Hielscher Ultrasonics
Биће нам драго да разговарамо о вашем процесу.
Позовите нас: +49 3328 437-420
Пошаљите нам е-пошту: info@hielscher.com

Припрема плазмида уз помоћ ултразвука

Ултразвук је поуздана техника за фрагментацију плазмидне ДНК. Прецизно контролисана амплитуда, режим пулсирања и контрола температуре су најважније карактеристике ултразвучног апарата за неоштећујућу фрагментацију плазмида. Поред тога, употреба одређених агенаса помаже у заштити од разградње плазмида. Хиелсцхер Ултрасоницс нуди различита решења за контролисану фрагментацију плазмида из појединачних бочица, истовремено ултразвучну обраду бројних узорака као и плоча са више јажица. Сазнајте више о успешној ултразвучној фрагментацији плазмида!

Захтев за информацијама




Обратите пажњу на наше правила о приватности.




Ултразвучна фрагментација ДНК је поуздана и ефикасна техника која се обично користи у секвенцирању следеће генерације (НГС)

УИП400МТП омогућава прецизно контролисану ултразвучну обраду плоча са више бунара. Једна од примена УИП400МТП је фрагментација плазмидне ДНК како би се добили фрагменти специфично циљане дужине.

Смицање плазмида помоћу ултразвука

Када су узорци ДНК подвргнути ултразвучним таласима, ултразвучно генерисане вибрације стварају акустичну кавитацију у течности која шиша или разбија молекуле ДНК високе молекуларне тежине путем механичких сила. Соникација је најчешће коришћена метода за експерименте са смицањем ДНК, укључујући апликације, као што је хроматинска имунопреципитација (ЦхИП), за коју су мале величине фрагмената апсолутно кључне за добијање високе резолуције. (уп. Тсенг ет ал., 2012)
Плазмидна ДНК (пДНК) је специфична форма ДНК, коју карактерише њен прстенасти облик и налази се у бактеријама и неким еукариотима.
Суперцоилед пДНК је жељени облик плазмидне ДНК јер показује најбоље резултате у низводним процесима као што су аутоматизовано секвенцирање и трансфекција. Ултразвучна обрада је погодна за успешно фрагментирање пДНК, укључујући супернамотану пДНК.
Thompson et al. (2008) demonstrated that plasmid sonication, which is known to fragment supercoiled DNA, is an effective way to improve sequence phred20 read lengths to the point that they are not significantly different from Beckman Coulter’s control template or enzymatically linearized plasmids.

Предности ултразвучне фрагментације ДНК

  • прецизно контролисан
  • Поновљиви резултати
  • Подесива дужинама ДНК фрагмента
  • контрола температуре
  • Скалабилност на било коју величину узорка
Видео приказује ултразвучни систем за припрему узорака УИП400МТП, који омогућава поуздану припрему узорака било које стандардне плоче са више јажица коришћењем ултразвука високог интензитета. Типичне примене УИП400МТП укључују лизу ћелија, ДНК, РНК и смицање хроматина, као и екстракцију протеина.

Ултрасоникатор УИП400МТП за ултразвучну обраду плоча са више бунара

Видео Тхумбнаил

Употреба плазмидних вектора

Плазмиди се често користе као алати за клонирање, трансфер и манипулисање генима. Када се плазмиди експериментално користе у ове сврхе, они се називају вектори. ДНК фрагменти или гени се могу убацити у плазмидни вектор, стварајући такозвани рекомбинантни плазмид. Плазмидни вектори се користе као носачи за покретање рекомбинантне ДНК у ћелију домаћина и кључна су компонента молекуларног клонирања.
“Невирусни вектори се опсежно проучавају за њихову потенцијалну употребу у генској терапији за лечење различитих компликованих болести. Невирусни вектори штите плазмидну ДНК од физичке, хемијске и ензимске деградације и испоручују молекул ДНК на циљно место. На пример, катјонски липозоми, хитозан и друге позитивно наелектрисане наночестице формирају комплексе са плазмидном ДНК путем електростатичких интеракција. Међутим, лако формирани комплекси катјонских липозома/плазмидних ДНК су релативно велики (тј. 300–400 нм) и хетерогени по природи што их чини тешким за употребу у фармацеутским апликацијама. Велики и хетерогени плазмид ДНК/липозоми, плазмид ДНК/аеросоли и плазмид ДНК/пептиди комплекси могу се редуцирати на мање и хомогене честице коришћењем ултразвучне обраде.” (Саркер ет ал., 2019)
Истакнути пример за употребу плазмидних вектора је ЦРИСПР-Цас9. ЦРИСПР-Цас9 систем се обично испоручује ћелијама као један велики плазмид или више мањих плазмида који кодирају циљну секвенцу, ЦРИСПР водич и Цас9.

