Ултразвучна припрема узорака C. elegans

C. elegans, нематода, широко је коришћен моделни организам у биологији. Припрема узорака пре анализе захтева лизу, екстракцију протеина и липида, као и фрагментацију РНК, што се може поуздано извести соникацијом. Ултразвучни разарачи ћелија су поуздани, софистицирани уређаји једноставни за употребу који омогућавају брзу припрему узорака C. elegans.

Ултразвучна припрема узорака C. elegans

Caenorhabditis elegans су ваљкасти црви који се широко користе у истраживачким лабораторијама за проучавање геномике, развојне биологије и болести. Многи гени у геному C. elegans имају функционалне пандане код људи. Због тога је ова нематода изузетно користан модел за људске болести. Друге предности које доприносе широкој употреби C. elegans јесу једноставан и јефтин узгој на плочама које садрже бактерије (нпр. E. coli), провидност, лако руковање, као и могућност замрзавања и чувања црва током дужег периода.
Анализа протеина и липида је рутински поступак у лабораторијама, а ултразвучна припрема узорака је устаљена метода за лизу нематода C. elegans у свим развојним стадијумима (тј. ембриона, ларви L1–L4 и одраслих јединки). Пошто се C. elegans користи и као систем за експресију протеина ради прекомерне експресије циљних протеина, потребна је поуздана, репродуктивна метода лизе и екстракције протеина која даје високе приносе протеина. Ултразвучни системи за разарање ћелија и екстракцију доступни су као хомогенизатори са сондом и као соникатори за више узорака. Hielscher Ultrasonics нуди идеалан ултразвучни разарач ћелија за ваш лабораторијски поступак, који омогућава једноставну припрему узорака различитих величина и у различитом броју.

Протоколи за ултразвучно разарање и лизу C. elegans

Ултразвучна хомогенизација и лиза C. elegans и накнадна екстракција протеина и липида могу се извести различитим поступцима уз употребу различитих пуфера за хомогенизацију и лизу итд. Свим протоколима лизе заједничко је то да се узорци морају непрекидно држати на леду како би се спречила разградња протеина. У наставку представљамо неколико поузданих и брзих протокола ултразвучне лизе и екстракције за припрему висококвалитетних узорака C. elegans који садрже протеине или липиде.

Предности ултразвучне лизе C. elegans

• поуздана
• репродуктивна
• уз прецизну контролу температуре
• поуздана контрола процеса
• блага метода
• једноставна за примену
• безбедна

Ултразвучна екстракција протеина из узорака C. elegans

Ултразвучна лиза и екстракција протеина из црва C. elegans могу се извести према различитим протоколима. У наставку представљамо неколико поузданих и брзих протокола лизе за постизање репродуктивних резултата екстракције протеина.

Брза припрема цитосолног екстракта из црва C. elegans соникацијом

Помоћу следећег протокола можете припремити лизате C. elegans за мање од 30 минута.
Сакупљање C. elegans
Пренесите жељене црве C. elegans у епрувету од 1,5ml са физиолошким раствором пуферованим фосфатом (PBS) или их исперите са плоче помоћу 1,5ml PBS-а. Центрифугирајте 1min на 2000rpm да бисте добили талог. Држите узорке све време на леду.
Затим оперите црве два пута PBS-ом.
Након тога оперите црве два пута ddH₂O.
Ресуспендујте црве у најмање 500ul пуфера за хомогенизацију (HB). Узорци црва су сада спремни за ултразвучну лизу.
Да бисте добили квалитетнији протеински екстракт, можете смањити бактеријску контаминацију прањем црва по 5min у PBS-у и стерилној, ултрачистој води (ddH₂O) или применити флотацију у сахарози. Држите узорке црва непрекидно на леду.

Протокол ултразвучне лизе C. elegans

• Обавезно унапред припремите соникатор како би ултразвучни хомогенизатор био спреман за употребу (сонда постављена, програм соникације унапред подешен). 

Ако је ваш ултразвучни хомогенизатор монтиран на сталак, поставите ледено купатило са епруветама са узорцима испод ултразвучне сонде и уроните ултразвучну сонду у епрувету од 1,5ml.

• За лизу C. elegans помоћу UP200St или UP200Ht, ултразвучну обраду треба спроводити помоћу микроврха (нпр. сонде S26d2 од 2mm; погледајте слику лево) при амплитуди од 40% током 1sec, са паузама од 30sec између импулса. За лизу C. elegans идеално је 5 циклуса соникације, сваки у трајању од 1 секунде, са паузама од 30sec. Ако лизу спроводите први пут, можете микроскопом проверити напредовање лизе у малим аликвотима узорка након сваког импулса.
• Лиза је успешно завршена када су црви разорени. Прекомерна соникација доводи до разарања једара, што постаје видљиво када узорак постане вискозан или се запени. Да бисте спречили деградацију узорка, по потреби примените више импулса. Да бисте добили висококвалитетне протеинске екстракте, немојте продужавати трајање сваког циклуса ултразвучног импулса.
• Избистрите ћелијски лизат центрифугирањем ултразвучно лизираних црва при 14.000rpm током 10min на 4ºC.
• Затим пренесите супернатант у нову епрувету и припремите га за имунопреципитацију или друге анализе.

