Ултразвучни ДНА Схеаринг

• Tokom DNK i RNK se molekuli DNK raspadaju na manje delove. Fragmentacija DNK / RNK je jedan od važnih koraka pripreme uzorka koji je neophodan za kreiranje biblioteka za sekvenciranje sledeće generacije (NGS).
• Ultrazvučni DNK koristi snage akustične kavitacije za probiranje DNK ili RNA u komade 100 – 5kb BP.
• Ultrasonični Šering omogućava preciznu fragmentaciju DNK i prilagodjenja željenoj dužini DNK.

DNK shearing pomoću ultrazvučnosti

Hielscher Ultrasonics nudi razna rješenja na ultrazvuku za DNK, RNA i hromatin-Šering. Odaberite između ultrazvučnih ultrasonicatora u okviru istrage (npr. UP100H) za direktnu sonvaciju koristeći mikrosavjet, ili upotrebite "Vialvajer" ili Ultrazvučni kuphorn za indirektne DNK pripreme različitih uzoraka. Hielscher nudi idealni uređaj koji razmišlja o vašim potrebama: imate 1 ili do 10 uzoraka, nositelji od mikrolitre do litar litara – Hielscher ultrasonični procesori su dostupni da zadovolje vaše zahteve za pripremu DNK, RNA i hromatin fragmenata u desnoj dužini. Ponovno produktivnost, laka operacija i precizna kontrola omogućavaju pouzdanu biblioteku za sektašta sledeće generacije.
Za razliku od enmatove fragmentacije DNK, ultrasonični Šering primenjuje čiste mehaničke makaze, bez dodavanja hemikalija. Po preciznoj postavci procesnih parametara, ultrasonični Šering proizvodi visoko molekularne delove DNK (plazme i genomik DNK).
Prečišćena nukinske kiseline se mogu povećati pre ili posle koraka fragmentacije.
Parametri sonse (Power, pulsni ciklus, vreme i temperatura) se mogu bezbedno kontrolisati putem softverskih postavki.

Protokoli Ultrasonovog DNA šuška

Za Hromatin Imunopadavacije

Na kratko, ćelije su bile pocinkovane u prečniku od 60mm (400.000 po posudu) i prolazne sa RhoA siRNA (kao što je opisano); posle 72 h bili su inkubirani sa formaldehidom (završna koncentracija, 1%) za 10 min, na 37 ° c do ukrštine veze do DNA. Reakcija u vezi sa unakrsom povezivanjem bila je dodatak jednoj desetoj količini od 1,25 MOL/L glycine, dajući mu 125 mmol/L konačnu koncentraciju. Ćelije su oprane dva puta sa ledom-hladnim JRS, završena je u radioimmunopadavina asreci bafer [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxykolat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] sa 1 mmol/L fenilmetilesulfonil fluoride, 1 AG/mL aprotinin, i 1 AG/mL pestatin a i držao se na ledu za 30 min. Onda, ćelije su bile na ledu sa Hielscher UP200S Ultrazvučni sonicator (3 x 40 s, pojačke 40%, ciklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) sve dok se ne povežu hromatins sa više od 200 i 1.000 BP. Jedna desetina cele lysate je upotrebljena za kvantiste količine DNK u različitim uzorcima i smatraće se kao “Ukupna ulazna DNK”. Supernatansi su bili inkubirani sa lososom od lososa (DNA sperma)-50% surry da bi se smanjila nespecifična pozadina. Imunopadavitacija je tada izvršena preko noći u 4 ° c sa 5 AG anti-NF-nB p65 (Apstate) ili bez antibakterija (negativna kontrola). Ovi supernatansi su bili dopuneni sa 5 MOL/L i zagrejanim tokom noći na 65 ° c da bi vratili između proteina i DNK unakrsnih veza. Imunolosi su se dodatno lečili sa DNase-i RNase-slobodna proteinaze K, a DNK je očišćen od strane fenola/hloroform ekstrakta i etanola padavinskih padavina. PCR je urađen kod specifičnih primalaca koji odgovaraju nizu unutar promotera regiona ljudskog iNOS gena (P1 bukva: 5 ¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3 ¶; P2 bukova: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3 ¶). (Doublier et Al., 2008)

