Ултразвучна лиза за западну блотњу

  • Zapadna slabu tačku je analitička procedura za detekciju specifičnih proteina u uzorku homogenacije tkiva ili ekstrakta ćelije.
  • Da bi pokrenuli zapadni slabu tačku ili da bi se izmerio aktivnost enme, mnogi tvrde da su potrebni pristup materijalima (npr. proteini, DNK, podcelularni fragmenti) u ćeliji.
  • Sonacija je pouzdan i lak za rukovanje za kontrolisano poremećenost ćelija i limfom.

Ultrasonični prekid ćelije

Proteini iz tkiva i Kultivisana ćelija je prvi korak za mnoge biološke, biohemijske i analitičke tehnike (strana, Zapadna cvetovi, ELISA, masovna spektrometrija, itd.) ili čišćenje proteina. Za dobijanje velikog prinosa proteina, materijal ćelije i tkivo mora se efikasno rešiti. Da li je biljka ili životinjski tkivo, sonacija je metod za pripremu ćelije lysate lako i brzo.

Prednosti Sonsikacija

  • Brzo & Efikasno
  • једноставан рад
  • Veliki prinos proteina
  • Ponovna produktivljiva/ponovljiva
  • precizno kontrolisano
  • podesivo

Захтев за информације




Obratite pažnju na naše Правила о приватности.


Hielscher's VialTweeter is ideal for the lysis of multiple samples

VialTweeter sonicator za ultrazvučnu pripremu uzoraka kao što su poremećaj ćelija i izolacija proteina

Immunopadavina protokol za Western Imunocvetovi

A. reagencija

Za pripremu rešenja, koristite prečišćena voda kao što je Milli-Q.

  • 1X Fosfatno Bafano Saline (JRS)
  • 1X bafer za ćelije: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM β-graficfosfata, 1 mm Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
    Važno: Dodaj 1 mM PMSF odmah pre upotrebe.
  • 15 μl proteina A + 15 μl protein G je dovoljan za IP, ali može zavisiti od primarne antibinodnih i probnih volumena. Takođe, možete koristiti i pre mešovitih proteina A/G agana (npr. protein A za zečeve IgG i protein G za miša)
  • 3X – uzorak bafera: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 na 25 ° c), 6% w/v SDS, 30% grafcerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromofenol Blue

B. priprema ćelijskih Lajsata

  • Žetvu ćelije. Da bi se ćelije prebile pod uslovima koji ne označavaju uslove, uklonite medije i ispali ćelije sa ledom-hladnim Jumom.
  • Uklonite JRS i dodajte 0,5 ml led-hladna 1X bafer za ćelije na svakoj ploči (10 cm) i inkubirati ploče na ledu na 5 minuta.
  • Silovati ćelije sa tanjira i transfer na microcentrifuge tube. Držite se na ledu.
  • Sonje dvaput na 10 sekundi u ledu-hladna immunosnacija (IP bafer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i protease inhibitorom mix). Za sonsikaciju, ВиалТвеетер ili ultrazvučalac istrage kao što je УП100Х или УП200Хт su najprikladniji.
  • Centrifugi je na 15.000 g na 10 minuta na 4 ° c.
  • Prebacite supernatantu na novu cijev. (Ako je potrebno, lysate se može uskladištiti na – 80 ° c.)
  • Dodajte primarnu antagodiju supernatantu. Supernatant sa primarnom antibitizacijom je inkubirani za 1 h na 4 ° c pod svetlosnim agitima. Osnovna antibijodija se obično dodaje u količini od 10x koncentrisanih nego što se koristi za zapadnjovanje. (Možete započeti sa 1μg Per 100 μL.)
  • Supernatant je potom dodatno Inkubirao sa mešavinom jednakih količina proteina A-agana (Invitrogen) i proteina G agana za još 1 h.
  • Wash agisna Peleta tri puta sa IP baferu. Nakon toga, izdvojite povezane belančevine pomoću bafera za utovar SDS-a, zagrejanjem na 95 ° c na 5 minuta.

