Ултразвучна лиза за Вестерн Блоттинг

• Вестерн блот је аналитичка процедура за детекцију специфичних протеина у узорку хомогената ткива или екстракта ћелије.
• Да би се спровео Вестерн блот или да би се измерила активност ензима, многи тестови захтевају приступ материјалима (нпр. протеини, ДНК, субћелијски фрагменти) заробљеним у ћелији.
• Соникација је поуздан и лак за руковање метод за контролисано уништавање и лизу ћелија.

Ултразвучни поремећај ћелије

Екстракција протеина из ткива и култивисаних ћелија је први корак за многе биолошке, биохемијске и аналитичке технике (ПАГЕ, Вестерн блоттинг, ЕЛИСА, масена спектрометрија, итд.) или пречишћавање протеина. Да би се добио висок принос протеина, ћелијски материјал и ткиво морају бити ефикасно поремећени/лизирани. Било да се ради о биљним ћелијама или животињском ткиву, ултразвук је метод за лаку и брзу припрему вашег ћелијског лизата.

Предности соникације

• Фаст & Ефикасно
• Лако руковање
• висок принос протеина
• поновљив/ поновљив
• прецизно контролисан
• скалабилан

Имунопреципитатион Протоцол фор Вестерн Иммуноблоттинг

А. Реагенси

За припрему раствора користите пречишћену воду као што је Милли-К.

• 1Кс физиолошки раствор са фосфатним пуфером (ПБС)
• 1Кс пуфер за ћелијску лизу: 20 мМ Трис (пХ 7,5), 150 мМ НаЦл, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ ЕГТА, 1% Тритон Кс-100, 2,5 мМ натријум пирофосфат, 1 мМ β-сфат-глицер 1 мМ, 1 мМ β-глицер 1 мМ мл Леупептин
  Важно: Додајте 1 мМ ПМСФ непосредно пре употребе.
• 15 μл Протеин А+15 μл Протеин Г је довољно за ИП, али то може зависити од вашег примарног антитела и запремине узорка. Такође можете користити претходно мешану протеинску А/Г агарозу (нпр. Протеин А за зечји ИгГ повлачење и Протеин Г за мишји ИгГ пулл довн)
• 3Кс СДС пуфер за узорке: 187,5 мМ Трис-ХЦл (пХ 6,8 на 25°Ц), 6% в/в СДС, 30% глицерол, 150 мМ ДТТ, 0,03% в/в бромофенол плаво

Б. Припрема ћелијских лизата

• Сакупите ћелије. Да бисте сакупили ћелије у условима без денатурације, уклоните медијум и једном исперите ћелије ледено хладним ПБС-ом.
• Уклоните ПБС и додајте 0,5 мл ледено хладног 1Кс пуфера за лизу ћелија у сваку плочу (10 цм) и инкубирајте плоче на леду 5 минута.
• Састружите ћелије са плоча и пренесите их у епрувете за микроцентрифугу. Држите се на леду.
• Соницирајте два пута по 10 секунди у ледено хладном пуферу за имунопреципитацију (ИП пуфер: 50 мМ Трис-ХЦл [пХ 7,4], 150 мМ НаЦл, 5 мМ ЕДТА, 0,1% НП-40 и мешавина инхибитора протеазе). За соникацију, ВиалТвеетер или ултрасоникатор сонде као што је УП100Х или УП200Хт су најпогоднији.
• Центрифугирајте лизате на 15.000 г током 10 минута на 4°Ц.
• Пребаците супернатант у нову епрувету. (Ако је потребно, лизат се може чувати на –80°Ц.)
• Додајте примарно антитело у супернатант. Супернатант са примарним антителом је инкубиран 1 х на 4°Ц уз лагано мешање. Примарно антитело се обично додаје у количини 10 пута већој од оне која се користи за вестерн блотинг. (Можете почети са 1μг на 100μЛ.)
• Супернатант се затим даље инкубира са мешавином једнаких количина Протеин А-агарозе (Инвитроген) и Протеин Г агарозе још 1 х.
• Оперите пелете агарозе три пута са ИП пуфером. Након тога, екстрахујте везане протеине са СДС-ПАГЕ пуфером за пуњење загревањем на 95°Ц током 5 минута.

Ц. Имунопреципитација

• Узмите 200 μл ћелијског лизата и додајте примарно антитело. Инкубирајте уз лагано љуљање преко ноћи на 4°Ц.
• Додајте зрнце агарозе протеин А или Г (20 μл 50% суспензије зрна). Инкубирајте уз лагано љуљање 1-3 сата на 4°Ц.
• Микроцентрифугирајте 30 секунди на 4°Ц. Оперите пелет пет пута са 500 µл 1Кс пуфера за лизу ћелија. Држите на леду током прања.
• Ресуспендујте пелет са 20 μл 3Кс СДС пуфера за узорке. Вортек, затим микроцентрифугирајте 30 секунди.
• Загрејати узорак на 95-100°Ц током 2-5 минута и микроцентрифугирати 1 минут на 14,000 Кс г.
• Ставите узорак (15–30 μл) на СДС-ПАГЕ гел (12–15%).
• Анализирајте узорак Вестерн блоттингом.

Вестерн блот анализа са Соницатором УП50Х

У студији Криебисцх ет ал. (2011):
Укупни протеин је изолован из МЦ3Т3-Е1 ћелија третираних са 1,25(ОХ)₂Д₃ (10⁻⁸ М) или возило. Ћелије су лизиране пуфером који садржи 50 мМ Трис ХЦл, пХ 8 (Сигма-Алдрицх); 150 мМ НаЦл (Фисхер Сциентифиц); 0,1% натријум додецил сулфат (СДС) (Фисхер Сциентифиц); 1% ИГЕПАЛ ЦА-630 (Сигма-Алдрицх) и 0,5% натријум деоксихолат (Мерцк). Ћелијски лизат је обрађен ултразвуком 2 × 10 с у циклусу 1 и амплитуде 80 са Ултразвучни процесор УП50Х (Хилшер, Ултразвучна технологија, Телтов, Немачка). Затим је материјал центрифугиран 10 минута на 14.000 рпм и супернатант је коришћен за Вестерн блот. Двадесет пет μг протеина је кувано у пуферу за узорке и редукционом агенсу (Инвитроген) и затим одвојено помоћу СДС-ПАГЕ користећи 4–12% полиакриламидних гелова (Инвитроген) и пребачено на нитроцелулозну мембрану (ГЕ хеалтх царе). Мембрана је блокирана 1 х са ТБС (10 мМ Трис-ХЦл; пХ 7,6; 150 мМ НаЦл) који садржи 1% казеина (Сигма-Алдрицх) и 1% Трис (1 М). Након блокирања, мембрана је инкубирана уз лагано мешање преко ноћи на 4°Ц са примарним антителом (зечји анти-хумани ЦБС 1/500, развијен у лабораторији проф. Р. Банерјее, Анн Арбор, МИ, САД). Инкубација са секундарним антителом коњугованим пероксидазом рена (ХПР) (Дако) изведена је 1 х на собној температури. Све мрље су развијене појачаном хемилуминисценцијом (Перкин Елмер).
 

Кликните овде да прочитате више о најбољим праксама за ултразвучну лизу и екстракцију ћелија, припрему лизата и препоруке за побољшања процеса!
 
Табела у наставку даје вам индикацију приближног капацитета обраде наших ултразвучних апарата величине лабораторије:

Литература / Референце