Ултразвучно смицање ДНК

При смицању ДНК и РНК, дуги молекули ДНК фрагментишу се на мање делове, што је кључан корак у припреми узорака за конструисање библиотека за секвенцирање следеће генерације (NGS). Ултразвучно смицање ДНК користи силе акустичне кавитације за разбијање ДНК или РНК на фрагменте величине од 100 bp до 5 kb. Ова метода омогућава прецизну контролу величине фрагмената, чиме се олакшава прилагођавање жељеној дужини ДНК ради оптималних резултата секвенцирања.

Смицање ДНК ултразвуком

Hielscher Ultrasonics нуди различита решења заснована на ултразвуку за смицање ДНК, РНК и хроматина. Изаберите соникатор са сондом (нпр. UP100H) за директну соникацију помоћу микроврха или користите VialTweeeter или ултразвучни cuphorn за истовремену индиректну припрему ДНК из различитих узорака. Hielscher нуди идеалан уређај у складу са вашим потребама: било да имате 1 или до 10 узорака, са запреминама од микролитара до литара – Hielscher соникатори ће испунити ваше захтеве за припрему фрагмената ДНК, РНК и хроматина одговарајуће дужине. Репродуктивност, једноставно руковање и прецизна контрола омогућавају добијање поуздане библиотеке за секвенцирање следеће генерације.
За разлику од ензимске фрагментације ДНК, ултразвучно смицање примењује искључиво механичке силе смицања без додавања било каквих хемикалија. Прецизним подешавањем процесних параметара, ултразвучно смицање даје фрагменте ДНК велике молекулске масе (плазмидна и геномска ДНК).
Пречишћене нуклеинске киселине могу се амплификовати пре или после корака фрагментације.
Параметри соникације (снага, циклус импулса / импулсни низови, време и температура) могу се безбедно контролисати путем софтверских подешавања.

Протоколи за ултразвучно смицање ДНК

За анализу имунопреципитацијом хроматина

Укратко, ћелије су засејане у посуде пречника 60mm (400.000 по посуди) и трансфектоване са RhoA siRNA (као што је описано); након 72 h, инкубиране су са формалдехидом (коначна концентрација, 1%) током 10 min на 37°C ради унакрсног повезивања протеина са ДНК. Реакција унакрсног повезивања заустављена је додавањем једне десетине запремине раствора глицина концентрације 1,25 mol/L, чиме је постигнута коначна концентрација од 125 mmol/L. Ћелије су двапут испране леденохладним PBS-ом, ресуспендоване у пуферу за радиоимунопреципитациону анализу [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% деоксихолата, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] који садржи 1 mmol/L фенилметилсулфонил-флуорида, 1 Ag/mL апротинина и 1 Ag/mL пепстатина A и држане на леду током 30 min. Затим су ћелијски лизати сониковани на леду помоћу уређаја Hielscher UP200S за ултразвучну соникацију (3 x 40 s, амплитуда 40%, циклус 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) док унакрсно повезани хроматин није уситњен смицањем тако да се добију фрагменти ДНК величине између 200 и 1.000 bp. Једна десетина укупног лизата коришћена је за квантификацију количине ДНК присутне у различитим узорцима и сматрана је „укупном улазном ДНК“. Супернатанти су инкубирани са 50% суспензијом ДНК сперме лососа/протеин-агарозе ради смањења неспецифичног позадинског сигнала. Имунопреципитација је затим спроведена преко ноћи на 4°C са 5 Ag антитела anti-NF-nB p65 (Upstate) или без антитела (негативна контрола). Овим супернатантима додат је NaCl концентрације 5 mol/L и загревани су преко ноћи на 65°C ради раскидања унакрсних веза протеина и ДНК. Имунокомплекси су даље третирани протеиназом K без DNase и RNase, а ДНК је пречишћена екстракцијом фенолом/хлороформом и преципитацијом етанолом. PCR је изведен са специфичним прајмерима који одговарају секвенци унутар промоторског региона људског гена iNOS (прајмер p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; прајмер p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Испитивања експресије EGFP