C. Immunopadavina

  • Uzmite 200 μl Cell lysate i dodajte primarne antibite. Inkubat sa nežnim Rotom preko noći na 4 ° c.
  • Dodavanje proteina a ili G Agena (20 μl od 50% lezaj slurrija). Inkubat sa nežnim Rockom za 1 – 3 sata na 4 ° c.
  • Microcentrifuge za 30 sekundi na 4 ° c. Wash pelet pet puta sa 500 μl od 1X bafera ćelijskih ćelija. Držite se na ledu tokom Peresa.
  • Preljetljte pelete sa 20-ti, uzorak bafera od 3X. Vortex, a onda microcentrifuge 30 sekundi.
  • Zagrejte uzorak na 95 – 100 ° c za 2 – 5 minuta i microcentrifuge za 1 minut u 14.000 X g.
  • Učitajte uzorak (15 – 30 μl) na "SDS-PAGE gel" (12 – 15%).
  • Analizirajte uzorak na zapadu.

Western Blot Analysis with the Sonicator UP50H

Following protocol using the probe-type sonicator UP50H was used in study of Kriebisch et al. (2011):
Ultrazvučni homogenizer tipa sonde UP50H se obično koristi za prekid ćelija i izolaciju proteina kao korak pripreme uzoraka pre zapadnog BlottingaUkupan broj proteina bio je izolovan iz MC3T3-E1 ćelija tretiranih sa 1, 25 (OH)2D3 (10− 8 M) ili vozilo. Ćelije su prebile sa bafera koji sadrži 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fišer naučni); 0,1% Natrijum-sulfat (Fišer) (Fisher naučno); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% natrijum-okat (Merck). Ćelija lysate je bila sonena za 2 × 10 s u ciklusu 1 i 80 sa UP50H ultrasonični procesor (Hielscher, ultrazvučna tehnologija, Telucnik, Nemačka). Nakon toga materijal je bio centrifugiran na 10 min u 14.000 RPM i supernatant se koristio za Zapadnjuovanje. Dvadeset pet μg proteina kuvano je u uzorku od bafera i smanjenjem agenta (Invitrogen), a zatim je odvojen od strane SDS-a koristeći 4 – 12% poliakrylamide gelova (Invitrogen) i prebačen u Nitrocelulozu, (zdravstvena nega ge). "Šel" je blokiran za 1 h sa TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) koja sadrži 1% unovčajna (Sigma-Aldrich) i 1% Tris (1 M). Nakon blokiranja, u laboratoriji prof. R. Banerelje, En Arbor, MI, sad), je u 4 ° c sa primarnim antibakterijom (zec anti-ljudski CBS 1/500.). Inkubacija sa horseradkastom peroxidaze (HPR)-conžonated sekundarno-antibijumija (Dako) izvršena je za 1 h na sobnoj temperaturi. Sva BLOB su razvijena unapređenom hemiluminesencije (Perkin Elmer).
 

Ovo uputstvo objašnjava koja vrsta sononika je najbolja za zadatke pripreme uzorka kao što su liza, poremećaj ćelija, izolacija proteina, DNK i RNK fragmentacija u laboratorijama, analizama i istraživanjima. Odaberite idealan tip soniatora za aplikaciju, volumen uzorka, broj uzorka i protok. Hielscher Ultrasonics ima idealan ultrazvučni homogenizer za vas!

How to Find the Perfect Sonicator for Cell Disruption and Protein Extraction in Science and Analysis

Video sličica

 

Кликните овде да прочитате више о најбољим праксама за ултразвучну лизу и екстракцију ћелија, припрему лизата и препоруке за побољшања процеса!
 