EGFP-studije izražavanja

Za doktorske studije, recombinant naprezanje L. tarentolae P10:: F9Begfp 1.4 dBsat # 12 (jena Bicljivost, Nemačka) sa genom za EGFP (poboljšani zeleni fluorescentni proteini), u različitim medijima, u raznim prethodno i dodatno dopunjen sa 100 mg l^-1 Nuri (jena Bicljivost, Nemačka). Tokom uzgoja, snimljene su 1 ml uzoraka, centrifugirane (2000 × g, 20 ° c, 10 min) i oprana sa 0,9% NaCl rešenja. Pelet je ponovo završio u baferu (20 mM-zavese, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) i dezintegrisanih sonifikacijom sa ultrasonnim procesorom УП400С (primena energetskog ∼ 400 ws). Otpad ćelija je uklonjen sa centrifugacijom (6000 × g, 4 ° c, 5 min) i analiziran od strane natrijum-dodekyl sulsudbine – poliacrylamide gel elektrofosis (SDS-stranica) pod smanjenjem uslova prema metodu Laemmli (1970) sa 12,5% poliacralamide gels. EGFP-izraz je pregledan u ne, kulturi. (Fritce et Al. 2007)

Hromatin immunopadavina

Hromatin imunoizacija je izvršena upotrebom čipa^Tm Ekspres (aktivno motiv, Carlslose, Kalifornija, USA) prema uputstvima proizvođača sa nekim modifikacijom. Ukratko, diferencloveni ljudski podokajta su se povezali sa 1% formaldehidom za 10 min na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprljene sa ledenom i hladnim jajem, a reakcija je zaustavljena, dodajući 0,125 M glycine za 5 min na sobnoj temperaturi. Ćelije su ponovo oprane sladoledu i izsilovane iz tanjira. Ćelije su bile peletirane od strane centrifugacije i ponovo su završene u baferu lysis. Nakon centrifugacije, peletirani nuklei su se ponovo završili u tampon baferu, koji je bio na ledu za 30 min, a hromatin je bio predrjen sonacijom, npr. УП100Х (Hielscher Ultrasonics GmbH, Telof, Nemačka) na 25% snage 5 pulsa od 20 sekundi svaki na ledu u fragmenti od približno 200 – 600 BP. Potom je sakupljen hromatin i supernatant. Za immunopadavine 60 μl of hromatin je bio inkubovan sa 1 μg od Sp1 (Santa Kruz biotehnologije, Santa Kruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Kembridž, UK) ili NF-κB P50 (Abcam) antitela ili sa zečom IgG (zenim laboratorijama, južno San Francisko, Kalifornija, sad), negativna kontrola, noćenje na 4 ° c sa nežnom rotacijom. Imunokompleksi povezani sa magnetnim perima sakupljeni su korišćenjem magnetnog štanda, često oprane, a protein/DNK je bio obrnut, a DNK je bio preokrenen u realnom vremenu PCR analize. (Ristola et Al. 2009)