Ултразвучна припрема ПЛГА наночестица напуњених ДНК нанопреципитацијом

Јо ет ал. (2020) користили су поли(млечну-ко-гликолну киселину) (ПЛГА) да би формирали носач наночестица за испоруку модела ЦРИСПР-Цас9 плазмида у макрофаге добијене из примарне коштане сржи. За нанопреципитацију ПЛГА наночестица, ПЛГА са две различите крајње групе (естарске и аминске групе) коришћене су са циљем да позитивно наелектрисане крајње капице амина повећају ефикасност инкапсулације и оптерећење услед интеракције наелектрисања између њега и негативно наелектрисане кичме ДНК. У полипропиленској конусној центрифугалној епрувети од 50 мЛ, 100 мг Плурониц Ф127 је растворено у 20 мЛ аутоклавиране ДИ воде мешањем вортексом након чега је уследило 30 минута нежне соникације помоћу ултразвучног купатила (види ЦупХорн). Додата је аутоклавирана магнетна мешалица и раствор је мешан на 600 РПМ током 30 мин док су остали раствори направљени. Пластични лабораторијски прибор је коришћен уместо стакленог посуђа да би се минимизирала неспецифична адсорпција ДНК. Посебно су направљени раствори ПЛГА раствореног у ДМФ (44,48 мг/мл) и ТИПС пентацена раствореног у ТХФ (0,667 мг/мл). ПЛГА је остављен мирно да се влажи у ДМФ-у 30 минута пре него што је 30 минута соникиран. (за цео протокол видети Јо ет ал., 2020)

Повезане апликације:

  • Екстракција ДНК
  • Инкапсулација ДНК
  • Дисперзија ДНК обложене наночестицама
  • Достава плазмидне ДНК у ћелије
УП200Ст ТД_ЦупХорн за индиректну соникацију узорака

УП200Ст ЦупХорн за индиректну соникацију узорака, нпр. за екстракцију и фрагментацију ДНК.

Захтев за информацијама




Обратите пажњу на наше правила о приватности.




Заштита плазмидне ДНК током ултразвука

ДНК укључујући плазмиде и суперсмотане плазмиде су веома осетљиве на деградацију. Све доступне методе фрагментације познате су по одређеним недостацима. Ултразвучна фрагментација ДНК је једна од пожељних метода пошто контролисана соникација у комбинацији са заштитним мерама омогућава да се смањи оштећење ланаца ДНК изазвано смицањем и топлотом.
Поред подешавања ниске амплитуде, режима пулсирања и контроле температуре током ултразвучног смицања ДНК, употреба одређених агенаса показала је значајан заштитни ефекат против деградације ДНК. На пример, различити полимери, пептиди и липиди штите плазмидну ДНК током ултразвучне обраде.

Јонске течности могу заштитити плазмидну ДНК од оштећења током соникације.

Стабилност плазмидне ДНК и нанокомплекса плазмидне ДНК/ИЛ на ултразвучни смичући стрес је испитивана помоћу есеја електрофорезе на агарозном гелу. И плазмидна ДНК и плазмидна ДНК/ИЛ нанокомплекси су били подвргнути ултразвучном напону смицања у различитим временским тачкама. Плазмидна ДНК је била изложена ултразвучном напону смицања 0, 10, 20, 30 и 40 минута. Међутим, плазмидни ДНК/ИЛ нанокомплекси су били изложени ултразвучном смичном напрезању током 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минута.(студија и слика: ©Саркер ет ал., 2019)

Саркер ет ал. (2019) су показали да када су наноструктуре плазмидне ДНК/јонске течности (пДНА/ИЛ) биле подвргнуте ултразвучном смичном напрезању у трајању од 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минута и комплексирале са комерцијално доступним катјонским геном агенса за испоруку липофектамина, проценат флуоресцентних позитивних ћелија био је 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% и 50%, респективно (види табелу испод). Проценат флуоресцентних позитивних ћелија се повећао када су наноструктуре биле подвргнуте ултразвучном смичном напрезању током 10 и 20 минута, а затим се полако смањивао.

