Asays kao što je ELISA se široko koristi za in-vitro dijagnostiku, otkrivanje proteina povezanih sa bolestima i kontrolu kvaliteta (npr. praćenje alergena u hrani). Ultrazvučni preparat uzorka je brza, pouzdana i reproduktivna tehnika za lisiranje ćelija i izolaciju intracelularnih proteina, DNK, RNK i organela. Hielscher Ultrasonics nudi razna ultrazvučna rešenja za prigodnu pripremu pojedinačnih uzoraka, više bočica kao i za mikrotiter ploče i 96-bunarske ploče.

Elisu – Enzim-Povezani imunosorbet asay

ELISA označava imunosorbatski napad povezan sa enzimom i široko je korišćena tehnika biohemijske analize kategorije asaja vezivanja ligande. U ELISA-i, tečni uzorak se dodaje u stacionarnu solidnu fazu sa posebnim obavezujućim svojstvima. Obično se stacionarna čvrsta faza nanosi kao premaz na bunar ili ELISA ploču. Zatim se razni tečni reagensi sekvencijalno dodaju, inkubišu i peru, tako da se konačno dolazi do optičke promene (npr. razvoja boje po proizvodu enzimske reakcije) u konačnoj tečnosti u bunaru. Optička promena omogućava merenje količine analitičkog po takozvanoj kvantitativnoj “čitanje". Za kvantitativno očitavanje koristi se spektrofotometar, fluorometar ili luminometar za otkrivanje i merenje intenziteta prenete svetlosti. Na osetljivost detekcije utiče pojačavanje signala tokom analitičkih reakcija. Pošto su enzimske reakcije dobro istražene i pouzdani procesi pojačavanja, enzimi se koriste za kreiranje signala. Enzimi su povezani sa reagensima detekcije u fiksnim proporcijama kako bi se omogućila tačna kvantifikacija, što objašnjava i ime "imunosorbazni napad povezan sa enzimom".
Kako se ELISA asays izvodi u mikrotiterskim pločama / 96-well pločama, poznata je kao asay tehnika na bazi ploče i koristi se npr. u kliničkoj in-vitro dijagnostici, istraživanjima, razvoju droge itd. za otkrivanje i kvantifikaciju antitela, peptida, proteina i hormona.
ELISA tehnika se često koristi kao dijagnostičko sredstvo u medicini, biotehnologiji, patologiji biljaka i takođe je važno merenje kontrole kvaliteta u više industrija.

Ultrazvučni uzorak pripreme pre ELISA

Pre nego što elisa asay može da se izvrši, uzorci zahtevaju korake pripreme takve ćelijske lize i vađenje intracelularnih proteina, DNK, RNK itd. Prednost ultrazvučne ćelijske lize i izolacije proteina je njena visoka efikasnost, pouzdanost i reproduktivnost. Svi ovi faktori su važni da bi se dobila visokokvalitetna dijagnostika i rezultati istraživanja

Protokol za Pre-ELISA Ultrazvučnu ćeliju Lysis

• Za ćelijske kulture: Pre ultrazvučne ćelijske lize, centrifuge ćelije na 5 min na 270 x g u mikrocentrifugi. Uklonite supernatant aspiracijom i ponovo dodajte ćelije u 30 – 100 μL RIPA bafera. Zatim inkubijte ćelijski kuglicu na ledu 30 min.
• Uzorak ćelije je spreman za ultrazvučnu lizu:
  Koristite ultrazvučni tip sonde (npr. УП200Хт sa S26d2 sondom) ili ultrazvučnim uređajem sa više uzoraka (npr. VialTweeter za istovremenu soniciju do 10 bočica ili UIP400MPT za mikrotiter ploče / 96-bunarske ploče) u zavisnosti od količine uzoraka koje treba da pripremite.
  Za sonikaciju tipa sonication of a single sample, postavite ćelije u 1,5 mL mikrocentrifuge cevi.
• Unapred podesite ultrazvučno trajanje, ukupan unos energije, režim ciklusa i/ili ograničenje temperature u digitalnom meniju ultrazvuka. Ovo osigurava veoma pouzdanu soniaciju i ponavljanje.
• Inset sonotrode i uključite ultrazvučni uređaj. Nežno pomerite mikro vrh ultrazvučne sonde kroz uzorak da ravnomerno sonicira uzorak.
  Za većinu ćelija ultrazvučna liza će biti završena nakon 2 -4 ciklusa od 10 sec sonication.
• Nakon sonicationa, uklonite sonotrode iz uzorka. Uzorci bi trebalo da budu inkubirani na ledu 5 min. Zatim, centrifugu na 10.000 x g za 20 min da kugla ostatke. Prebacite supernatanse u novu mikrocentrifuge cev. Označite analite i uskladištite na -20°C.
• Ultrazvučna sonotroda se može očistiti tako što ćete je pravilno očistiti alkoholom ili sonicitom u beakeru napunjenom alkoholom, npr. 70% etanola. Sve ultrazvučne sonde napravljene od titanijuma su autoklave.

