаклене Пастерове пипете. Осушити доњу хидрофобну фракцију под протоком азота у испаривачу азота. Осушени пелет чувајте у замрзивачу на -80 °Ц до употребе.

Ултразвучна припрема лизата црва

Лизат црва: црви у фази Л4 су сакупљени и испрани три пута са М9 пуфером (42,26 мМ На₂ХПО₄, 22,04 мМ КХ₂ПО₄, 85,56 мМ НаЦл и 0,87 мМ МгСО₄) како би се уклониле све бактерије. Након уклањања што је више могуће М9 пуфера, црви су ресуспендовани у пуферу за лизу: 50 мМ ХЕПЕС, 50 мМ КЦл, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ ЕГТА, 5 мМ фосфат β-глицерол, 0,1% (в/в) Тритон, Кс 50 мМ натријум флуорида, 1 мМ натријум ортованадата, 5 мМ натријум пирофосфата, 0,2 мМ фенилметансулфонилфлуорида и инхибитора протеазе. Црви су замрзнути у течном азоту и одмрзнути на 37°Ц три пута, а затим су црви соникирани на сувом леду помоћу ултразвучне јединице ВиалТвеетер за истовремену припрему 10 епрувета за узорке. Соникација је изведена при 50% амплитуде у 10 циклуса од 2 сек. са паузом од 30 секунди између рафала соникације. Након тога, узорци су центрифугирани на 12000 рпм на 4°Ц током 15 мин. Супернатант је сакупљен и чуван на -70°Ц. Аликвот је коришћен за квантификацију протеина Брадфордовим тестом.
Одређивање укупног глутатиона, ГСХ и ГССГ: За квантификацију глутатиона, лизати и одређивање су направљени истог дана. Ларве храњене глукозом и контролне Л4 ларве су сакупљене и испране М9 пуфером три пута. Након уклањања што је више могуће М9 пуфера, црви су ресуспендовани у ледено хладној метафосфорној киселини (5% в/в), а затим су црви соницирани у леду ултразвучним ВиалТвеетер-ом при 50% амплитуде у десет циклуса соникације од 2 сек. са 30 сек. паузе између сваког циклуса. Затим се центрифугира на 12000 рпм на 4 Ц 15 мин.
(уп. Алцантар-Фернандез ет ал., 2018)

Ц. елеганс Припрема узорка пре имунопреципитације и Вестерн блотинга

Укратко, за ембрионалне екстракте, ларве Ц. елеганс Л1 су гајене у великим течним С-средњим културама до одраслог доба. Ембриони су сакупљени стандардним методом избељивања и суспендовани у пуферу за лизу (50 мМ Трис, пХ 7,5, 100 мМ КЦл, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ МгЦл2, 8,7% глицерол, 0,05% НП-40, 1 мМ Трис, 1 мМ КЦл, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ МгЦл2, 8,7% глицерол, 0,05% НП-40, 1 мМ Интаил Цо. 1 коктел инхибитора фосфатазе И и ИИ), брзо замрзнут у течном азоту и лизиран ултразвучним разбијањем ћелија помоћу ултразвучног апарата са микроврхом као што је УП200Хт са С26д2 за 10 импулса током 10 с при 30% амплитуде. Ако се мора припремити већи број узорака, ултразвучни ВиалТвеетер или МултиСампле-Ултрасоницатор УИП400МТП за плоче за бунаре се препоручују. После ултразвучне обраде, екстракти су претходно очишћени центрифугирањем на 30.000 г током 20 минута на 4°Ц. Претходно очишћени екстракт (300 µг укупног протеина) је инкубиран са 40 µг анти-ЦДЦ-25.1 афинитетно пречишћеног антитела (ова студија) умреженог са протеином А-агарозом, или као контрола, сличном количином зечјег имуноглобулина (Иг)Г умрежен за протеин А-агарозу је коришћен у укупној запремини од 200 µл пуфера за лизу који садржи 1% НП-40, чије је укључивање смањило неспецифично везивање протеина за матрикс. Узорци су ротирани 1 х на 4°Ц, перле су испране три пута пуфером за лизу и елуиране са 30 µл глицин/ХЦл и 200 мМ НаЦл, пХ 2,2. Након имунопреципитације, елуати су разблажени у 30µл СДС пуфера за узорке, загревани на 95°Ц током 4 минута, и обично је 3% укупног уноса и 30% елуата примењено на СДС-ПАГЕ праћено Вестерн блотирањем са анти -ЦДЦ-25.1 (1:400), анти-ЛИН-23 (1:750), анти-убиквитин (1:1000), анти-ГСК3 (1:500) или анти-β-актин (1: 2000) антитела. Тамо где екстракти нису били подвргнути имунопреципитацији, иста количина укупног протеина добијеног из тих екстраката је ресуспендована у СДС пуферу за узорке, загрејана на 95°Ц, а затим директно примењена на СДС-ПАГЕ и анализирана Вестерн блотингом. (уп. Сегреф ет ал. 2020)