Напомена о пуферу за хомогенизацију: Припремите пуфер за хомогенизацију за горенаведени протокол ултразвучне лизе на следећи начин:

Лиза C. elegans са великим протоком узорака у плочама са 96 бунарчића помоћу соникатора за плоче UIP400MTP

Лиза C. elegans (одрасле нематоде)
UIP400MTP, амплитуда 80%, 20 циклуса (сваки циклус соникације: 30 sec укључено, 30 sec искључено)
Пуфер за лизу:

• Опција 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Опција 2) за коимунопреципитацију (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (коктел инхибитора протеиназа Complete)

Фрагментација ДНК са великим протоком узорака
ДНК C. elegans (одрасле нематоде) 200–300bp: соникатор за плоче UIP400MTP – подесите амплитуду на 80%, 30 импулса – сваки са 30sec укључено и 30sec искључено

Соникатор за плоче UIP400MTP за припрему узорака са великим протоком равномерно соницира узорке у плочама са више бунарчића, микротитарским плочама и плочама са 96 бунарчића

Ултразвучна лиза C. elegans за квантитативне анализе афинитетног пречишћавања

Ембриони C. elegans (∼2 милиона по репликату) свеже су сакупљени у три биолошка репликата третирањем младих хермафродита који носе јаја раствором за избељивање и соницирани на леду (циклус: 0,5 s, амплитуда: 40–45%, 5 импулса по серији, 5 серија, интервал између серија: 30 s; ултразвучни процесор UP200S са микроврхом S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) у пуферу за лизу (укупна запремина: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% глицерола, смеша инхибитора протеаза, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Након соникације, додат је Nonidet P-40 Substitute до концентрације од 1%, а лизати су инкубирани уз ротацију превртањем на 4°C током 30 min, након чега је уследило центрифугирање при 20.000 × g током 20 min на 4°C. Избистрени лизат је затим аспириран без нарушавања горњег липидног слоја и подељен на две половине, од којих је једна додата агарозним куглицама са анти-GFP антителима, а друга блокираним контролним куглицама (40–50 μl). Након ротације превртањем на 4°C током 60–90 min, куглице су једном испране пуфером за лизу који садржи 0,1% Nonidet P-40 Substitute, а затим два пута пуфером I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) или пуфером II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), или обама пуферима. За афинитетно издвајање GFP:MBK-2 спроведена су два засебна експеримента са различитим условима испирања. Протеини су елуирани орбиталним мућкањем у 50 μl раствора 6 m урее/2 M тиоурее на собној температури. За експерименте афинитетног издвајања MBK-1::GFP, протеини су елуирани два пута мућкањем у 50μl раствора 8 m гванидинијум-хлорида на 90°C, након чега је уследила преципитација етанолом. Елуирани протеински узорци су затим подвргнути дигестији у раствору.
(уп. Chen et al., 2016)

Ултразвучна хомогенизација и лиза црва

За поступак лизе C.elegans и екстракције протеина прикупљено је 30.000 нематода одговарајућег развојног стадијума по узорку и испрано леденохладним медијумом S-basal, концентровано центрифугирањем при 1500 rpm током 2 мин., шест пута испрано леденохладним медијумом S-basal ради уклањања преосталих бактерија, а затим чувано на леду до употребе. За екстракцију протеина, након последњег испирања медијумом S-basal, одраслим црвима са јајима омогућено је да формирају компактан талог. Талози црва су затим ресуспендовани у 1 ml леденохладног пуфера за екстракцију [20 mM калијум-фосфата, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, инхибитори протеаза (Sigma P2714)] и одмах обрађени.
∼30.000 одраслих црва са јајима (што одговара ∼100 mg влажне масе) соницирано је на леду ултразвучним уређајем са сондом (нпр. UP50H са микроврхом MS2) при амплитуди од 40%, током 10 циклуса од по 3 сек. укљученог и 30 сек. искљученог ултразвука, у 1 ml леденохладног пуфера за екстракцију. (уп. Baskharan et al. 2012)

