Припрема плазмида ултразвуком

Ултразвучна обрада је поуздана техника за фрагментацију плазмидне ДНК. Прецизно подесива амплитуда, пулсни режим рада и контрола температуре најважније су карактеристике ултразвучног уређаја за фрагментацију плазмида без оштећења. Поред тога, употреба одређених агенаса помаже у заштити плазмида од разградње. Hielscher Ultrasonics нуди различита решења за контролисану фрагментацију плазмида у појединачним бочицама, истовремену соникацију бројних узорака, као и обраду плоча са више бунарчића. Сазнајте више о успешној ултразвучној фрагментацији плазмида!

Смицање плазмида ултразвуком

Када се узорци ДНК изложе ултразвучним таласима, вибрације генерисане ултразвуком стварају акустичну кавитацију у течности, која механичким силама смиче или кида молекуле ДНК велике молекулске масе. Соникација је најчешће коришћена метода у експериментима смицања ДНК у маси, укључујући примене као што је имунопреципитација хроматина (ChIP), за које су мале величине фрагмената апсолутно неопходне за постизање високе резолуције. (уп. Tseng et al., 2012)
Плазмидна ДНК (pDNA) је специфичан облик ДНК који се одликује прстенастим обликом и налази се у бактеријама и неким еукариотима.
Суперспирализована pDNA је пожељан облик плазмидне ДНК јер даје најбоље резултате у наредним процесима, као што су аутоматизовано секвенцирање и трансфекција. Ултразвучна обрада је погодна за успешну фрагментацију pDNA, укључујући суперспирализовану pDNA.
Thompson et al. (2008) показали су да је соникација плазмида, за коју је познато да фрагментише суперспирализовану ДНК, ефикасан начин да се дужине очитавања секвенци са квалитетом phred20 побољшају до те мере да се не разликују значајно од оних добијених са контролном матрицом компаније Beckman Coulter или ензимски линеаризованим плазмидима.

Употреба плазмидних вектора

Плазмиди се често користе као алати за клонирање, пренос и манипулацију генима. Када се плазмиди експериментално користе у ове сврхе, називају се векторима. Фрагменти ДНК или гени могу се уметнути у плазмидни вектор, чиме настаје такозвани рекомбинантни плазмид. Плазмидни вектори се користе као носачи за уношење рекомбинантне ДНК у ћелију домаћина и представљају кључну компоненту молекулског клонирања.
„Невирусни вектори се интензивно проучавају због њихове потенцијалне употребе у генској терапији за лечење различитих сложених болести. Невирусни вектори штите плазмидну ДНК од физичке, хемијске и ензимске разградње и достављају молекул ДНК на циљно место. На пример, катјонски липозоми, хитозан и друге позитивно наелектрисане наночестице формирају комплексе са плазмидном ДНК путем електростатичких интеракција. Међутим, комплекси катјонских липозома и плазмидне ДНК, који се лако формирају, релативно су велики (тј. 300–400 nm) и по природи хетерогени, што отежава њихову употребу у фармацеутским применама. Велики и хетерогени комплекси плазмидне ДНК/липозома, плазмидне ДНК/аеросола и плазмидне ДНК/пептида могу се ултразвучном обрадом уситнити у мање, хомогене честице.“ (Sarker et al., 2019)
Истакнут пример употребе плазмидних вектора је CRISPR–Cas9. Систем CRISPR–Cas9 се обично уноси у ћелије у облику једног великог плазмида или више мањих плазмида који кодирају циљну секвенцу, водич за CRISPR и Cas9.

Ултразвучна припрема наночестица PLGA напуњених ДНК путем нанопреципитације

Jo et al. (2020) користили су поли(млечну-ко-гликолну киселину) (PLGA) за формирање наночестичног носача за достављање моделског плазмида CRISPR–Cas9 у примарне макрофаге пореклом из коштане сржи. За нанопреципитацију наночестица PLGA коришћен је PLGA са две различите завршне групе (естарским и аминским групама), са циљем да позитивно наелектрисане завршне аминске групе повећају ефикасност инкапсулације и степен пуњења услед електростатичких интеракција између њих и негативно наелектрисане окоснице ДНК. У полипропиленској конусној епрувети за центрифугирање од 50 mL, 100 mg Pluronic F127 растворено је у 20 mL аутоклавиране дејонизоване воде вортекс мешањем, након чега је уследило 30 min благе соникације у ултразвучном купатилу (видети CupHorn). Додат је аутоклавирани магнетни штапић за мешање, а раствор је мешан при 600 RPM током 30 min док су припремани остали раствори. Током целог поступка коришћен је пластични лабораторијски прибор уместо стакленог како би се неспецифична адсорпција ДНК свела на минимум. Одвојено су припремљени раствори PLGA у DMF (44,48 mg/ ml) и TIPS пентацена у THF (0,667 mg/ml). PLGA је остављен да мирује у DMF током 30 min ради квашења, пре соникације у трајању од 30 min. (за комплетан протокол видети Jo et al., 2020)

Заштита плазмидне ДНК током соникације

ДНК, укључујући плазмиде и суперспирализоване плазмиде, веома је подложна деградацији. Познато је да све доступне методе фрагментације имају одређене недостатке. Ултразвучна фрагментација ДНК једна је од пожељних метода јер контролисана соникација у комбинацији са заштитним мерама омогућава смањење оштећења ланаца ДНК изазваних смицањем и топлотом.
Поред подешавања ниске амплитуде, пулсног режима рада и контроле температуре током ултразвучног смицања ДНК, употреба одређених агенаса показала је значајан заштитни ефекат против деградације ДНК. На пример, различити полимери, пептиди и липиди штите плазмидну ДНК током ултразвучне обраде.