За испитивања експресије, рекомбинантни сој L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Немачка), са геном за EGFP (појачани зелени флуоресцентни протеин) интегрисаним у хромозомски ssu, гајен је у различитим подлогама као што је претходно описано, уз додатак 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Немачка). Током гајења узимани су узорци од 1 ml, центрифугирани (2000 × g, 20°C, 10 min) и испирани раствором 0,9% NaCl. Талог је ресуспендован у пуферу (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) и разграђен соникацијом помоћу ултразвучног процесора UP400S (примењена енергија ∼ 400 Ws). Ћелијски остаци су уклоњени центрифугирањем (6000 × g, 4°C, 5 min) и анализирани електрофорезом у полиакриламидном гелу са натријум-додецил-сулфатом (SDS-PAGE) у редукујућим условима према методи Laemmli (1970), уз употребу 12,5% полиакриламидних гелова. Експресија EGFP је испитивана у култури уз мешање. (Fritsche et al. 2007)

Имунопреципитација хроматина

Тест имунопреципитације хроматина изведен је применом ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Карлсбад, Калифорнија, САД) према упутствима произвођача, уз одређене измене. Укратко, диференцирани људски подоцити умрежени су 1% формалдехидом током 10 min на собној температури. Ћелије су испране ледено хладним PBS-ом, а реакција фиксације је заустављена додавањем 0,125 M глицина током 5 min на собној температури. Ћелије су поново испране ледено хладним PBS-ом и састругане са посуде. Ћелије су исталожене центрифугирањем и ресуспендоване у пуферу за лизу. Након центрифугирања, исталожена једра су ресуспендована у пуферу за фрагментацију смицањем, инкубирана на леду током 30 min, а хроматин је фрагментисан смицањем помоћу соникације, нпр. уређајем UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Телтов, Немачка) при снази од 25%, са 5 импулса у трајању од по 20 sec на леду, на фрагменте од приближно 200–600 bp. Фрагментисани хроматин је затим центрифугиран и супернатант је сакупљен. За имунопреципитације, 60 μl хроматина је инкубирано са 1 μg антитела на Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорнија, САД), NF-κB p65 (Abcam, Кембриџ, Уједињено Краљевство) или NF-κB p50 (Abcam), или са зечјим IgG (Zymed Laboratories) као негативном контролом, преко ноћи на 4°C уз благо ротирање. Имунокомплекси везани за магнетне куглице сакупљени су помоћу магнетног сталка и темељно испрани, након чега су раскинуте попречне везе између протеина и ДНК, а ДНК је елуирана за PCR анализу у реалном времену. (Ristola et al. 2009)