Ултразвучна екстракција липида из C. elegans

У липидомици, грани метаболомике, карактерише се и анализира целокупан скуп липида биолошких система. C. elegans се широко користи у липидомици за истраживање међусобних интеракција метаболичких липида и њихових утицаја на здравље и животни век.
Ултразвучна лиза и екстракција користе се за ослобађање липида, као што су сфинголипиди, из ембриона, ларви и одраслих црва C. elegans. Ултразвучна обрада користи се за припрему хомогената црва и потом за екстракцију липида из узорка.
Протокол за ултразвучну екстракцију липида из C. elegans
Одмрзните талог C. elegans на леду и ресуспендујте га у 0,5 ml ултрачисте воде. 
Соницирајте узорке C. elegans у епруветама од 1,5mL, уз непрекидно држање узорака на леду.
Соникација се може спровести ултразвучним уређајем са сондом, као што је UP200Ht, ултразвучном јединицом за припрему узорака VialTweeter (истовремена соникација 10 узорака) или уређајем UIP400MTP (за соникацију плоча са више бунарчића, као што су плоче са 96 бунарчића).
За ултразвучну лизу уређајем UP200Ht користите микроврх S26d2. Унапред подесите режим ултразвучних циклуса у дигиталном менију. Подесите амплитуду на 10% и режим циклуса соникације на 20 циклуса са импулсима од 2 сек. и паузом од 30 сек. између узастопних ултразвучних импулса.
Пренесите супернатанте у стаклене епрувете са затварачем на навој. 
Спроведите екстракцију по Фолчу додавањем 1 ml ултрачисте воде у сваку стаклену епрувету, а затим додавањем 6 ml 
смеше хлороформа/метанола (однос = 2:1) у сваку стаклену епрувету.
Мешајте сваку стаклену епрувету на вортекс мешалици 4 пута по 30 сек. 
Центрифугирајте епрувете при 1.258 x g током 15 мин. (Eppendorf, 5810 R) да бисте додатно побољшали раздвајање фаза. 
Пренесите доњу хидрофобну фракцију у чисту стаклену епрувету стакленом Пастеровом пипетом. 
Осушите доњу хидрофобну фракцију у струји азота у азотном испаривачу. 
Чувајте осушени талог у замрзивачу на -80 °C до употребе. 


Ултразвучна припрема лизата црва

Лизат црва: Црви у стадијуму L4 прикупљени су и три пута испрани пуфером M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl и 0,87 mM MgSO₄) како би се уклониле све бактерије. Након уклањања што је могуће веће количине пуфера M9, црви су ресуспендовани у пуферу за лизу: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-глицерол фосфата, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM натријум-флуорида, 1 mM натријум-ортованадата, 5 mM натријум-пирофосфата, 0,2 mM фенилметансулфонил-флуорида и инхибитор протеаза. Црви су три пута замрзавани у течном азоту и одмрзавани на 37°C, а затим су сониковани на сувом леду ултразвучном јединицом VialTweeter за истовремену припрему 10 епрувета са узорцима. Соникација је спроведена при амплитуди од 50% у 10 циклуса од по 2 sec. са паузом од 30 sec између серија ултразвучних импулса. Након тога, узорци су центрифугирани при 12.000 rpm на 4°C током 15 min. Супернатант је сакупљен и чуван на -70°C. Аликвот је коришћен за квантификацију протеина Бредфордовом методом.
Одређивање укупног глутатиона, GSH и GSSG: За квантификацију глутатиона, припрема лизата и одређивање обављени су истог дана. Ларве L4 храњене глукозом и контролне ларве L4 сакупљене су и три пута испране пуфером M9. Након уклањања што је могуће веће количине пуфера M9, црви су ресуспендовани у метафосфорној киселини охлађеној на леду (5% w/v), а затим су сониковани у леду ултразвучним уређајем VialTweeter при амплитуди од 50% у десет циклуса соникације од по 2 sec. са паузом од 30 sec. између циклуса. Након тога, центрифугирани су при 12.000 rpm на 4 ̊C током 15 min.
(уп. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Припрема узорака C. elegans пре имунопреципитације и вестерн блотинга

