Ултразвучно ДНК стрижење

Током смицања ДНК и РНК, дуги молекули ДНК се фрагментирају на мање комаде, што је кључни корак у припреми узорака за изградњу библиотеке секвенционирања нове генерације (НГС). Ултразвучно смицање ДНК користи силе акустичне кавитације да разбије ДНК или РНК на фрагменте у распону од 100 бп до 5 кб. Овај метод омогућава прецизну контролу над величином фрагмента, олакшавајући прилагођавање жељеној дужини ДНК за оптималне резултате секвенцирања.

Скидање ДНК помоћу ултразвука

Хиелсцхер Ултрасоницс нуди различита решења заснована на ултразвуку за смицање ДНК, РНК и хроматина. Изаберите између ултразвучних апарата типа сонде (нпр. УП100Х) за директну соникацију користећи микротип, или користите ВиалТвеетер или ултразвучни цупхорн за индиректну припрему ДНК различитих узорака истовремено. Хиелсцхер нуди идеалан уређај с обзиром на ваше потребе: било да имате 1 или до 10 узорака, запремине од микролитара до литара – Хиелсцхер соникатори ће испунити ваше захтеве за припрему фрагмената ДНК, РНК и хроматина на правој дужини. Репродуцибилност, једноставан рад и прецизна контрола омогућавају поуздану библиотеку за секвенцирање следеће генерације.
За разлику од ензимске фрагментације ДНК, ултразвучно смицање примењује чисте механичке силе смицања без додавања икаквих хемикалија. Прецизним подешавањем параметара процеса, ултразвучно смицање производи фрагменте ДНК високе молекуларне тежине (плазмид и геномска ДНК).
Пречишћене нуклеинске киселине могу бити амплификоване пре или после корака фрагментације.
Параметри соникације (снага, пулсни циклус / бурстови, време и температура) могу се безбедно контролисати преко подешавања софтвера.

Протоколи за ултразвучно стрижење ДНК

За тест имунопреципитације хроматина

Укратко, ћелије су постављене у посуде пречника 60 мм (400 000 по посуди) и трансфициране са РхоА сиРНА (као што је описано); након 72 х, инкубирани су са формалдехидом (коначна концентрација, 1%) током 10 минута на 37 ° Ц да би се протеини унакрсно повезали са ДНК. Реакција унакрсног повезивања је угашена додатком једне десетине запремине 1,25 мол/Л глицина, дајући 125 ммол/Л коначну концентрацију. Ћелије су два пута испране ледено хладним ПБС, ресуспендоване у пуферу за радиоимунопреципитацију [150 ммол/Л НаЦл, 1% НП40, 0,5% деоксихолат, 0,1% СДС, 5 ммол/Л ЕДТА, 50 ммол/Л Трис-ХЦл.0пХ. )] који садржи 1 ммол/Л фенилметилсулфонил флуорида, 1 Аг/мЛ апротинина и 1 Аг/мЛ пепстатина А, и држан на леду 30 мин. Затим су ћелијски лизати соникирани на леду са а Хиелсцхер УП200С ултразвучни соникатор (3 к 40 с, амплитуда 40%, циклус 1; Хиелсцхер Ултрасоницс ГмбХ) док се умрежени хроматини не пресеку да би се добили ДНК фрагменти између 200 и 1000 бп. Једна десетина целог лизата је коришћена за квантификацију количине ДНК присутне у различитим узорцима и сматрана је као “укупна улазна ДНК”. Супернатанти су инкубирани са ДНК сперме лососа/протеин агароза-50% суспензије да би се смањила неспецифична позадина. Имунопреципитација је затим урађена преко ноћи на 4°Ц са 5 Аг анти-НФ-нБ п65 (Упстате) или без антитела (негативна контрола). Ови супернатанти су допуњени са 5 мол/Л НаЦл и загревани преко ноћи на 65°Ц да би се повратиле унакрсне везе протеин-ДНК. Имунокомплекси су даље третирани протеиназом К без Дназе и РНазе, а ДНК је пречишћена екстракцијом фенолом/хлороформом и преципитацијом етанолом. ПЦР је урађен са специфичним прајмерима који одговарају секвенци унутар промоторског региона хуманог иНОС гена (п1 прајмер: 5¶-ГАГГГЦТТТЦЦЦА-ГААЦЦААГ-3¶; п2 прајмер: ГЦТГГГЦТАЦТГАЦЦЦАГ-ЦАГТТЦЦАГ-3¶). (Доублиер ет ал., 2008)