Ултразвучна фрагментација плазмидне ДНК

Утицај јонске течности [Бмим][ПФ6] на испоруку плазмидне ДНК до ЦОС7 ћелија. Нанокомплекси плазмидне ДНК/ИЛ (јонске течности) подвргнути су ултразвучном напону смицања до 120 минута и комплексирани са ЛА пре него што су испоручени у ћелије ЦОС7. Подаци показују просечан број (%) ГФП позитивних ХеЛа ћелија избројаних у 10 различитих микроскопских поља и експеримент је изведен више пута у три различита дана. (Студија и графикон: ©Саркер ет ал., 2019)

Плазмидна ДНК се може заштитити додавањем агенса пре ултразвучне фрагментације.

Плазмидна ДНК се може заштитити додавањем агенса пре ултразвучне фрагментације: Соникацијом изазвана деградација голе пДНК (А) и пДНК формулисане са 1,5 мМ ЦаЦл2 и 20 % (в/в) т-бутанола (Б)Узорци су обрађени сондом од 20В сондом до 120с, као што је назначено на врху сваке траке. Трака Х одговара маркеру Хиперладдер И™. ОЦ и СЦ плазмидне траке су назначене.(студија и слике: ©Ву ет ал., 2009)

Ултразвучна припрема лизата

Протокол ултразвучне лизе ћелија
Ултрасоникатор УП200Хт са микроврхом С26д2 за ултразвучну лизу биолошких узоракаПочните са обогаћеним узорком ћелија који је припремљен методом сепарације ћелија (нпр. имуномагнетна сепарација ћелија, флуоресцентно активирано сортирање ћелија (ФАЦС), центрифугирање у градијенту густине, изолација ћелија имуногустине).
Узорци ћелија морају показати запремину пуфера за лизу која је одговарајућа за експериментални циљ и ултрасоникатор типа сонде.
Пожељни су хипотонични пуфери јер појачавају ултразвучну лизу ћелија. Важно је да се адитиви и концентрација соли користе на одговарајући начин.
Изаберите свој ултразвучни уређај за лизу: За индиректну соникацију бочица препоручује се ВиалТвеетер или ЦупХорн. За плоче са више јажица, УИП400МТП је идеалан ултрасоникатор. И класична соникација типа сонде, ултразвучни хомогенизатор као што је УП100Х или УП200Хт са микро врхом су најпогоднији.
Протокол за соникацију типа сонде: Поставите сонду за ултразвук у запремину узорка у епрувету за микроцентрифугу и соницирајте прибл. 10 секунди. У зависности од узорка ДНК, соникација се може поновити још једном или два пута. Потребан унос ултразвучне енергије (Вс/мЛ) зависи од вискозитета узорка и типа ДНК. Хлађење преко ледене купке и режима пулсирања ултразвучног апарата помаже у спречавању термичке деградације узорка.
Након ултразвучне лизе, узорак се центрифугира да би се одвојили остаци пелета (који садрже нелизоване ћелије, језгра и нелизоване органеле)
Ако се узорак не обради одмах даље, може се чувати на одговарајућој температури да би се сачувала његова одрживост.

Ултрасоникатори за фрагментацију ДНК

Хиелсцхер Ултрасоницс нуди различите платформе засноване на ултразвуку за фрагментацију ДНК, РНК и хроматина. Ове различите платформе укључују ултразвучне сонде (сонотроде), решења за индиректну соникацију за истовремену припрему узорака више епрувета или плоча са више јажица (нпр. плоче са 96 бунара, микротитарске плоче), сонореакторе и ултразвучне чаше. Све платформе за смицање ДНК покрећу се фреквенцијски подешеним ултразвучним процесорима високих перформанси, који се могу прецизно контролисати и дају поновљиве резултате.

Ултразвучни процесори за било који број и величину узорка

With Hielscher’s multi-sample ultrasonicators VialTweeter (for up to 10 test tubes) and UIP400MTP (for microplates/ multiwell plates) it becomes easily possible to reduce sample processing time due to intense and precisely controllable ultrasonication whilst obtaining the desired DNA fragment size distribution and yield. Ultrasonic DNA fragmentation makes plasmid preparation steps efficient, reliable and scalable. Protocols can be linearly scaled from one to numerous samples by applying constant ultrasound parameters.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

ВиалТвеетер је МултиСампле Ултрасоницатор који омогућава поуздану припрему узорка под прецизно контролисаним температурним условима.