Ултразвучна лиза под прецизном контролом температуре

Прецизна и поуздана контрола температуре је кључна при руковању биолошким узорцима. Високе температуре иницирају термички индуковану деградацију протеина у узорцима.
Као и све технике механичке припреме узорака, соникација ствара топлоту. Међутим, температура узорака се може добро контролисати када се користи ВиалТвеетер. Представљамо вам различите опције за праћење и контролу температуре ваших узорака док их припремате помоћу ВиалТвеетер-а и ВиалПресс-а за анализу.

1. Праћење температуре узорка: Ултразвучни процесор УП200Ст, који покреће ВиалТвеетер, опремљен је интелигентним софтвером и сензором температуре који се може прикључити. Укључите сензор температуре у УП200Ст и уметните врх сензора температуре у једну од епрувета за узорке. Преко дигиталног обојеног екрана осетљивог на додир, можете подесити у менију УП200Ст одређени температурни опсег за ваш узорак ултразвучне обраде. Ултрасоникатор ће се аутоматски зауставити када се достигне максимална температура и паузирати док температура узорка не падне на нижу вредност подешене температуре ∆. Тада ултразвук почиње аутоматски поново. Ова паметна функција спречава деградацију изазвану топлотом.
2. ВиалТвеетер блок се може претходно охладити. Ставите ВиалТвеетер блок (само сонотроду без сонде!) у фрижидер или замрзивач да бисте претходно охладили блок од титанијума, што помаже да се одложи пораст температуре у узорку. Ако је могуће, сам узорак се такође може претходно охладити.
3. Користите суви лед за хлађење током ултразвучне обраде. Користите плитку тацну напуњену сувим ледом и поставите ВиалТвеетер на суви лед тако да се топлота брзо распрши.

Пронађите оптимални ултразвучни дисруптор ћелија за вашу апликацију за лизу

Хиелсцхер Ултрасоницс је дугогодишњи искусан произвођач ултразвучних дисруптора ћелија високих перформанси и хомогенизатора за лабораторије, столне и индустријске системе. Величина ваше бактеријске ћелијске културе, ваш истраживачки или производни циљ и запремина ћелије за обраду по сату или дану су суштински фактори за проналажење правог ултразвучног дисруптора ћелија за вашу примену.
Хиелсцхер Ултрасоницс нуди различита решења за истовремену ултразвучну обраду више узорака (до 10 бочица) као и масовних узорака (тј. микротитарске плоче/плоче са 96 јажица), класични лабораторијски ултрасоникатор типа сонде са различитим нивоима снаге од 50 до 400 вати до потпуно индустријских ултразвучних процесора са до 16.000 вати по јединици за комерцијално уништавање ћелија и екстракцију протеина у великој производњи. Сви Хиелсцхер ултрасоникатори су направљени за рад 24/7/365 под пуним оптерећењем. Робусност и поузданост су основне карактеристике наших ултразвучних уређаја.
Сви дигитални ултразвучни хомогенизатори опремљени су паметним софтвером, екраном на додир у боји и аутоматским протоколом података, што ултразвучни уређај чини практичним радним алатом у лабораторијама и производним објектима.
Јавите нам какве ћелије, коју запремину, којом фреквенцијом и са којим циљем морате да обрађујете своје биолошке узорке. Препоручићемо вам најпогоднији ултразвучни дисруптор ћелија за ваше захтеве процеса.

Табела у наставку вам даје индикацију приближног капацитета обраде наших ултразвучних система од компактних ручних хомогенизатора и МултиСампле ултрасоникатора до индустријских ултразвучних процесора за комерцијалне примене: