Ултразвучна лиза за западну блотњу

• Zapadna slabu tačku je analitička procedura za detekciju specifičnih proteina u uzorku homogenacije tkiva ili ekstrakta ćelije.
• Da bi pokrenuli zapadni slabu tačku ili da bi se izmerio aktivnost enme, mnogi tvrde da su potrebni pristup materijalima (npr. proteini, DNK, podcelularni fragmenti) u ćeliji.
• Sonacija je pouzdan i lak za rukovanje za kontrolisano poremećenost ćelija i limfom.

Ultrasonični prekid ćelije

Proteini iz tkiva i Kultivisana ćelija je prvi korak za mnoge biološke, biohemijske i analitičke tehnike (strana, Zapadna cvetovi, ELISA, masovna spektrometrija, itd.) ili čišćenje proteina. Za dobijanje velikog prinosa proteina, materijal ćelije i tkivo mora se efikasno rešiti. Da li je biljka ili životinjski tkivo, sonacija je metod za pripremu ćelije lysate lako i brzo.

Prednosti Sonsikacija

• Brzo & Efikasno
• једноставан рад
• Veliki prinos proteina
• Ponovna produktivljiva/ponovljiva
• precizno kontrolisano
• podesivo

Immunopadavina protokol za Western Imunocvetovi

A. reagencija

Za pripremu rešenja, koristite prečišćena voda kao što je Milli-Q.

• 1X Fosfatno Bafano Saline (JRS)
• 1X bafer za ćelije: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM β-graficfosfata, 1 mm Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
  Važno: Dodaj 1 mM PMSF odmah pre upotrebe.
• 15 μl proteina A + 15 μl protein G je dovoljan za IP, ali može zavisiti od primarne antibinodnih i probnih volumena. Takođe, možete koristiti i pre mešovitih proteina A/G agana (npr. protein A za zečeve IgG i protein G za miša)
• 3X – uzorak bafera: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 na 25 ° c), 6% w/v SDS, 30% grafcerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromofenol Blue

B. priprema ćelijskih Lajsata

• Žetvu ćelije. Da bi se ćelije prebile pod uslovima koji ne označavaju uslove, uklonite medije i ispali ćelije sa ledom-hladnim Jumom.
• Uklonite JRS i dodajte 0,5 ml led-hladna 1X bafer za ćelije na svakoj ploči (10 cm) i inkubirati ploče na ledu na 5 minuta.
• Silovati ćelije sa tanjira i transfer na microcentrifuge tube. Držite se na ledu.
• Sonje dvaput na 10 sekundi u ledu-hladna immunosnacija (IP bafer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i protease inhibitorom mix). Za sonsikaciju, ВиалТвеетер ili ultrazvučalac istrage kao što je УП100Х или УП200Хт su najprikladniji.
• Centrifugi je na 15.000 g na 10 minuta na 4 ° c.
• Prebacite supernatantu na novu cijev. (Ako je potrebno, lysate se može uskladištiti na – 80 ° c.)
• Dodajte primarnu antagodiju supernatantu. Supernatant sa primarnom antibitizacijom je inkubirani za 1 h na 4 ° c pod svetlosnim agitima. Osnovna antibijodija se obično dodaje u količini od 10x koncentrisanih nego što se koristi za zapadnjovanje. (Možete započeti sa 1μg Per 100 μL.)
• Supernatant je potom dodatno Inkubirao sa mešavinom jednakih količina proteina A-agana (Invitrogen) i proteina G agana za još 1 h.
• Wash agisna Peleta tri puta sa IP baferu. Nakon toga, izdvojite povezane belančevine pomoću bafera za utovar SDS-a, zagrejanjem na 95 ° c na 5 minuta.

C. Immunopadavina

• Uzmite 200 μl Cell lysate i dodajte primarne antibite. Inkubat sa nežnim Rotom preko noći na 4 ° c.
• Dodavanje proteina a ili G Agena (20 μl od 50% lezaj slurrija). Inkubat sa nežnim Rockom za 1 – 3 sata na 4 ° c.
• Microcentrifuge za 30 sekundi na 4 ° c. Wash pelet pet puta sa 500 μl od 1X bafera ćelijskih ćelija. Držite se na ledu tokom Peresa.
• Preljetljte pelete sa 20-ti, uzorak bafera od 3X. Vortex, a onda microcentrifuge 30 sekundi.
• Zagrejte uzorak na 95 – 100 ° c za 2 – 5 minuta i microcentrifuge za 1 minut u 14.000 X g.
• Učitajte uzorak (15 – 30 μl) na "SDS-PAGE gel" (12 – 15%).
• Analizirajte uzorak na zapadu.

Zapadna Blot analiza sa ultrasonicatorom UP50H

Sledeći protokol je korišten u studiji Kriebisch et Al. (2011):
Ukupan broj proteina bio je izolovan iz MC3T3-E1 ćelija tretiranih sa 1, 25 (OH)₂D₃ (10^{− 8} M) ili vozilo. Ćelije su prebile sa bafera koji sadrži 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fišer naučni); 0,1% Natrijum-sulfat (Fišer) (Fisher naučno); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% natrijum-okat (Merck). Ćelija lysate je bila sonena za 2 × 10 s u ciklusu 1 i 80 sa UP50H ultrasonični procesor (Hielscher, ultrazvučna tehnologija, Telucnik, Nemačka). Nakon toga materijal je bio centrifugiran na 10 min u 14.000 RPM i supernatant se koristio za Zapadnjuovanje. Dvadeset pet μg proteina kuvano je u uzorku od bafera i smanjenjem agenta (Invitrogen), a zatim je odvojen od strane SDS-a koristeći 4 – 12% poliakrylamide gelova (Invitrogen) i prebačen u Nitrocelulozu, (zdravstvena nega ge). "Šel" je blokiran za 1 h sa TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) koja sadrži 1% unovčajna (Sigma-Aldrich) i 1% Tris (1 M). Nakon blokiranja, u laboratoriji prof. R. Banerelje, En Arbor, MI, sad), je u 4 ° c sa primarnim antibakterijom (zec anti-ljudski CBS 1/500.). Inkubacija sa horseradkastom peroxidaze (HPR)-conžonated sekundarno-antibijumija (Dako) izvršena je za 1 h na sobnoj temperaturi. Sva BLOB su razvijena unapređenom hemiluminesencije (Perkin Elmer).

Literatura/reference