Стабилност плазмидне ДНК и нанокомплекса плазмидне ДНК/IL при излагању ултразвучном смицајном напрезању испитивана је електрофорезом у агарозном гелу. И плазмидна ДНК и нанокомплекси плазмидне ДНК/IL излагани су ултразвучном смицајном напрезању током различитих временских периода. Плазмидна ДНК била је изложена ултразвучном смицајном напрезању током 0, 10, 20, 30 и 40 минута. Међутим, нанокомплекси плазмидне ДНК/IL били су изложени ултразвучном смицајном напрезању током 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минута.
(студија и слика: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) показали су да је, када су наноструктуре плазмидне ДНК / јонске течности (pDNA/IL) биле изложене ултразвучном смицајном напрезању током 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 min и комплексиране са комерцијално доступним катјонским агенсом за достављање гена, липофектамином, проценат флуоресцентно позитивних ћелија износио 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% и 50%, редом (видети графикон испод). Проценат флуоресцентно позитивних ћелија повећао се када су наноструктуре биле изложене ултразвучном смицајном напрезању током 10 и 20 min, а затим се полако смањивао.

Утицај јонске течности [Bmim][PF6] на достављање плазмидне ДНК у ћелије COS7. Нанокомплекси плазмидне ДНК/IL (јонска течност) били су изложени ултразвучном смицајном напрезању до 120 минута и комплексирани са LA пре достављања у ћелије COS7. Подаци показују просечан број (%) GFP позитивних ћелија HeLa избројаних у 10 различитих микроскопских видних поља, а експеримент је изведен више пута током три различита дана. (Студија и графикон: ©Sarker et al., 2019)

Ултразвучна припрема лизата

Протокол за ултразвучну лизу ћелија
Почните са обогаћеним узорком ћелија припремљеним методом раздвајања ћелија (нпр. имуномагнетним раздвајањем ћелија, сортирањем ћелија активираним флуоресценцијом (FACS), центрифугирањем у градијенту густине, имунодензитетском изолацијом ћелија).
Узорци ћелија морају садржати запремину пуфера за лизу која одговара циљу експеримента и ултразвучном уређају са сондом.
Предност се даје хипотоничним пуферима јер побољшавају ултразвучну лизу ћелија. Важно је да се адитиви и концентрација соли користе на одговарајући начин.
Изаберите уређај за ултразвучну лизу: За индиректну соникацију бочица препоручују се VialTweeter или CupHorn. За плоче са више бунарчића, UIP400MTP је идеалан ултразвучни уређај. За класичну соникацију сондом најпогоднији су ултразвучни хомогенизатори као што су UP100H или UP200Ht са микроврхом.
Протокол за соникацију сондом: Уроните сонду ултразвучног уређаја у узорак у микроцентрифужној епрувети и соницирајте приближно 10 секунди. У зависности од узорка ДНК, соникација се може поновити још једном или два пута. Потребан унос ултразвучне енергије (Ws/mL) зависи од вискозности узорка и типа ДНК. Хлађење у леденом купатилу и пулсни режим рада ултразвучног уређаја помажу у спречавању термичке разградње узорка.
Након ултразвучне лизе, узорак се центрифугира ради издвајања остатака у талогу (који садржи нелизиране ћелије, једра и нелизиране органеле)
Ако се узорак одмах не обрађује даље, може се чувати на одговарајућој температури ради очувања његове вијабилности.

Ултразвучни уређаји за фрагментацију ДНК

Hielscher Ultrasonics нуди различите платформе засноване на ултразвуку за фрагментацију ДНК, РНК и хроматина. Ове различите платформе обухватају ултразвучне сонде (сонотроде), решења за индиректну соникацију ради истовремене припреме узорака у више епрувета или плоча са више бунарчића (нпр. плоче са 96 бунарчића, микротитарске плоче), сонореакторе и ултразвучне чашасте сонде. Све платформе за смицање ДНК покрећу ултразвучни процесори високих перформанси са подешеном фреквенцијом, који омогућавају прецизну контролу и дају поновљиве резултате.

Ултразвучни процесори за било који број и величину узорака

Уз Hielscher ултразвучне уређаје за више узорака VialTweeter (за до 10 епрувета) и UIP400MTP (за микроплоче/ плоче са више бунарчића), лако је скратити време обраде узорака захваљујући интензивној соникацији која се може прецизно контролисати, уз истовремено постизање жељене расподеле величина фрагмената ДНК и приноса. Ултразвучна фрагментација ДНК чини кораке припреме плазмида ефикасним, поузданим и скалабилним. Протоколи се могу линеарно скалирати са једног на велики број узорака применом константних параметара ултразвука.
Ултразвучни уређаји са сондом са једним до пет прстију идеални су за припрему мањег броја узорака. Hielscher лабораторијски ултразвучни уређаји доступни су са различитим нивоима снаге, тако да можете изабрати идеалан ултразвучни дезинтегратор за своју примену у вези са ДНК.