EHEC priprema DNK za analizu Chip grupe

Raspored ćelijskih likova i izdvojene DNAs
Bakterijske peleti suspendovane u JRS do željene završne koncentracije Ultrazvučni razarač UP100H (Hielscher GmbH, Njemačka) opremljenu mikronapojnicu MS1 (1mm u prečniku). Operativna frekvencija je bila 30 kHz i efektivna izlazna moć je bila 100 W. Tokom operacije, uzorci su se ohladili u kupatilu leda, mešovita i centrifugovana. Uzorci su koristiti za protok ctometrijskih studija, a za kasnije rukovanje uzorci su bili izloženi toplotnim tretmanom (95 ° c, 5 min). Sirove ćelije su obrađivane sa mešavinom fenol: hloroform: isoamyl alkohol (25:24:1). Jednak volumen ove mix dodat je lysate uzorku, rešenje je bilo energično za 15 s i centrifugirano u 15.000 x g za 2 min na sobnoj temperaturi (RT) oko 22 ° c. Gornja etična faza koja sadrži genomički DNK je pažljivo odvojena i prikupljena u novoj sterilalnoj cevi.
Nakon toga uzorci su bili sononeni da bi se mogao fragmentirati DNA. Korak sonacija je realizovan u istim uslovima kao što je opisano iznad. Da bi se procenili fragmentacije na genomički DNK, uzorci su analizirani upotrebom agraste gel elektrofosresis.
(…) Uzorci koji su ranije imali za 2,5 minuta bili su podvrgnuti koraku za vađenje toplote posle tretmana grejanja i centrifugacije. DNK je izvađen dva puta sa fenol-om: hloroform: iziamil alkohol mix, a nakon toga je podvrgnuta drugoj sonnosti za 0 – 15 min. Agizena gel elektrofosresis je korišten za utvrđivanje veličine DNK izložene za post-izvlačenje ultrasoničan fragmentacija (Smok. na gornjoj desnoj strani). Visoko fragmentirana DNK je očigledna od prisustva DNK, a ne visoko molekularnih bendova koji su eliminisani od uzoraka koji su 2,5 min ili duže. Duži sonsikaciju postepeno smanjuju dužinu fragmenata do otprilike 150 – 600 BP, a sontacija za 15 min dodatno Degradirao te fragmente, kao što se može videti uglavnom u gornjem delu disara. Dakle, prosečna vrednost DNK-a je postepeno opala sa ultrazvučnim vremenom, a lečenje od 5 min je dozvoljeno da dobiju veličine od svih DNK najpogodnijih za Chip niz askaže. Na kraju je uspostavljena procedura pripreme DNK za prvu 2 min ultrasonnog tretmana, ekstrakcije DNK (2 ×) i naredna 5 min sonacija. (Basselet et Al. 2008)

Hromatin Immunopadavitacija (ChIP)

HEK293 ćelije su bile Kultivisana opisane iznad i ispravljene sa 2 mM disuccinimidyl-glutarate za 45 min na sobnoj temperaturi. Ćelije su potom dva puta oprane sa JRS. Hromatin je bio ukršten preko 10 min na sobnoj temperaturi, koristeći 1% (v/v) formaldehida i dvaput je opran sa ledenom. Reakcija u vezi sa povezivanjem bila je zaustavljena inkubacijom sa glycine u završnoj koncentracije od 0,125 M za 5 min na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije sa tripšin, ćelije su presilovane iz ćelijskih kultura i oprale dva puta u JRS. Ćelijska Peleta se ponovo završila u tampon baferu (5 mM cevi, pH 8,0, 85 mM KCl, i 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubirani na ledu za 10 min, i Homogenizovana sa homogenatorom. Zatim, nukelni su bili u peletaciji (3500 x g, 5 min, 4 ° c) i ponovo se završilo u nukelskom baferu (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA, i 1% (w/v) SDS). Nukchi su bili poremećeni sonivima sa 3 20-s pulsama u UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Tehnoie) na postavci ciklusa 0,5 i dužina 30%, donosi genomične fragmente DNK sa masovnom veličinom od 200 – 1000 BP. Za Chipa, 50g DNK je bio razblažen sa 4-ostruko u imunološki baferu (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100, i 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et Al. 2006)

Analiza histibara od hromatin immunopadavina (ChIP)

Nakratko, 6 x 10⁶ ćelije su se dva puta oprale sa JRS i ukrštenih na bazi za kulturu za 15 min na sobnoj temperaturi u prisustvu 0,5% formaldehida. Reakcija ukrštena povezivanjem je zaustavljena dodavanjem 0,125 miliona glycine. Svi naredni koraci počinjeni su na 48 ° c. Svi baferi su bili prehladni i sadržali su Prote-ove inhibaze (kompletne mini, Roche). Ćelije su se dva puta oprale sa JRS, a potom i sksilovana. Sakupljeni peleti rastali su se u 1 ml baferu (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) i bili su pronađeni u hladnim etanol kupatilu za 10 ciklusa na 100% UP50H sonicator (Hielscher, telo, Nemačka). Hromatin Fragmentacija je vizualizovana u "gel" od 1%. Dobijeni fragmenti bili su u rasponu 200 – 500pb. Rastvorljiv hromatin je dobijen od strane sononosnog uzorka sa 14, 000g za 10 min, na 48 ° c. Rastvorljiv razlomak je bio razblažen 1/10 u dililskom baferu (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), a potom je i uskladišten na 80 ° c do upotrebe. (Rodrigez et Al. 2008)