Plazmid priprema pomoću ultrazvučnosti

Ultrazvučnost je pouzdana tehnika fragmenta plazmidne DNK. Precizno kontrolisanje amplitude, režim pulsiranja i kontrola temperature su najvažnije karakteristike ultrazvučnog za neštetnu fragmentaciju plazmida. Pored toga, upotreba određenih agenasa pomaže u zaštiti od degradacije plazmida. Hielscher Ultrasonics nudi razna rešenja za kontrolisanu fragmentaciju plazmida od pojedinačnih bočica, istovremeno sonifikaciju brojnih uzoraka kao i višestruko dobrostojeće ploče. Saznajte više o uspešnoj fragmentaciji ultrazvučnog plazmida!

Plasmid Shearing koristi ultrazvučnost

Kada su DNK uzorci podvrgnuti ultrazvučnim talasima, ultrasonično generisane vibracije stvaraju akustičnu kavitaciju u tečnosti koja širi ili razbija molekule DNK visoke molekularne težine putem mehaničkih sila. Sonication je najrazličitija metoda za masovne DNK eksperimente, uključujući aplikacije, kao što je Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), za koje su male veličine fragmenata apsolutno ključne za dobijanje visoke rezolucije. (cf. Tseng et al., 2012)
Plazmid DNK (pDNA) je specifičan oblik DNK, karakteriše ga njegov oblik prstena i nalazi se u bakterijama i nekim eukariotima.
Supercoiled pDNA je željeni oblik plazmidne DNK jer pokazuje najbolje rezultate u down-stream procesima kao što su automatizovano sekvenciranje i transfekcija. Ultrazvučnost je pogodna za fragment pDNA, uključujući supercoiled pDNA, uspešno.
Thompson et al. (2008) je demonstrirao da je plasmid sonication, za koji se zna da fragmentira superkoilizovanu DNK, efikasan način da se poboljša sekvenca phred20 čitanih dužina do te mere da se ne razlikuju značajno od kontrolnog predloška Bekmana Koltera ili enzimski linearizovanih plazmida.

Upotreba Plasmid Vectors

Plazmidi se često koriste kao alati za kloniranje, prenos i manipulisanje genima. Kada se plazmidi koriste eksperimentalno u te svrhe, oni se zovu vektori. DNK fragmenti ili geni mogu biti ubačeni u vektor plazmida, stvarajući takozvani rekombinantni plazmid. Vektori plazmida se koriste kao vozila za uvoženje rekombinantne DNK u ćeliju domaćina i ključna su komponenta molekularnog kloniranja.
“Ne-virusni vektori se opsežno proučavaju za njihovu potencijalnu upotrebu u genskoj terapiji za lečenje raznih komplikovanih bolesti. Ne-virusni vektori štite plazmidnu DNK od fizičke, hemijske i enzimatske degradacije i isporučuju molekul DNK na ciljno mesto. Na primer, cationic liposomi, chitosan i druge pozitivno nabijene nanočestice formiraju komplekse sa plasmidnom DNK kroz elektrostatičke interakcije. Međutim, lako formirani cationic liposomi/plazmidni DNK kompleksi su relativno veliki (ili,300–400 nm) i heterogeni u prirodi što ih otežava upotreba u farmaceutskim aplikacijama. Veliki i heterogeni plazmidNI DNK/liposomi, plazmidni DNK/aerosoli i plazmidni DNK/peptidni kompleksi mogu se svesti na manje, a homogene čestice pomoću ultrazvučnosti.” (Sarker et al., 2019)
Istaknut primer za upotrebu vektora plazmida je CRISPR–Cas9. Sistem CRISPR–Cas9 se obično isporučuje u ćelije kao jedan veliki plazmid ili više manjih plazmida koji kodiraju ciljnu sekvencu, CRISPR vodič i Cas9.

Ultrazvučna priprema PLGA Nanočestica napunjenih DNK nanoprecipitacijom

Jo et al. (2020) used poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) in order to form a nanoparticle carrier for the delivery of a model CRISPR–Cas9 plasmid into primary bone marrow derived macrophages. Za nanoprecipitaciju PLGA nanočestica, PLGA sa dve različite krajnje grupe (ester i amine grupe) korišćena je sa ciljem da pozitivno nabijene amine end caps povećaju efikasnost enkapsulacije i učitavanja zbog interakcije punjenja između nje i negativno nabijene kičme DNK. U polipropilenskoj cevi od 50 mL polipropilena konusna centrifuga, 100 mg Pluronic F127 je rastvorena u 20 mL autoklavana DI voda mešanjem vrtloga praćenog 30 min nežne sonication koristeći ultrazvučnu kupku (pogledajte CupHorn). Dodata je autoklavana magnetna traka za komešanje i rešenje je bilo pomešano na 600 RPM za 30 min dok su ostala rešenja napravljena. Plastični labver je korišćen umesto staklenog posuđa u celom svetu da bi se umanjila nespecifiиna adsorpcija DNK. Rešenja PLGA rastvorena u DMF (44,48 mg/ ml) i TIPS pentacena rastvorena u THF -u (0,667 mg/ml) napravljena su odvojeno. PLGA je ostavljena quiescently da mokri u DMF-u 30 min pre nego što je sonicirana 30 min. (za pun protokol pogledajte Jo et al., 2020)

Plazmidna DNK zaštita tokom sonikacije

DNK uključujući plazmide i superkoilirane plazmide je veoma osetljiva degradacija. Svi raspoloživi metodi fragmentacije poznati su po određenim nedostacima. Ultrazvučna fragmentacija DNK je jedna od poželjnih metoda od kada kontrolisana sonicija u kombinaciji sa zaštitnim merama omogućava da se smanji oštećenje DNK pramenova.
Pored niskih postavki amplitude, režima pulsiranja i kontrole temperature tokom ultrazvučnog DNK šimaranja, upotreba određenih agenasa pokazala je značajan zaštitni efekat protiv degradacije DNK. Na primer, razni polimeri, peptidi i lipidi štite DNK plazmida tokom ultrazvučnosti.

Stabilnost plazmidne DNK, i plazmid DNK/IL nanokomplekse protiv ultrazvučnog stresa od čaršije istražena je korišćenjem agarose gel elektroforeza asaja. I plazmidni DNK i plazmidNI DNK/IL nanokompleksi bili su izloženi ultrazvučnom stresu za različite vremenske tačke. Plazmidni DNK je bio izložen ultrazvučnim stresom 0, 10, 20, 30 i 40 minuta. Međutim, plazmidni DNK/IL nanokompleksi bili su izloženi ultrazvučnom šear stresu 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minuta.
(studija i slika: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) je demonstrirao da kada su plazmid DNK / ionic tečnost (pDNA/IL) nanostrukture bile podvrgnute ultrazvučnom šear stresu za 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 min i složen sa komercijalno dostupnim cationic gen delivery agent lipofectaminom, procenat fluorescentnih pozitivnih ćelija je 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, odnosno 50%(pogledajte grafikon ispod). Procenat fluorescentnih pozitivnih ćelija se povećao kada su nanostrukture bile podvrgnute ultrazvučnom šear stresu 10, i 20 min, a nakon toga su se polako smanjivale.

Uticaj ionske tečnosti [Bmim][PF6] na isporuku plazmidne DNK u COS7 ćelije. Plazmid DNK/IL (ionic liquid) nanocomplexes su bili podvrgnuti ultrazvučnom šear stresu do 120 minuta i složeni sa LA pre isporuke u COS7 ćelije. Podaci pokazuju prosečan broj (%) GFP pozitivnih HeLa ćelija izbrojanih u 10 različitih mikroskopskih polja i eksperiment je izvršen više puta u tri različita dana. (Study and chart: ©Sarker et al., 2019)

Ultrazvučni lisnati preparat

Ultrazvučni protokol lize ćelije
Počnite sa obogaćenim uzorkom ćelija koji je pripremljen metodom razdvajanja ćelija (npr. razdvajanje imunomagnetnih ćelija, sortiranje ćelija aktiviranim fluorescencence (FACS), gustina preliva centrifugacije, izolacija ćelija imunodenziteta).
Uzorci ćelija moraju da prikaћu volumen bafera lize koji odgovara eksperimentalnom cilju i ultrazvuиniku tipa sonde.
Hipotonični baferi su poželjni jer poboljšavaju ultrazvučnu ćelijsku lizu. Važno je da se aditivi i koncentracija soli koriste na odgovarajući način.
Izaberite svoj ultrazvučni uređaj za lizu: Za indirektnu sonikuaciju bočica preporučuju se VialTweeter ili CupHorn. Za višestruke ploče, UIP400MTP je idealan ultrazvučnik. A najprikladnija je i klasična sonikacija tipa sonicija, ultrazvučni homogenizer kao UP100H ili UP200Ht sa mikro-bakšišom.
Protokol za sonikaciju tipa sonication: Stavite sondu ultrazvuka u volumen uzorka u mikrocentrifuge cevi i sonicajte za oko 10 sekundi. U zavisnosti od DNK uzorka, sonikacija se može ponoviti još jedan ili dva puta. Potreban unos ultrazvučne energije (Ws/mL) zavisi od viskoznosti uzorka i tipa DNK. Hlađenje putem ledene kupke i režim pulsacije ultrazvučnog sistema pomaže da se spreči da se uzorak termički razgradi.
Nakon ultrazvučne lize, uzorak se centrifugiše da bi se razdvojile krhotine peleta (koje sadrže neiskrene ćelije, jezgro i neisprobane organele)
Ako se uzorak ne obradi odmah dalje, može se uskladištiti na odgovarajućoj temperaturi kako bi se očuvala njegova isplativost.

Ultrazvučni za fragmentaciju DNK

Hielscher Ultrasonics nudi razne ultrazvučne platforme za DNK, RNK i fragmentaciju hromatina. Ove različite platforme uključuju ultrazvučne sonotrode( sonotrode), indirektna sonikativna rešenja za istovremenu probnu pripremu više cevi ili više bunarskih ploča (npr. 96-bunarske ploče, mikrotiter ploče), sonoreaktore i ultrazvučne cuphorne. Sve platforme za DNK shearing se napajaju pomoću frekventno podešenih ultrazvučnih procesora visokih performansi, koji precizno kontrolišu i pružaju reproduktivne rezultate.

Ultrazvučni procesori za bilo koji uzorak broja i veličine

Sa Hielscher-ovim ultrazvučnim ultrazvučnicima VialTweeter (za do 10 epruveta) i UIP400MTP (za mikroplate/ multiwell ploče) postaje lako moguće skratiti vreme obrade uzoraka zbog intenzivne i precizno kontrolne ultrazvučnosti dok dobijate željenu DNK raspodelu veličine i prinosa. Ultrazvučna fragmentacija DNK čini korake pripreme plazmida efikasnim, pouzdanim i skalabilnim. Protokoli se mogu linearno podešati sa jednog na brojne uzorke primenom konstantnih ultrazvučnih parametara.
Sondni ultrazvučnici sa jednim do pet prstiju idealni su za pripremu manjih uzoraka brojeva. Hielscher-ti laboratorijski ultrazvučni su dostupni sa različitim nivoima napajanja tako da možete odabrati idealan ultrazvučni disruptor za vašu aplikaciju vezanu za DNK.