Ултразвучна припрема узорака за ELISA тестове

Тестови као што је ELISA широко се користе за in vitro дијагностику, детекцију протеина повезаних са болестима и контролу квалитета (нпр. праћење алергена у храни). Ултразвучна припрема узорака је брза, поуздана и репродуктивна техника за лизу ћелија и изоловање унутарћелијских протеина, ДНК, РНК и органела. Hielscher Ultrasonics нуди различита ултразвучна решења за једноставну припрему појединачних узорака, више бочица, као и микротитарских плоча и плоча са 96 бунарчића.

ELISA – имуносорбентни тест са везаним ензимом

ELISA је скраћеница за имуносорбентни тест са везаним ензимом и представља широко коришћену технику биохемијске анализе из категорије тестова везивања лиганда. У ELISA тесту, течни узорак се додаје на стационарну чврсту фазу са посебним својствима везивања. Стационарна чврста фаза обично се наноси као превлака на плочу са бунарчићима или ELISA плочу. Затим се различити течни реагенси редом додају, инкубирају и испирају, тако да на крају у преосталој течности у бунарчићу долази до оптичке промене (нпр. развоја боје услед настанка производа ензимске реакције). Оптичка промена омогућава мерење количине аналита такозваним квантитативним „очитавањем“. За квантитативно очитавање користи се спектрофотометар, флуорометар или луминометар ради детекције и мерења интензитета пропуштене светлости. На осетљивост детекције утиче појачавање сигнала током аналитичких реакција. Пошто су ензимске реакције добро проучени и поуздани процеси појачавања, ензими се користе за стварање сигнала. Ензими су везани за реагенсе за детекцију у фиксним односима како би се омогућила прецизна квантификација, што објашњава и назив имуносорбентни тест „са везаним ензимом“.
Пошто се ELISA тестови изводе у микротитарским плочама / плочама са 96 бунарчића, ова техника је позната као техника тестирања на плочама и користи се, на пример, у клиничкој in vitro дијагностици, истраживању, развоју лекова итд. за детекцију и квантификацију антитела, пептида, протеина и хормона.
ELISA техника се често користи као дијагностичко средство у медицини, биотехнологији и фитопатологији, а представља и важно мерење у контроли квалитета у више индустријских грана.

Ултразвучна припрема узорака пре ELISA теста

Пре извођења ELISA теста, узорци захтевају припремне кораке као што су лиза ћелија и екстракција унутарћелијских протеина, ДНК, РНК итд. Предност ултразвучне лизе ћелија и изоловања протеина јесте висока ефикасност, поузданост и репродуктивност. Сви ови фактори су важни за добијање висококвалитетних дијагностичких и истраживачких резултата

Протокол за ултразвучну лизу ћелија пре ELISA теста

• За ћелијске културе: Пре ултразвучне лизе ћелија, центрифугирајте ћелије 5 минута при 270 x g у микроцентрифуги. Уклоните супернатант аспирацијом и ресуспендујте ћелије у 30 – 100 μL RIPA пуфера. Затим инкубирајте ћелијски талог на леду 30 min.
• Сада је узорак ћелија спреман за ултразвучну лизу:
  Користите ултразвучни уређај са сондом (нпр. UP200Ht са сондом S26d2) или ултразвучни уређај за више узорака (нпр. VialTweeter за истовремену соникацију до 10 бочица или UIP400MPT за микротитарске плоче / плоче са 96 бунарчића), у зависности од броја узорака које треба да припремите.
  За соникацију појединачног узорка помоћу сонде, ставите ћелије у микроцентрифужне епрувете од 1,5 mL.
• Унапред подесите трајање ултразвучне обраде, укупан унос енергије, режим циклуса и/или температурне границе у дигиталном менију ултразвучног уређаја. То обезбеђује високу поузданост соникације и поновљивост.
• Уметните сонотроду и укључите ултразвучни уређај. Лагано померајте микроврх ултразвучне сонде кроз узорак да бисте га равномерно обрадили ултразвуком.
  Код већине ћелија ултразвучна лиза ће бити завршена након 2–4 циклуса ултразвучне обраде у трајању од по 10 sec.
• Након ултразвучне обраде извадите сонотроду из узорка. Узорке треба инкубирати на леду 5 min. Затим центрифугирајте при 10.000 x g током 20 min да би се ћелијски остаци исталожили. Пренесите супернатанте у нову микроцентрифужну епрувету. Обележите аналите и чувајте их на -20°C.
• Ултразвучна сонотрода може се очистити темељним брисањем алкохолом или ултразвучном обрадом у лабораторијској чаши напуњеној алкохолом, нпр. 70% етанолом. Све ултразвучне сонде израђене од титанијума могу се стерилисати у аутоклаву.

