Припрема плазмида уз помоћ ултразвука

Ултразвук је поуздана техника за фрагментацију плазмидне ДНК. Прецизно контролисана амплитуда, режим пулсирања и контрола температуре су најважније карактеристике ултразвучног апарата за неоштећујућу фрагментацију плазмида. Поред тога, употреба одређених агенаса помаже у заштити од разградње плазмида. Хиелсцхер Ултрасоницс нуди различита решења за контролисану фрагментацију плазмида из појединачних бочица, истовремено ултразвучну обраду бројних узорака као и плоча са више јажица. Сазнајте више о успешној ултразвучној фрагментацији плазмида!

Смицање плазмида помоћу ултразвука

Када су узорци ДНК подвргнути ултразвучним таласима, ултразвучно генерисане вибрације стварају акустичну кавитацију у течности која шиша или разбија молекуле ДНК високе молекуларне тежине путем механичких сила. Соникација је најчешће коришћена метода за експерименте са смицањем ДНК, укључујући апликације, као што је хроматинска имунопреципитација (ЦхИП), за коју су мале величине фрагмената апсолутно кључне за добијање високе резолуције. (уп. Тсенг ет ал., 2012)
Плазмидна ДНК (пДНК) је специфична форма ДНК, коју карактерише њен прстенасти облик и налази се у бактеријама и неким еукариотима.
Суперцоилед пДНК је жељени облик плазмидне ДНК јер показује најбоље резултате у низводним процесима као што су аутоматизовано секвенцирање и трансфекција. Ултразвучна обрада је погодна за успешно фрагментирање пДНК, укључујући супернамотану пДНК.
Thompson et al. (2008) demonstrated that plasmid sonication, which is known to fragment supercoiled DNA, is an effective way to improve sequence phred20 read lengths to the point that they are not significantly different from Beckman Coulter’s control template or enzymatically linearized plasmids.

Употреба плазмидних вектора

Плазмиди се често користе као алати за клонирање, трансфер и манипулисање генима. Када се плазмиди експериментално користе у ове сврхе, они се називају вектори. ДНК фрагменти или гени се могу убацити у плазмидни вектор, стварајући такозвани рекомбинантни плазмид. Плазмидни вектори се користе као носачи за покретање рекомбинантне ДНК у ћелију домаћина и кључна су компонента молекуларног клонирања.
“Невирусни вектори се опсежно проучавају за њихову потенцијалну употребу у генској терапији за лечење различитих компликованих болести. Невирусни вектори штите плазмидну ДНК од физичке, хемијске и ензимске деградације и испоручују молекул ДНК на циљно место. На пример, катјонски липозоми, хитозан и друге позитивно наелектрисане наночестице формирају комплексе са плазмидном ДНК путем електростатичких интеракција. Међутим, лако формирани комплекси катјонских липозома/плазмидних ДНК су релативно велики (тј. 300–400 нм) и хетерогени по природи што их чини тешким за употребу у фармацеутским апликацијама. Велики и хетерогени плазмид ДНК/липозоми, плазмид ДНК/аеросоли и плазмид ДНК/пептиди комплекси могу се редуцирати на мање и хомогене честице коришћењем ултразвучне обраде.” (Саркер ет ал., 2019)
Истакнути пример за употребу плазмидних вектора је ЦРИСПР-Цас9. ЦРИСПР-Цас9 систем се обично испоручује ћелијама као један велики плазмид или више мањих плазмида који кодирају циљну секвенцу, ЦРИСПР водич и Цас9.

Ултразвучна припрема ПЛГА наночестица напуњених ДНК нанопреципитацијом

Јо ет ал. (2020) користили су поли(млечну-ко-гликолну киселину) (ПЛГА) да би формирали носач наночестица за испоруку модела ЦРИСПР-Цас9 плазмида у макрофаге добијене из примарне коштане сржи. За нанопреципитацију ПЛГА наночестица, ПЛГА са две различите крајње групе (естарске и аминске групе) коришћене су са циљем да позитивно наелектрисане крајње капице амина повећају ефикасност инкапсулације и оптерећење услед интеракције наелектрисања између њега и негативно наелектрисане кичме ДНК. У полипропиленској конусној центрифугалној епрувети од 50 мЛ, 100 мг Плурониц Ф127 је растворено у 20 мЛ аутоклавиране ДИ воде мешањем вортексом након чега је уследило 30 минута нежне соникације помоћу ултразвучног купатила (види ЦупХорн). Додата је аутоклавирана магнетна мешалица и раствор је мешан на 600 РПМ током 30 мин док су остали раствори направљени. Пластични лабораторијски прибор је коришћен уместо стакленог посуђа да би се минимизирала неспецифична адсорпција ДНК. Посебно су направљени раствори ПЛГА раствореног у ДМФ (44,48 мг/мл) и ТИПС пентацена раствореног у ТХФ (0,667 мг/мл). ПЛГА је остављен мирно да се влажи у ДМФ-у 30 минута пре него што је 30 минута соникиран. (за цео протокол видети Јо ет ал., 2020)

Заштита плазмидне ДНК током ултразвука

ДНК укључујући плазмиде и суперсмотане плазмиде су веома осетљиве на деградацију. Све доступне методе фрагментације познате су по одређеним недостацима. Ултразвучна фрагментација ДНК је једна од пожељних метода пошто контролисана соникација у комбинацији са заштитним мерама омогућава да се смањи оштећење ланаца ДНК изазвано смицањем и топлотом.
Поред подешавања ниске амплитуде, режима пулсирања и контроле температуре током ултразвучног смицања ДНК, употреба одређених агенаса показала је значајан заштитни ефекат против деградације ДНК. На пример, различити полимери, пептиди и липиди штите плазмидну ДНК током ултразвучне обраде.

Стабилност плазмидне ДНК и нанокомплекса плазмидне ДНК/ИЛ на ултразвучни смичући стрес је испитивана помоћу есеја електрофорезе на агарозном гелу. И плазмидна ДНК и плазмидна ДНК/ИЛ нанокомплекси су били подвргнути ултразвучном напону смицања у различитим временским тачкама. Плазмидна ДНК је била изложена ултразвучном напону смицања 0, 10, 20, 30 и 40 минута. Међутим, плазмидни ДНК/ИЛ нанокомплекси су били изложени ултразвучном смичном напрезању током 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минута.(студија и слика: ©Саркер ет ал., 2019)

Саркер ет ал. (2019) су показали да када су наноструктуре плазмидне ДНК/јонске течности (пДНА/ИЛ) биле подвргнуте ултразвучном смичном напрезању у трајању од 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минута и комплексирале са комерцијално доступним катјонским геном агенса за испоруку липофектамина, проценат флуоресцентних позитивних ћелија био је 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% и 50%, респективно (види табелу испод). Проценат флуоресцентних позитивних ћелија се повећао када су наноструктуре биле подвргнуте ултразвучном смичном напрезању током 10 и 20 минута, а затим се полако смањивао.

Утицај јонске течности [Бмим][ПФ6] на испоруку плазмидне ДНК до ЦОС7 ћелија. Нанокомплекси плазмидне ДНК/ИЛ (јонске течности) подвргнути су ултразвучном напону смицања до 120 минута и комплексирани са ЛА пре него што су испоручени у ћелије ЦОС7. Подаци показују просечан број (%) ГФП позитивних ХеЛа ћелија избројаних у 10 различитих микроскопских поља и експеримент је изведен више пута у три различита дана. (Студија и графикон: ©Саркер ет ал., 2019)

Ултразвучна припрема лизата

Протокол ултразвучне лизе ћелија
Почните са обогаћеним узорком ћелија који је припремљен методом сепарације ћелија (нпр. имуномагнетна сепарација ћелија, флуоресцентно активирано сортирање ћелија (ФАЦС), центрифугирање у градијенту густине, изолација ћелија имуногустине).
Узорци ћелија морају показати запремину пуфера за лизу која је одговарајућа за експериментални циљ и ултрасоникатор типа сонде.
Пожељни су хипотонични пуфери јер појачавају ултразвучну лизу ћелија. Важно је да се адитиви и концентрација соли користе на одговарајући начин.
Изаберите свој ултразвучни уређај за лизу: За индиректну соникацију бочица препоручује се ВиалТвеетер или ЦупХорн. За плоче са више јажица, УИП400МТП је идеалан ултрасоникатор. И класична соникација типа сонде, ултразвучни хомогенизатор као што је УП100Х или УП200Хт са микро врхом су најпогоднији.
Протокол за соникацију типа сонде: Поставите сонду за ултразвук у запремину узорка у епрувету за микроцентрифугу и соницирајте прибл. 10 секунди. У зависности од узорка ДНК, соникација се може поновити још једном или два пута. Потребан унос ултразвучне енергије (Вс/мЛ) зависи од вискозитета узорка и типа ДНК. Хлађење преко ледене купке и режима пулсирања ултразвучног апарата помаже у спречавању термичке деградације узорка.
Након ултразвучне лизе, узорак се центрифугира да би се одвојили остаци пелета (који садрже нелизоване ћелије, језгра и нелизоване органеле)
Ако се узорак не обради одмах даље, може се чувати на одговарајућој температури да би се сачувала његова одрживост.

Ултрасоникатори за фрагментацију ДНК

Хиелсцхер Ултрасоницс нуди различите платформе засноване на ултразвуку за фрагментацију ДНК, РНК и хроматина. Ове различите платформе укључују ултразвучне сонде (сонотроде), решења за индиректну соникацију за истовремену припрему узорака више епрувета или плоча са више јажица (нпр. плоче са 96 бунара, микротитарске плоче), сонореакторе и ултразвучне чаше. Све платформе за смицање ДНК покрећу се фреквенцијски подешеним ултразвучним процесорима високих перформанси, који се могу прецизно контролисати и дају поновљиве резултате.

Ултразвучни процесори за било који број и величину узорка

With Hielscher’s multi-sample ultrasonicators VialTweeter (for up to 10 test tubes) and UIP400MTP (for microplates/ multiwell plates) it becomes easily possible to reduce sample processing time due to intense and precisely controllable ultrasonication whilst obtaining the desired DNA fragment size distribution and yield. Ultrasonic DNA fragmentation makes plasmid preparation steps efficient, reliable and scalable. Protocols can be linearly scaled from one to numerous samples by applying constant ultrasound parameters.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.