Ултразвучна јединица за припрему више узорака ВиалТвеетер омогућава истовремену соникацију до 10 бочица. Са уређајем за причвршћивање ВиалПресс, до 4 додатне цеви се могу притиснути напред за интензивну соникацију.

прецизна контрола процеса

Хиелсцхер ултрасоницатори се могу даљински контролисати преко контроле претраживача. Параметри соникације се могу пратити и прецизно прилагодити захтевима процеса.Precisely controllable sonication settings are crucial since exhaustive sonification can destroy DNA, RNA and chromatin, but inadequate ultrasonic shearing results in too long DNA and chromatin fragments. Hielscher’s digital ultrasonicators can be easily set to precise sonication parameter. Specific sonication settings can be also saved as programmed setting for fast repetition of the same procedure.
Сва соникација се аутоматски протоколира и чува као ЦСВ датотека на уграђеној СД картици. Ово омогућава прецизну документацију изведених испитивања и омогућава лаку ревизију соникационих извођења.
Преко даљинског управљача претраживача, свим дигиталним ултразвучним апаратима се може управљати и надгледати преко било ког стандардног претраживача. Инсталација додатног софтвера није потребна, пошто је ЛАН веза врло једноставно плуг-н-плаи подешавање.

Највећа лакоћа за коришћење током ултразвучне ДНК припреме

Сви Хиелсцхер ултрасоникатори су дизајнирани да испоруче ултразвук високих перформанси, док су у исто време увек веома лаки за употребу и лаки за руковање. Сва подешавања су добро структурирана у јасном менију, коме се лако може приступити преко обојеног екрана на додир или даљинског управљача претраживача. Паметни софтвер са програмибилним подешавањима и аутоматским снимањем података обезбеђује оптималне поставке соникације за поуздане и поновљиве резултате. Чист и једноставан за коришћење интерфејс менија претвара Хиелсцхер ултрасоникаторе у лаке и ефикасне уређаје.
Табела испод даје вам индикацију приближног капацитета обраде наших лабораторијских ултразвучних апарата за лизу ћелија и фрагментацију ДНК:

Батцх Волуме Проток Препоручени уређаји
плоче са више бунара н/а УИП400МТП
бочице, мала чаша н/а Ултрасониц ЦупХорн
до 10 бочица н/а ВиалТвеетер
1 до 500 мл 10 до 200 мл/мин УП100Х
10 до 2000 мл 20 до 400 мл/мин УП200Хт, УП400Ст

Контактирајте нас!? Питајте нас!

Питајте за више информација

Молимо користите образац испод да затражите додатне информације о ултразвучним хомогенизаторима за екстракцију и фрагментацију ДНК, протоколима примене и ценама. Биће нам драго да разговарамо о вашем процесу са вама и да вам понудимо ултразвучни систем који испуњава ваше захтеве!









Обратите пажњу на наше правила о приватности.






Литература? Референце

Чињенице које вреди знати

Шта су плазмиди?
Плазмид је мали кружни молекул ДНК који је физички одвојен од хромозомске ДНК и реплицира се независно. Плазмиди су често повезани са генима који доприносе опстанку организма и дају специфичне предности, нпр. отпорност на антибиотике. Плазмиди се најчешће налазе као мали кружни, дволанчани молекули ДНК у бактеријама; међутим, плазмиди су понекад присутни у архејама и еукариотским организмима. Плазмиди су важна оруђа у молекуларној биологији, генетици, биохемији и науци о животу. Познати као вектори у генетском инжењерингу, плазмиди се користе за реплицирање или експресију одређених гена. Циљана промена вектора се назива дизајн вектора.

ГФП анализа у истраживању ћелија
Зелени флуоресцентни протеин (ГФП) је свестрани биолошки маркер за праћење физиолошких процеса, визуелизацију локализације протеина и откривање трансгене експресије ин виво. ГФП може бити узбуђен ласерском линијом од 488 нм и оптимално се детектује на 510 нм.


Ултразвук високих перформанси! Хиелсцхеров асортиман производа покрива читав спектар од компактног лабораторијског ултразвучног апарата преко стоних уређаја до потпуно индустријских ултразвучних система.

Хиелсцхер Ултрасоницс производи ултразвучне хомогенизаторе високих перформанси од лаб до индустријска величина.

Биће нам драго да разговарамо о вашем процесу.

Let's get in contact.