Студије експресије ЕГФП

За студије експресије, рекомбинантни сој Л. тарентолае п10::Ф9Бегфп1.4дБсат#12 (Јена Биосциенце, Немачка) са геном за ЕГФП (Енханцед Греен Флуоресцент Протеин), интегрисаним хромозомским ссу, култивисан је у различитим медијима као што је претходно описано и додатно допуњен са 100 мг л^-1 Ноурсеотхрицин (Јена Биосциенце, Немачка). Током култивације, узети су узорци од 1 мл, центрифугирани (2000 × г, 20°Ц, 10 мин) и испрани са 0,9% раствором НаЦл. Пелет је ресуспендован у пуферу (20 мМ ХЕПЕС, 5 мМ ЕДТА, 2 мМ ДТТ) и дезинтегрисан сонификацијом помоћу ултразвучног процесора УП400С (примена енергије ∼ 400 Вс). Ћелијски остаци су уклоњени центрифугирањем (6000 × г, 4°Ц, 5 мин) и анализирани електрофорезом натријум додецил сулфат – полиакриламид гел (СДС-ПАГЕ) у редукционим условима према методи Лаеммлија (1970) са 12,5% полиакраламидних гелова. . Експресија ЕГФП је испитивана у узбурканој култури. (Фритсцхе ет ал. 2007)

имунопреципитација хроматина

Тест имунопреципитације хроматина је изведен коришћењем ЦхИП-ИТ^ТМ Екпресс (Ацтиве Мотиф, Царлсбад, ЦА, УСА) према упутствима произвођача са неким модификацијама. Укратко, диференцирани људски подоцити су умрежени са 1% формалдехида током 10 минута на собној температури. Ћелије су испране ледено хладним ПБС-ом и реакција фиксације је заустављена додавањем 0,125 М глицина током 5 минута на собној температури. Ћелије су поново испране ледено хладним ПБС-ом и састругане са посуде. Ћелије су пелетиране центрифугирањем и ресуспендоване у пуферу за лизу. Након центрифугирања, пелетирана језгра су ресуспендована у пуферу за смицање, инкубирана на леду 30 минута и хроматин је срезан ултразвуком, нпр. УП100Х (Хиелсцхер Ултрасоницс ГмбХ, Телтов, Немачка) при 25% снаге 5 импулса од по 20 секунди на леду у фрагменте од приближно 200–600 бп. Одрезани хроматин је затим центрифугиран и супернатант је сакупљен. За имунопреципитације, 60 μл хроматина је инкубирано са 1 μг Сп1 (Санта Цруз Биотецхнологи, Санта Цруз, Калифорнија, САД), НФ-κБ п65 (Абцам, Цамбридге, УК) или НФ-κБ п50 (Абцам) антитела или са зечјим антителима ИгГ (Зимед Лабораториес), као негативна контрола, преко ноћи у 4°Ц са лаганом ротацијом. Имунокомплекси везани за магнетне перле су сакупљени помоћу магнетног постоља, опсежно испрани, а унакрсне везе протеин/ДНК су обрнуте и ДНК је елуирана за ПЦР анализу у реалном времену. (Ристола ет ал. 2009)

Припрема ЕХЕЦ ДНК за анализу низа чипова

Распоред ћелијских лизата и екстрахованих ДНК
Бактеријске пелете суспендоване у ПБС до жељене коначне концентрације су третиране са ултразвучни дисруптор УП100Х (Хиелсцхер ГмбХ, Немачка) опремљен микроврхом МС1 (пречника 1 мм). Радна фреквенција је била 30 кХз, а ефективна излазна снага је била 100 В. Током рада, узорци су хлађени у купатилу са ледом и водом, мешани и центрифугирани. Узорци су коришћени за студије проточне цитометрије, док су за касније руковање узорци подвргнути топлотној обради (95°Ц, 5 мин). Сирови ћелијски лизати су обрађени смешом фенол:хлороформ:изоамил алкохол (25:24:1). Једнака запремина ове мешавине је додата узорку лизата, раствор је снажно мешан вортексом током 15 с и центрифугиран на 15,000 кг током 2 минута на собној температури (РТ) око 22°Ц. Горња водена фаза која садржи геномску ДНК пажљиво је одвојена и сакупљена у нову стерилну Епендорфову епрувету.
Након тога, узорци су ултразвучни ради фрагментације ДНК. Корак соникације је реализован у истим условима као што је горе описано. Да би се проценили ефекти фрагментације на геномску ДНК, узорци су анализирани коришћењем електрофорезе у агарозном гелу.
(…) Узорци који су претходно обрађени ултразвуком током 2,5 мин подвргнути су кораку екстракције након топлотне обраде и центрифугирања. Ослобођена ДНК је екстрахована два пута мешавином фенол:хлороформ:изоамил алкохол, а затим је подвргнута другој соникацији током 0-15 мин. Електрофореза у агарозном гелу је коришћена за одређивање дистрибуције величине ДНК подвргнуте ултразвучној фрагментацији након екстракције (слика у горњем десном углу). Високо фрагментирана ДНК је била евидентна из присуства размаза ДНК, а не трака високе молекуларне тежине које су елиминисане из узорака обрађених ултразвуком током 2,5 минута или дуже. Дужа соникација је постепено смањила дужину фрагмената на приближно 150 – 600 бп, а ултразвук у трајању од 15 минута додатно је деградирао ове фрагменте, што се углавном може видети по горњем делу размаза. Дакле, просечна величина фрагмента ДНК постепено је опадала са временом ултразвучне обраде, а третман од 5 минута је омогућио да се добију величине ДНК фрагмената најпогоднијих за тестове низа чипова. Коначно, успостављена је процедура припреме ДНК аналита која обухвата прва 2 минута ултразвучног третмана, екстракцију ДНК (2×) и накнадну соникацију од 5 минута. (Басселет ет ал. 2008)

Имунопреципитација хроматина (ЦхИП)

ХЕК293 ћелије су култивисане као што је горе описано и фиксиране са 2 мМ дисукцинимидил-глутарата током 45 минута на собној температури. Након тога, ћелије су испране два пута са ПБС. Хроматин је умрежен 10 минута на собној температури коришћењем 1% (в/в) формалдехида и два пута испран ледено хладним ПБС. Реакција унакрсног повезивања је заустављена инкубацијом са глицином у коначној концентрацији од 0,125 М током 5 минута на собној температури. После инкубације са трипсином, ћелије су састругане са посуде за ћелијску културу и испране два пута са ПБС. Ћелијска пелета је ресуспендована у пуферу за лизу (5 мМ цеви, пХ 8,0, 85 мМ КЦл, и 0,5% (в/в) Нонидет П-40), инкубирана на леду 10 минута и хомогенизована помоћу Доунце хомогенизатора. Након тога, језгра су пелетирана центрифугирањем (3500 кг, 5 мин, 4 °Ц) и ресуспендована у пуферу за језгра (50 мМ Трис-ХЦл, пХ 8,1, 10 мМ ЕДТА и 1% (в/в) СДС). Језгра су поремећена соникацијом са три 20-с импулса у а УП50Х соницатор (Хиелсцхер Ултрасцхалл Тецхнологие) при поставци циклуса 0,5 и амплитуде 30%, дајући фрагменте геномске ДНК са величином од 200 – 1000 бп. За ЦхИП, 50 г ДНК је разблажено 4 пута у пуферу за имунопреципитацију (16,7 мМ Трис-ХЦл, пХ 8,1, 167 мМ НаЦл, 1,2 мМ ЕДТА, 1,1% (в/в) Тритон Кс-100 и 0,01% (теж. в) СДС). (Веиске ет ал. 2006)

Анализа модификације хистона имунопреципитацијом хроматина (ЦхИП)

Укратко, 6 к 10⁶ ћелије су испране два пута са ПБС и умрежене на плочи културе 15 минута на собној температури у присуству 0,5% формалдехида. Реакција унакрсног повезивања је заустављена додавањем 0,125 М глицина. Сви наредни кораци су изведени на 48°Ц. Сви пуфери су претходно охлађени и садржали су инхибиторе протеазе (Цомплете Мини, Роцхе). Ћелије су испране два пута са ПБС, а затим остругане. Сакупљене пелете су растворене у 1 мл пуфера за лизу (1% СДС, 5 мМ ЕДТА, 50 мМ Трис пХ 8) и соникиране у хладном етанолном купатилу током 10 циклуса при 100% амплитуди користећи УП50Х соницатор (Хилшер, Телтов, Немачка). Фрагментација хроматина је визуелизована у 1% агарозном гелу. Добијени фрагменти су били у опсегу 200–500 пб. Растворљиви хроматин је добијен центрифугирањем соникираних узорака на 14.000 г током 10 минута на 48°Ц. Растворљива фракција је разблажена 1/10 у пуферу за разблаживање (1% Тритон Кс-100, 2 мМ ЕДТА, 20 мМ Трис пХ 8, 150 мМ НаЦл), затим подељена на аликвоте и чувана на 80°Ц до употребе. (Родригуез ет ал. 2008)