Припрема ДНК EHEC за анализу на микрочипу

Припрема ћелијских лизата и екстрахованих ДНК
Бактеријски талози суспендовани у PBS-у до жељене коначне концентрације третирани су ултразвучним дезинтегратором UP100H (Hielscher GmbH, Немачка), опремљеним микроврхом MS1 (пречника 1mm). Радна фреквенција била је 30 kHz, а ефективна излазна снага 100 W. Током рада, узорци су хлађени у купатилу са ледом и водом, мешани и центрифугирани. Узорци су коришћени за испитивања проточном цитометријом, док су за каснију обраду подвргнути топлотном третману (95°C, 5 min). Сирови ћелијски лизати обрађени су смешом фенол:хлороформ:изоамил-алкохол (25:24:1). Узорку лизата додата је једнака запремина ове смеше, раствор је снажно мешан на вортекс мешалици током 15 s и центрифугиран на 15.000 x g током 2 min на собној температури (RT), око 22°C. Горња водена фаза која садржи геномску ДНК пажљиво је одвојена и сакупљена у нову стерилну Eppendorf епрувету.
Затим су узорци сониковани ради фрагментације ДНК. Корак соникације спроведен је под истим условима као што је описано изнад. Да би се проценили ефекти фрагментације на геномску ДНК, узорци су анализирани електрофорезом у агарозном гелу.
(…) Узорци претходно сониковани током 2,5 min подвргнути су екстракцији након топлотног третмана и центрифугирања. Ослобођена ДНК екстрахована је два пута смешом фенол:хлороформ:изоамил-алкохол, а затим подвргнута другој соникацији током 0 – 15 min. Електрофореза у агарозном гелу коришћена је за одређивање расподеле величина ДНК подвргнуте ултразвучној фрагментацији након екстракције (слика горе десно). О високом степену фрагментације ДНК сведочило је присуство размаза ДНК уместо трака високе молекулске масе, које су нестале из узорака соникованих током 2,5 min или дуже. Дужа соникација постепено је смањивала дужину фрагмената на приближно 150 – 600 bp, а соникација током 15 min додатно је разградила ове фрагменте, што се углавном може видети у горњем делу размаза. Тако се просечна величина фрагмената ДНК постепено смањивала са временом ултразвучне обраде, а третман од 5 min омогућио је добијање фрагмената ДНК чије су величине најпогодније за анализе на чиповима са низовима проба. На крају је успостављен поступак припреме аналита ДНК који обухвата почетну ултразвучну обраду током 2 min, екстракцију ДНК (2×) и накнадну соникацију током 5 min. (Basselet et al. 2008)

Имунопреципитација хроматина (ChIP)

Ћелије HEK293 култивисане су као што је описано изнад и фиксиране са 2 mM дисукцинимидил-глутарата током 45 min на собној температури. Затим су ћелије два пута испране PBS-ом. Хроматин је умрежен током 10 min на собној температури помоћу 1% (v/v) формалдехида и два пута испран ледено хладним PBS-ом. Реакција умрежавања заустављена је инкубацијом са глицином при коначној концентрацији од 0,125 M током 5 min на собној температури. Након инкубације са трипсином, ћелије су састругане са посуде за ћелијску културу и два пута испране PBS-ом. Ћелијски талог ресуспендован је у пуферу за лизу (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl и 0,5% (v/v) Nonidet P-40), инкубиран на леду током 10 min и хомогенизован Dounce хомогенизатором. Затим су једра исталожена центрифугирањем (3500 x g, 5 min, 4 °C) и ресуспендована у пуферу за једра (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA и 1% (w/v) SDS). Једра су разорена соникацијом са три импулса у трајању од по 20 s помоћу соникатора UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) при подешеном циклусу од 0,5 и амплитуди од 30%, чиме су добијени фрагменти геномске ДНК претежно величине 200 – 1000 bp. За ChIP, 50g ДНК разблажено је 4 пута у пуферу за имунопреципитацију (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 и 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Анализа модификација хистона имунопреципитацијом хроматина (ChIP)

Укратко, 6 x 10⁶ ћелија је двапут испрано PBS-ом и умрежено на плочи за културу током 15 min на собној температури у присуству 0,5% формалдехида. Реакција умрежавања је заустављена додавањем 0,125 M глицина. Сви наредни кораци изведени су на 48°C. Сви пуфери су претходно охлађени и садржали су инхибиторе протеаза (Complete Mini, Roche). Ћелије су двапут испране PBS-ом, а затим састругане. Сакупљени талози су растворени у 1 ml пуфера за лизу (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) и сониковани у хладном етанолском купатилу током 10 циклуса при амплитуди од 100% помоћу соникатора UP50H (Hielscher, Телтов, Немачка). Фрагментација хроматина је визуализована у 1% агарозном гелу. Добијени фрагменти били су у опсегу 200–500pb. Растворљиви хроматин је добијен центрифугирањем соникованих узорака при 14.000g током 10 min на 48°C. Растворљива фракција је разблажена 1/10 у пуферу за разблаживање (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), затим подељена у аликвоте и чувана на 80°C до употребе. (Rodriguez et al. 2008)