Ултразвучна припрема узорка за ЕЛИСА тестове

Тестови као што је ЕЛИСА се широко користе за ин витро дијагностику, детекцију протеина у вези са болестима и контролу квалитета (нпр. праћење алергена у храни). Ултразвучна припрема узорка је брза, поуздана и поновљива техника за лизу ћелија и изоловање интрацелуларних протеина, ДНК, РНК и органела. Хиелсцхер Ултрасоницс нуди различита ултразвучна решења за практичну припрему појединачних узорака, више бочица, као и за микротитарске плоче и плоче са 96 јажица.

ЕЛИСА – Ензимски имуносорбентни тест

ЕЛИСА је скраћеница за ензимски имуносорбентни тест и широко је коришћена техника биохемијске анализе из категорије тестова везивања лиганда. У ЕЛИСА тесту, течни узорак се додаје на стационарну чврсту фазу са посебним својствима везивања. Нормално, стационарна чврста фаза се наноси као облога на плочу са бунарима или ЕЛИСА плочу. Затим се узастопно додају различити течни реагенси, инкубирају и испиру, тако да коначно долази до оптичке промене (нпр. развој боје као продукт ензимске реакције) у коначној течности у бунарчићу. Оптичка промена омогућава да се измери количина аналита помоћу квантитативне тзв. “читање”. За квантитативно очитавање, спектрофотометар, флуорометар или луминометар се користи за детекцију и мерење интензитета пропуштене светлости. На осетљивост детекције утиче појачање сигнала током аналитичких реакција. Пошто су ензимске реакције добро истражене и поуздани процеси амплификације, ензими се користе за стварање сигнала. Ензими су повезани са реагенсима за детекцију у фиксним пропорцијама како би се омогућила тачна квантификација, што објашњава и назив имуносорбентног теста „везан за ензиме“.
Како се ЕЛИСА тестови изводе на микротитарским плочама/плочама са 96 јажица, познат је као техника анализе на бази плоча и користи се нпр. у клиничкој ин-витро дијагностици, истраживању, развоју лекова итд. за откривање и квантификацију антитела, пептида, протеина, и хормони.
ЕЛИСА техника се често користи као дијагностички алат у медицини, биотехнологији, патологији биљака и такође је важно мерење контроле квалитета у више индустрија.

Ултразвучна припрема узорка пре ЕЛИСА

Пре него што се може извести ЕЛИСА тест, узорци захтевају кораке припреме као што су ћелијска лиза и екстракција интрацелуларних протеина, ДНК, РНК итд. Предност ултразвучне ћелијске лизе и изолације протеина је њена висока ефикасност, поузданост и репродуктивност. Сви ови фактори су важни за добијање квалитетне дијагностике и резултата истраживања

Протокол за пре-ЕЛИСА ултразвучну ћелијску лизу

• За ћелијске културе: Пре ултразвучне лизе ћелија, центрифугирајте ћелије 5 минута на 270 кг у микроцентрифуги. Уклоните супернатант аспирацијом и ресуспендујте ћелије у 30 – 100 μЛ РИПА пуфера. Затим инкубирајте ћелијску пелету на леду 30 минута.
• Сада је узорак ћелије спреман за ултразвучну лизу:
  Користите ултразвучни апарат типа сонде (нпр УП200Хт са С26д2 сондом) или ултразвучни уређај за више узорака (нпр. ВиалТвеетер за истовремену соникацију до 10 бочица или УИП400МПТ за микротитарске плоче/плоче са 96 јажица) у зависности од количине узорака које треба да припремите.
  За соникацију једног узорка сондом, ставите ћелије у епрувете за микроцентрифугу од 1,5 мЛ.
• Унапред подесите трајање ултразвука, укупан унос енергије, режим циклуса и/или ограничења температуре у дигиталном менију ултразвучног апарата. Ово осигурава високо поуздану соникацију и поновљивост.
• Уметните сонотроду и укључите ултразвучни уређај. Лагано померите микроврх ултразвучне сонде кроз узорак да бисте равномерно обрадили узорак.
  За већину ћелија, ултразвучна лиза ће бити завршена након 2-4 циклуса ултразвучне обраде од 10 секунди.
• Након соникације, уклоните сонотроду из узорка. Узорке треба инкубирати на леду 5 мин. Затим центрифугирајте на 10.000 кг 20 минута да бисте пелетирали остатке. Пребаците супернатанте у нову епрувету за микроцентрифугу. Обележите аналите и чувајте на -20°Ц.
• Ултразвучна сонотрода се може очистити тако што се правилно обрише алкохолом или соникатом у чаши напуњеној алкохолом, нпр. 70% етанола. Све ултразвучне сонде направљене од титанијума могу се аутоклавирати.

