Ултразвучна лиза за вестерн блот

• Вестерн блот је аналитички поступак за детекцију специфичних протеина у узорку хомогената ткива или ћелијског екстракта.
• За извођење вестерн блота или мерење активности ензима, многи тестови захтевају приступ материјалима (нпр. протеинима, DNA, субћелијским фрагментима) заробљеним у ћелији.
• Соникација је поуздан метод за контролисано разарање и лизу ћелија који је једноставан за примену.

Ултразвучно разарање ћелија

Екстракција протеина из ткива и култивисаних ћелија први је корак у многим биолошким, биохемијским и аналитичким техникама (PAGE, вестерн блот, ELISA, масена спектрометрија итд.) или у пречишћавању протеина. Да би се постигао висок принос протеина, ћелијски материјал и ткиво морају се ефикасно разорити/ лизирати. Било да је реч о биљној ћелији или животињском ткиву, соникација је метод за једноставну и брзу припрему вашег ћелијског лизата.

Предности соникације

• брза и ефикасна
• једноставна примена
• висок принос протеина
• репродуктивна/ поновљива
• прецизно контролисана
• скалабилна

Протокол имунопреципитације за вестерн имуноблот

А. Реагенси

За припрему раствора користите пречишћену воду, као што је Milli-Q.

• 1X физиолошки раствор пуферован фосфатима (PBS)
• 1X пуфер за лизу ћелија: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM натријум-пирофосфата, 1 mM β-глицерофосфата, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml леупептина
  Важно: Додајте 1 mM PMSF непосредно пре употребе.
• 15 μl протеина A+15 μl протеина G довољно је за IP, али то може зависити од вашег примарног антитела и запремине узорка. Можете користити и унапред помешану агарозу са протеинима A/ G (нпр. протеин A за афинитетно издвајање зечјег IgG и протеин G за афинитетно издвајање мишјег IgG)
• 3X SDS пуфер за узорке: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 на 25°C), 6% w/v SDS, 30% глицерола, 150 mM DTT, 0,03% w/v бромфенол плавог

Б. Припрема ћелијских лизата

• Сакупите ћелије. Да бисте сакупили ћелије у неденатуришућим условима, уклоните медијум и једном исперите ћелије ледено хладним PBS.
• Уклоните PBS и додајте 0,5 ml ледено хладног 1X пуфера за лизу ћелија у сваку плочу (10 cm), па инкубирајте плоче на леду 5 минута.
• Састружите ћелије са плоча и пребаците их у микроцентрифугалне епрувете. Држите на леду.
• Соницирајте два пута по 10 секунди у ледено хладном пуферу за имунопреципитацију (IP пуфер: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 и смеша инхибитора протеаза). За соникацију су VialTweeter или ултрасоникатор са сондом, као што су UP100H или UP200Ht најпогоднији.
• Центрифугирајте лизате на 15.000 g током 10 минута на 4°C.
• Пребаците супернатант у нову епрувету. (Ако је потребно, лизат се може чувати на –80°C.)
• Додајте примарно антитело у супернатант. Супернатант са примарним антителом инкубира се 1 h на 4°C уз благо мешање. Примарно антитело се обично додаје у 10x већој концентрацији од оне која се користи за вестерн блот. (Можете почети са 1μg на 100μL.)
• Супернатант се затим додатно инкубира са смешом једнаких количина агарозе са протеином A (Invitrogen) и агарозе са протеином G још 1 h.
• Исперите талоге агарозе три пута IP пуфером. Затим екстрахујте везане протеине пуфером за наношење узорака за SDS-PAGE загревањем на 95°C током 5 минута.

В. Имунопреципитација

• Узмите 200 μl ћелијског лизата и додајте примарно антитело. Инкубирајте преко ноћи на 4°C уз благо љуљање.
• Додајте агарозне куглице са протеином A или G (20 μl 50% суспензије куглица). Инкубирајте уз благо љуљање 1–3 сата на 4°C.
• Микроцентрифугирајте 30 секунди на 4°C. Исперите талог пет пута са 500 µl 1X пуфера за лизу ћелија. Током испирања држите на леду.
• Ресуспендујте талог са 20 μl 3X SDS пуфера за узорке. Промешајте на вортекс мешалици, а затим микроцентрифугирајте 30 секунди.
• Загрејте узорак на 95–100°C током 2–5 минута и микроцентрифугирајте 1 минут на 14.000 X g.
• Нанесите узорак (15–30 μl) на SDS-PAGE гел (12–15%).
• Анализирајте узорак вестерн блотом.

Вестерн блот анализа помоћу соникатора UP50H

Следећи протокол са соникатором UP50H са сондом коришћен је у студији Kriebisch и сар. (2011):
Укупни протеини изоловани су из ћелија MC3T3-E1 третираних са 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) или носачем. Ћелије су лизиране пуфером који садржи 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% натријум-додецил-сулфата (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) и 0,5% натријум-деоксихолата (Merck). Ћелијски лизат сонициран је 2 × 10 s при подешавању циклуса на 1 и амплитуде на 80 помоћу ултразвучног процесора UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Телтов, Немачка). Потом је материјал центрифугиран 10 min на 14.000 rpm, а супернатант је коришћен за вестерн блот. Двадесет пет μg протеина прокувано је у пуферу за узорке и редукционом средству (Invitrogen), а затим раздвојено методом SDS-PAGE на 4–12% полиакриламидним геловима (Invitrogen) и пренето на нитроцелулозну мембрану (GE health care). Мембрана је блокирана 1 h раствором TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) који садржи 1% казеина (Sigma-Aldrich) и 1% Tris (1 M). Након блокирања, мембрана је инкубирана преко ноћи на 4°C уз благо мешање са примарним антителом (зечје антитело против хуманог CBS 1/500, развијено у лабораторији проф. R. Banerjee, Ен Арбор, MI, САД). Инкубација са секундарним антителом конјугованим са пероксидазом рена (HPR) (Dako) спроведена је током 1 h на собној температури. Сви блотови су развијени појачаном хемилуминисценцијом (Perkin Elmer).
 

Кликните овде да прочитате више о најбољим поступцима за ултразвучну лизу ћелија и екстракцију, припреми лизата и препорукама за побољшање процеса!
 
Табела у наставку даје преглед приближног капацитета обраде наших лабораторијских ултрасоникатора:

Литература / Референце

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.