• Исперите ткиво леденохладним PBS (0,01M, pH=7,4) да бисте темељно уклонили вишак хемолизоване крви.
• Измерите масу ткива (бубрег, срце, плућа, слезина итд.) и мацерирајте га на ситне комаде, који се хомогенизују у PBS. Потребна запремина PBS зависи од масе ткива. По правилу, за 1g ткива потребно је приближно 9mL PBS. Препоручује се додавање инхибитора протеаза у PBS. (Алтернативно се може користити RIPA или хипотонични пуфер за лизу који садржи коктел инхибитора протеаза и фосфатаза.)
• У зависности од величине ткива, кратка обрада вортекс мешалицом (приближно 1–2 min. у импулсима од 15 sec.) може бити корисна за претходну обраду ткива.
• Поставите микроврх, нпр. S26d2, на ултразвучни уређај. Ставите епрувету са узорком ткива у ледено купатило.
• Обрађујте узорак ултразвучним уређајем, нпр. UP200St (80% амплитуде), током 1 min. у импулсном режиму (15sec рада, 15sec паузе). Држите узорак у леденом купатилу.
• Хомогенати се затим центрифугирају како би се добиле специфичне фракције (цитосолна, нуклеарна, митохондријска или лизозомска) ради обогаћивања протеина за анализу. Центрифугирањем узорка током 5 минута при 5000×g добија се супернатант.

Поуздана контрола температуре током ултразвучне обраде

Температура је пресудан фактор који утиче на процес и посебно је важан при обради биолошких узорака, нпр. за спречавање термичке разградње протеина. Као и све механичке технике припреме узорака, ултразвучна обрада ствара топлоту. Међутим, температура узорака може се добро контролисати када се користе уређаји Hielscher Ultrasonics. Представљамо вам различите могућности праћења и контроле температуре узорака током њихове преаналитичке припреме ултразвучним уређајем са сондом или уређајем VialTweeter.

1. Праћење температуре узорка: Сви дигитални ултразвучни процесори Hielscher опремљени су интелигентним софтвером и прикључивим температурним сензором. Прикључите температурни сензор на ултразвучни уређај (нпр., UP200Ht, UP200St, VialTweeter, ултразвучни уређај UIP400MTP за плоче са више бунарчића) и уметните врх температурног сензора у једну од епрувета са узорцима. Преко дигиталног екрана у боји осетљивог на додир можете у менију ултразвучног процесора подесити одређени температурни опсег за ултразвучну обраду узорка. Ултразвучни уређај ће се аутоматски зауставити када се достигне максимална температура и паузирати док температура узорка не падне на доњу вредност подешеног температурног опсега ∆. Затим се ултразвучна обрада аутоматски поново покреће. Ова паметна функција спречава разградњу изазвану топлотом.
2. Код ултразвучног уређаја VialTweeter за обраду више узорака, титанијумски блок који држи епрувете са узорцима може се претходно охладити. Ставите блок VialTweeter (само сонотроду без претварача!) у фрижидер или замрзивач да бисте претходно охладили титанијумски блок и тако одложили пораст температуре у узорку. Ако је могуће, и сам узорак може се претходно охладити.
3. Користите ледено купатило или суви лед за хлађење током соникације. Током соникације поставите епрувету или епрувете са узорцима у ледено купатило. За VialTweeter користите плитку посуду напуњену сувим ледом и поставите VialTweeter на суви лед како би се топлота могла брзо одводити.

Корисници широм света користе Hielscher ултразвучне уређаје са сондом, као и уређаје за соникацију више узорака VialTweeter и UIP400MTP, за свакодневну припрему узорака у биолошким, биохемијским, медицинским и клиничким лабораторијама. Захваљујући интелигентном софтверу и контроли температуре Hielscher процесора, температура се поуздано контролише и избегава се разградња узорака изазвана топлотом. Ултразвучна припрема узорака помоћу Hielscher ултразвучних решења даје веома поуздане и поновљиве резултате!
Прочитајте више о соникацији великог броја узорака помоћу уређаја UIP400MTP за соникацију плоча са више бунарчића за тестове!