Sledeća tabela vam daje pokazatelj približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnika veličine laboratorije:

Препоручени уређајибатцх tomПроток
UIP400MTP 96-Well Plate Sonicatorvišestruko dobro / mikrotiter pločeН.А.
Ultrasonični CupHornCupHorn za bočice ili beakerН.А.
ГДмини2ultrazvučni mikro-flow reaktorН.А.
ВиалТвеетер0.5 до 1.5мЛН.А.
УП100Х1 до 500 мл10 до 200мЛ / мин
УП200Хт, УП200Ст10 do 1000mL20 do 200mL/min
УП400Ст10 до 2000мЛ20 до 400мЛ / мин
ultrazvučni šejker sitoН.А.Н.А.

Контактирајте нас! / Питајте нас!

Traži više informacija

Molimo vas da koristite formular ispod da zatražite dodatne informacije o našim sonicatorima za pripremu uzoraka pre Zapadnih Blotsa, detaljnih protokola aplikacije i cene. Biće nam drago da sa vama razgovaramo o procesu pripreme uzorka i da vam ponudimo ultrazvučni sistem koji ispunjava vaše zahteve!









Molimo vas da zabeležite naše Правила о приватности.


Mikroplate, višestruke ploče, PCR ploče i ploče od 96 bunara mogu se udobno i ravnomerno sonicisati pomoću UIP400MTP ploče

UIP400MTP ploča Sonicator za visoko protočanske sonikacije 96-bunarskih tanjira



O zapadu

Blob su analitičke procedure gde se DNK, RNA i proteina prebacuju na nosač kako bi mogli da se odvajaju.
Južna slabu tačku se koristi za detekciju DNK, severne slabu tačku za RNA i zapadnu slabu tačku za proteine.
Zapadna bloza se naziva i protein immunostidka jer se za to posebno otkriva antigena. Zapadna Bloza je jedan od najvažnijih metoda analize za otkrivanje specifičnih proteina u uzorku. U zapadnoj blogi, proteini su nemobilizovani na sjećanja da bi ih otkrili koristeći monkični ili polizaponska antitela.
SDS-polyacrylamide gel elektroforesis (SDS-strana) osnovne belančevine odvojene su 3-D strukturom ili denatiziranim protezima do dužine polipeptida. Proteini se potom prenose u jednu odnju (obično nitrocelulose ili PVDF), gde su umrljane antitela karakterističnim za ciljnim protezom. "Gel elektroforesis" uključen je u zapadnu slabu tačku analizu da bi se rešio pitanje prekogranične aktivnosti antitela.
Nakon toga, odvojene belančevine se rastavljaju na matricu (uglavnom na nitrocelulose ili PVDF), gde su umrljane antitela. Antitela funkcionišu kao istraga i posebno su izabrane za ciljne proteine. Analiza lokacije i intenzitet specifične reakcije otkriva detalje ciljnih proteina u datom uzorku. Zapadnjaci mogu da detektuju ciljni proteini koji je nizak, zbog visoke rezolucije gela elektrofoska i snažne specifičnosti i visoke osećajnosti immunoasa. Zapadna slabu tačku metoda se koristi u molekularnom biologiji, biohemiji, imunogenetici i drugim molekularnom istraživačkom polju.
Među ostalim srodnim tehnikama su i Dot slabu tačku analiza, immunohistohemija i immunocitoghemija u kojoj se antitela koriste za otkrivanje proteina u tkivima i ćelijama po immunopolju, kao i enme-srodno-srodno-vezivi asreci (Elisa).


Literatura/reference

Kompletna instalacija: Vialvajeter sonotjahat na ultrasonprocessor UP200St

VialTweeter sonicator za istovremenu probnu pripremu više bočica

Контактирајте нас! / Питајте нас!





Molimo vas da zabeležite naše Правила о приватности.


Soniranost je važan korak tokom pripreme uzorka

UP200St sa mikro-tipom za uzorak sonacija

Biće nam drago da razgovaramo o vašem procesu.

Hajde da stupimo u kontakt.