Укратко, за добијање ембрионалних екстраката, ларве C. elegans у стадијуму L1 узгајане су до одраслог стадијума у течним културама великог обима у медијуму S. Ембриони су сакупљени стандардном методом третмана избељивачем и суспендовани у пуферу за лизу (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% глицерола, 0,05% NP-40, 1􏰅 коктела инхибитора протеаза и 1􏰅 коктела инхибитора фосфатаза I и II), брзо замрзнути у течном азоту и лизирани ултразвучним разарањем ћелија помоћу ултразвучног уређаја са микроврхом, као што је UP200Ht са S26d2, применом 10 импулса током 10 s при амплитуди од 30%. Ако је потребно припремити већи број узорака, препоручују се ултразвучни уређај VialTweeter или ултразвучни уређај за више узорака UIP400MTP за плоче са бунарчићима. Након соникације, екстракти су претходно избистрени центрифугирањем при 30.000g током 20 min на 4°C. Претходно избистрени екстракт (300µg укупних протеина) инкубиран је са 40µ􏰂g афинитетно пречишћеног антитела anti-CDC-25.1 (ова студија) унакрсно везаног за протеин А-агарозу, или је као контрола коришћена слична количина зечјег имуноглобулина (Ig)G унакрсно везаног за протеин А-агарозу, у укупној запремини од 200µl пуфера за лизу који садржи 1% NP-40, чији је додатак смањио неспецифично везивање протеина за матрикс. Узорци су ротирани током 1 h на 4°C, куглице су три пута испране пуфером за лизу, а елуција је извршена са 30µl глицина/HCl и 200 mM NaCl, pH 2,2. Након имунопреципитације, елуати су разблажени у 30µ􏰂l SDS пуфера за узорке, загревани на 95°C током 4 min, а обично је 3% укупне количине за улазни узорак и 30% за елуате наношено на SDS-PAGE, након чега је спроведен вестерн блотинг са антителима anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) или anti-􏰁β-actin (1:2000). Када екстракти нису подвргавани имунопреципитацији, иста количина укупних протеина добијених из тих екстраката ресуспендована је у SDS пуферу за узорке, загревана на 95°C, а затим директно наношена на SDS-PAGE и анализирана вестерн блотингом. (уп. Segref et al. 2020)

Ултразвучна лиза уз прецизну контролу температуре

Прецизна и поуздана контрола температуре кључна је при руковању биолошким узорцима. Високе температуре покрећу топлотно изазвану разградњу протеина у узорцима.
Као и све механичке технике припреме узорака, соникација ствара топлоту. Међутим, температура узорака може се добро контролисати када се користи VialTweeter. Представљамо вам различите могућности за праћење и контролу температуре узорака током њихове припреме за анализу помоћу уређаја VialTweeter и VialPress.

1. Праћење температуре узорка: Ултразвучни процесор UP200St, који покреће VialTweeter, опремљен је интелигентним софтвером и прикључивим температурним сензором. Прикључите температурни сензор на UP200St и уметните врх температурног сензора у једну од епрувета са узорцима. Преко дигиталног екрана у боји осетљивог на додир можете у менију уређаја UP200St подесити одређени температурни опсег за соникацију узорака. Ултразвучни уређај ће се аутоматски зауставити када се достигне максимална температура и паузирати док температура узорка не падне на доњу вредност подешеног температурног опсега ∆. Затим се соникација аутоматски поново покреће. Ова паметна функција спречава топлотно изазвану разградњу.
2. Блок уређаја VialTweeter може се претходно охладити. Ставите блок уређаја VialTweeter (само сонотроду без претварача!) у фрижидер или замрзивач да бисте претходно охладили титанијумски блок, што помаже да се одложи пораст температуре у узорку. Ако је могуће, и сам узорак може се претходно охладити.
3. Користите суви лед за хлађење током соникације. Користите плитку посуду напуњену сувим ледом и поставите VialTweeter на суви лед како би се топлота могла брзо одводити.

Пронађите оптималан ултразвучни уређај за разарање ћелија за вашу примену лизе

Hielscher Ultrasonics је произвођач са дугогодишњим искуством у производњи ултразвучних уређаја за разарање ћелија и хомогенизатора високих перформанси за лабораторије, стоне системе и системе индустријских размера. Величина ваше културе бактеријских ћелија, циљ вашег истраживања или производње и запремина ћелија коју треба обрадити на сат или дневно кључни су фактори за проналажење одговарајућег ултразвучног уређаја за разарање ћелија за вашу примену.
Hielscher Ultrasonics нуди различита решења за истовремену соникацију више узорака (до 10 бочица), као и великог броја узорака (тј. микротитарских плоча / плоча са 96 бунарчића), од класичног лабораторијског ултразвучног уређаја са сондом, са различитим нивоима снаге од 50 до 400 вати, до потпуно индустријских ултразвучних процесора са снагом до 16.000 вати по јединици за комерцијално разарање ћелија и екстракцију протеина у великој производњи. Сви ултразвучни уређаји Hielscher конструисани су за рад 24/7/365 под пуним оптерећењем. Робусност и поузданост су основне карактеристике наших ултразвучних уређаја.
Сви дигитални ултразвучни хомогенизатори опремљени су паметним софтвером, екраном у боји осетљивим на додир и аутоматским бележењем података, што ултразвучни уређај чини практичним радним алатом у лабораторијама и производним погонима.
Обавестите нас коју врсту ћелија, коју запремину, колико често и са којим циљем треба да обрађујете своје биолошке узорке. Препоручићемо вам најпогоднији ултразвучни уређај за разарање ћелија у складу са захтевима вашег процеса.

Табела у наставку даје оријентациони преглед приближног капацитета обраде наших ултразвучних система, од компактних ручних хомогенизатора и ултразвучних уређаја за више узорака до индустријских ултразвучних процесора за комерцијалне примене: