Hielscher ultrazvučna tehnologija

Ултразвучна лиза за западну блотњу

  • Zapadna slabu tačku je analitička procedura za detekciju specifičnih proteina u uzorku homogenacije tkiva ili ekstrakta ćelije.
  • Da bi pokrenuli zapadni slabu tačku ili da bi se izmerio aktivnost enme, mnogi tvrde da su potrebni pristup materijalima (npr. proteini, DNK, podcelularni fragmenti) u ćeliji.
  • Sonacija je pouzdan i lak za rukovanje za kontrolisano poremećenost ćelija i limfom.

Ultrasonični prekid ćelije

Proteini iz tkiva i Kultivisana ćelija je prvi korak za mnoge biološke, biohemijske i analitičke tehnike (strana, Zapadna cvetovi, ELISA, masovna spektrometrija, itd.) ili čišćenje proteina. Za dobijanje velikog prinosa proteina, materijal ćelije i tkivo mora se efikasno rešiti. Da li je biljka ili životinjski tkivo, sonacija je metod za pripremu ćelije lysate lako i brzo.

Prednosti Sonsikacija

  • Brzo & Efikasno
  • једноставан рад
  • Veliki prinos proteina
  • Ponovna produktivljiva/ponovljiva
  • precizno kontrolisano
  • podesivo

Immunopadavina protokol za Western Imunocvetovi

A. reagencija

Za pripremu rešenja, koristite prečišćena voda kao što je Milli-Q.

  • 1X Fosfatno Bafano Saline (JRS)
  • 1X bafer za ćelije: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM β-graficfosfata, 1 mm Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
    Važno: Dodaj 1 mM PMSF odmah pre upotrebe.
  • 15 μl proteina A + 15 μl protein G je dovoljan za IP, ali može zavisiti od primarne antibinodnih i probnih volumena. Takođe, možete koristiti i pre mešovitih proteina A/G agana (npr. protein A za zečeve IgG i protein G za miša)
  • 3X – uzorak bafera: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 na 25 ° c), 6% w/v SDS, 30% grafcerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromofenol Blue
Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

ВиалТвеетер za ultrasonični probni avans

Контактирајте нас! / Питајте нас!





Molimo vas da zabeležite naše Правила о приватности.


Soniranost je važan korak tokom pripreme uzorka

UP200St sa mikro-tipom za uzorak sonacija

B. priprema ćelijskih Lajsata

  • Žetvu ćelije. Da bi se ćelije prebile pod uslovima koji ne označavaju uslove, uklonite medije i ispali ćelije sa ledom-hladnim Jumom.
  • Uklonite JRS i dodajte 0,5 ml led-hladna 1X bafer za ćelije na svakoj ploči (10 cm) i inkubirati ploče na ledu na 5 minuta.
  • Silovati ćelije sa tanjira i transfer na microcentrifuge tube. Držite se na ledu.
  • Sonje dvaput na 10 sekundi u ledu-hladna immunosnacija (IP bafer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i protease inhibitorom mix). Za sonsikaciju, ВиалТвеетер ili ultrazvučalac istrage kao što je УП100Х или УП200Хт su najprikladniji.
  • Centrifugi je na 15.000 g na 10 minuta na 4 ° c.
  • Prebacite supernatantu na novu cijev. (Ako je potrebno, lysate se može uskladištiti na – 80 ° c.)
  • Dodajte primarnu antagodiju supernatantu. Supernatant sa primarnom antibitizacijom je inkubirani za 1 h na 4 ° c pod svetlosnim agitima. Osnovna antibijodija se obično dodaje u količini od 10x koncentrisanih nego što se koristi za zapadnjovanje. (Možete započeti sa 1μg Per 100 μL.)
  • Supernatant je potom dodatno Inkubirao sa mešavinom jednakih količina proteina A-agana (Invitrogen) i proteina G agana za još 1 h.
  • Wash agisna Peleta tri puta sa IP baferu. Nakon toga, izdvojite povezane belančevine pomoću bafera za utovar SDS-a, zagrejanjem na 95 ° c na 5 minuta.

C. Immunopadavina

  • Uzmite 200 μl Cell lysate i dodajte primarne antibite. Inkubat sa nežnim Rotom preko noći na 4 ° c.
  • Dodavanje proteina a ili G Agena (20 μl od 50% lezaj slurrija). Inkubat sa nežnim Rockom za 1 – 3 sata na 4 ° c.
  • Microcentrifuge za 30 sekundi na 4 ° c. Wash pelet pet puta sa 500 μl od 1X bafera ćelijskih ćelija. Držite se na ledu tokom Peresa.
  • Preljetljte pelete sa 20-ti, uzorak bafera od 3X. Vortex, a onda microcentrifuge 30 sekundi.
  • Zagrejte uzorak na 95 – 100 ° c za 2 – 5 minuta i microcentrifuge za 1 minut u 14.000 X g.
  • Učitajte uzorak (15 – 30 μl) na "SDS-PAGE gel" (12 – 15%).
  • Analizirajte uzorak na zapadu.

Контактирајте нас / Питајте за више информација

Разговарајте са нама о вашим захтевима за обраду. Ми ћемо препоручити најпогодније параметре подешавања и обраде за свој пројекат.





Molimo vas da zabeležite naše Правила о приватности.


Više protokola za Soniranost

Zapadna Blot analiza sa ultrasonicatorom UP50H

Sledeći protokol je korišten u studiji Kriebisch et Al. (2011):
Ukupan broj proteina bio je izolovan iz MC3T3-E1 ćelija tretiranih sa 1, 25 (OH)2D3 (10− 8 M) ili vozilo. Ćelije su prebile sa bafera koji sadrži 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fišer naučni); 0,1% Natrijum-sulfat (Fišer) (Fisher naučno); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% natrijum-okat (Merck). Ćelija lysate je bila sonena za 2 × 10 s u ciklusu 1 i 80 sa UP50H ultrasonični procesor (Hielscher, ultrazvučna tehnologija, Telucnik, Nemačka). Nakon toga materijal je bio centrifugiran na 10 min u 14.000 RPM i supernatant se koristio za Zapadnjuovanje. Dvadeset pet μg proteina kuvano je u uzorku od bafera i smanjenjem agenta (Invitrogen), a zatim je odvojen od strane SDS-a koristeći 4 – 12% poliakrylamide gelova (Invitrogen) i prebačen u Nitrocelulozu, (zdravstvena nega ge). "Šel" je blokiran za 1 h sa TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) koja sadrži 1% unovčajna (Sigma-Aldrich) i 1% Tris (1 M). Nakon blokiranja, u laboratoriji prof. R. Banerelje, En Arbor, MI, sad), je u 4 ° c sa primarnim antibakterijom (zec anti-ljudski CBS 1/500.). Inkubacija sa horseradkastom peroxidaze (HPR)-conžonated sekundarno-antibijumija (Dako) izvršena je za 1 h na sobnoj temperaturi. Sva BLOB su razvijena unapređenom hemiluminesencije (Perkin Elmer).

Литература / Референце



O zapadu

Blob su analitičke procedure gde se DNK, RNA i proteina prebacuju na nosač kako bi mogli da se odvajaju.
Južna slabu tačku se koristi za detekciju DNK, severne slabu tačku za RNA i zapadnu slabu tačku za proteine.
Zapadna bloza se naziva i protein immunostidka jer se za to posebno otkriva antigena. Zapadna Bloza je jedan od najvažnijih metoda analize za otkrivanje specifičnih proteina u uzorku. U zapadnoj blogi, proteini su nemobilizovani na sjećanja da bi ih otkrili koristeći monkični ili polizaponska antitela.
SDS-polyacrylamide gel elektroforesis (SDS-strana) osnovne belančevine odvojene su 3-D strukturom ili denatiziranim protezima do dužine polipeptida. Proteini se potom prenose u jednu odnju (obično nitrocelulose ili PVDF), gde su umrljane antitela karakterističnim za ciljnim protezom. "Gel elektroforesis" uključen je u zapadnu slabu tačku analizu da bi se rešio pitanje prekogranične aktivnosti antitela.
Nakon toga, odvojene belančevine se rastavljaju na matricu (uglavnom na nitrocelulose ili PVDF), gde su umrljane antitela. Antitela funkcionišu kao istraga i posebno su izabrane za ciljne proteine. Analiza lokacije i intenzitet specifične reakcije otkriva detalje ciljnih proteina u datom uzorku. Zapadnjaci mogu da detektuju ciljni proteini koji je nizak, zbog visoke rezolucije gela elektrofoska i snažne specifičnosti i visoke osećajnosti immunoasa. Zapadna slabu tačku metoda se koristi u molekularnom biologiji, biohemiji, imunogenetici i drugim molekularnom istraživačkom polju.
Među ostalim srodnim tehnikama su i Dot slabu tačku analiza, immunohistohemija i immunocitoghemija u kojoj se antitela koriste za otkrivanje proteina u tkivima i ćelijama po immunopolju, kao i enme-srodno-srodno-vezivi asreci (Elisa).