• Isperite tkivo ledenim PBS-om (0,01M, pH=7,4) da biste detaljno uklonili višak krvi hemolize.
• Izmerite tkivo (bubreg, srce, pluća, slezinu itd.) i isecite ga na sitne komadiće, koji su homogenizovani u PBS-u. Potrebna zapremina PBS-a je povezana sa težinom tkiva. Po pravilu palca, 1g tkiva zahteva oko 9mL PBS. Preporučuje se dodavanje nekog inhibitora proteasa u PBS. (RIPA ili bafer hipotonske lize koji sadrži koktel inhibitora proteaze i fosfataze može se koristiti alternativno.)
• U zavisnosti od veličine tkiva, kratak tretman vrtloga (oko 1-2 min. u 15 sek. pulsa) može biti od pomoći za predčinjenje tkiva.
• Postavite mikro-savet, npr. S26d2, na ultrazvučnik. Stavite uzorak cevi sa tkivom u ledenu kupku.
• Sonicajte uzorak svojim ultrazvučnikom, npr. UP200St (80% amplitude) za 1 min. u režimu pulsa (15sec na, 15sec pauza). Drћi uzorak u ledenoj kupki.
• Homogenati se zatim centrifugiraju da bi se dobili određeni bazeni (citosoli, nuklearni, mitohondrijski ili lisosomski) kako bi se protein obogatio za analizu. Centrifugiranjem uzorka na 5 minuta na 5000×g, supernatant se preuzima.

Pouzdana kontrola temperature tokom sonikacije

Temperatura je ključni faktor koji utiče na proces, a koji je posebno važan za lečenje bioloških uzoraka, npr. Kao i sve tehnike pripreme mehaničkih uzoraka, sonication stvara toplotu. Međutim, temperatura uzoraka se može dobro kontrolisati prilikom korišćenja Hielscher Ultrasonics uređaja. Predstavljamo vam različite opcije za praćenje i kontrolu temperature vaših uzoraka dok ih pripremate ultrazvučnim tipom sonde ili VialTweeter pre-analitički.

1. Praćenje temperature uzorka: Svi Hielscher digitalni ultrazvučni procesori opremljeni su inteligentnim softverom i senzorom za dodatnu temperaturu. Priključite senzor temperature u ultrazvučni uređaj (npr. УП200Хт, УП200Ст, ВиалТвеетер, UIP400MTP) i ubacite vrh senzora temperature u jednu od uzoraka cevi. Putem digitalno obojenog ekrana osetljivog na dodir, u meniju ultrazvučnog procesora možete postaviti određeni temperaturni opseg za vaš uzorak sonication. Ultrazvučnik će se automatski zaustaviti kada se dostigne maksimalna temperatura i pauzirati dok se temperatura uzorka ne spusti na nižu vrednost postavljene temperaturne ∆. Onda se sonikacija ponovo automatski započinje. Ova pametna funkcija sprečava razgradnju izazvanu toplotom.
2. Što se tiče ultrazvučne jedinice sa više uzoraka VialTweeter, titanijumski blok, koji drži uzorke cevi, može biti unapred ohlađen. Stavite VialTweeter blok (samo sonotrode bez transduktora!) u frižider ili zamrzivač da se prehladi titanijumski blok pomaže da se odloži porast temperature u uzorku. Ako je moguće, i sam uzorak se može unapred ohladiti.
3. Koristite ledenu kupku ili suvi led da se rashladite tokom sonikacije. Stavite svoje uzorke cevi tokom sonikacije u ledenu kupku. Za VialTweeter koristite plitku tacnu ispunjenu suvim ledom i stavite VialTweeter na suvi led kako bi toplota rapidno rascedala.

Klijenti širom sveta koriste Hielscher sonde-ultrazvučnike, kao i jedinice za sonikuaciju sa više uzoraka VialTweeter i UIP400MTP za svakodnevni rad na pripremi uzoraka u biološkim, biohemijskim, medicinskim i kliničkim laboratorijama. Inteligentni softver i kontrola temperature Hielscher procesora, temperatura je pouzdano kontrolisana i izbegnuta je degradacija uzoraka izazvana toplotom. Ultrazvučni preparat uzorka sa Hielscher ultrazvučnim rešenjima daje veoma pouzdane i reproduktivne rezultate!