• Исперите ткиво ледено хладним ПБС (0,01М, пХ=7,4) да бисте темељно уклонили вишак крви хемолизе.
• Измерити ткиво (бубрег, срце, плућа, слезину итд.) и мацерирати на мале комаде, који се хомогенизују у ПБС. Потребна запремина ПБС-а је повезана са тежином ткива. По правилу, 1 г ткива захтева прибл. 9мЛ ПБС. Препоручује се додавање неког инхибитора протеазе у ПБС. (РИПА или хипотонични пуфер за лизу који садржи коктел инхибитора протеазе и фосфатазе може се користити алтернативно.)
• У зависности од величине ткива, кратак вортекс третман (отприлике 1-2 мин. у импулсима од 15 секунди) може бити од помоћи за претходни третман ткива.
• Поставите микро-врх, нпр. С26д2, на ваш ултрасоникатор. Ставите епрувету са узорком са марамицом у ледено купатило.
• Обрадите узорак ултразвуком, нпр. УП200Ст (80% амплитуда) у трајању од 1 мин. у пулсном режиму (15 секунди укључено, 15 секунди пауза). Држите узорак у леденом купатилу.
• Хомогенати се затим центрифугирају да би се добили специфични базени (цитосолни, нуклеарни, митохондријски или лизозомални) како би се обогатио протеин за анализу. Центрифугирањем узорка током 5 минута на 5000×г, супернатант се узима.

Поуздана контрола температуре током соникације

Температура је кључни фактор који утиче на процес који је посебно важан за третман биолошких узорака, нпр. за спречавање термичке деградације протеина. Као и све технике механичке припреме узорака, соникација ствара топлоту. Међутим, температура узорака се може добро контролисати када се користе уређаји Хиелсцхер Ултрасоницс. Представљамо вам различите опције за праћење и контролу температуре ваших узорака док их припремате помоћу ултрасоникатора типа сонде или ВиалТвеетер преаналитички.

1. Праћење температуре узорка: Сви Хиелсцхер дигитални ултразвучни процесори су опремљени интелигентним софтвером и сензором температуре који се може прикључити. Укључите сензор температуре у ултразвучни уређај (нпр. УП200Хт, УП200Ст, ВиалТвеетер, Соникатор плоча са више бунара УИП400МТП) и уметните врх сензора температуре у једну од епрувета за узорке. Преко дигиталног обојеног екрана осетљивог на додир, можете подесити у менију ултразвучног процесора одређени температурни опсег за ваш узорак ултразвучне обраде. Ултрасоникатор ће се аутоматски зауставити када се достигне максимална температура и паузирати док температура узорка не падне на нижу вредност подешене температуре ∆. Тада ултразвук почиње аутоматски поново. Ова паметна функција спречава деградацију изазвану топлотом.
2. Што се тиче ултразвучне јединице за више узорака ВиалТвеетер, титанијумски блок, који држи епрувете за узорке, може се претходно охладити. Ставите ВиалТвеетер блок (само сонотроду без сонде!) у фрижидер или замрзивач да бисте претходно охладили блок од титанијума, што помаже да се одложи пораст температуре у узорку. Ако је могуће, сам узорак се такође може претходно охладити.
3. Користите ледено купатило или суви лед за хлађење током ултразвучне обраде. Ставите епрувету(е) за узорке током ултразвука у ледено купатило. За ВиалТвеетер, користите плитку тацну напуњену сувим ледом и ставите ВиалТвеетер на суви лед тако да топлота може брзо да се расипа.

Купци широм света користе ултрасоникаторе типа Хиелсцхер сонде, као и јединице за соникацију са више узорака ВиалТвеетер и УИП400МТП за свој свакодневни рад на припреми узорака у биолошким, биохемијским, медицинским и клиничким лабораторијама. Интелигентни софтвер и контрола температуре Хиелсцхер процесора, температура се поуздано контролише и избегава се деградација узорка изазвана топлотом. Ултразвучна припрема узорка са Хиелсцхер ултразвучним решењима даје високо поуздане и поновљиве резултате!
Прочитајте више о ултразвучној соникацији високог протока користећи соникатор плоча са више бунара УИП400МТП за тестове!