Лиза BL21 ћелија ултразвуком

BL21 ћелије су сој E. coli који се широко користи у истраживачким лабораторијама, биотехнологији и индустријској производњи због способности веома ефикасне експресије протеина. Ултразвучно разарање ћелија, лиза и екстракција протеина представљају уобичајену методу за изоловање и прикупљање циљних протеина из унутрашњости BL21 ћелија. Ултразвучна обрада потпуно разара ћелију и ослобађа све заробљене протеине, чиме 100% протеина постаје доступно.

BL21 ћелије за експресију протеина

BL21 је хемијски компетентан бактеријски сој E. coli погодан за трансформацију и висок ниво експресије протеина помоћу индукционог система T7 РНК полимераза–IPTG. BL21 ћелије омогућавају веома ефикасну експресију протеина са било ког гена који је под контролом T7 промотора. Сој E. coli BL21(DE3) служи за производњу протеина засновану на T7 РНК полимерази, у комбинацији са експресионим векторима заснованим на T7 промотору, и широко се примењује у лабораторијама и индустрији за производњу рекомбинантних протеина. Код BL21(DE3), ген који кодира рекомбинантни протеин транскрибује хромозомски кодирана T7 РНК полимераза (T7 RNAP), која обавља транскрипцију осам пута брже од конвенционалне E. coli RNAP. То чини сој BL21(DE3) веома ефикасним и сврстава га међу најпожељније ћелијске системе за експресију протеина.

Протокол за ултразвучну лизу и екстракцију протеина из BL21 ћелија

Лиза BL21 ћелија најчешће се спроводи ултразвучном обрадом у комбинацији са натријум-лауроил-саркозинатом (познатим и као саркозил) као пуфером за лизу. Предности ултразвучног разарања ћелија и екстракције протеина огледају се у поузданости, поновљивости, као и једноставном, безбедном и брзом раду ултразвучних уређаја. Следећи протокол даје упутства корак по корак за ултразвучну лизу BL21 ћелија:

• Да би се уклонили шаперонски протеини, талози BL21 бактерија ресуспендовани су у 50 ml ледено хладног натријумског Tris-EDTA (STE) пуфера (који се састоји од 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl уз додатак 100 mM PMSF).
• Затим се додаје 500 ul лизозима (10 mg/ ml), а ћелије се инкубирају на леду 15 min.
• Након тога се додаје 500 ul DTT и 7 ml саркозила (10% (w/v) припремљеног у STE пуферу).
• Неопходно је да сви пуфери за пречишћавање буду ледено хладни и да се узорци све време држе на леду. Све кораке пречишћавања треба спроводити у хладној комори ако је могуће.



• За ултразвучну лизу и екстракцију протеина, узорци се обрађују ултразвуком у уређају VialTweeter MultiSample Ultrasonicator током 4 x 30 sec при 100% амплитуде, са интервалом од 2 min између појединачних ултразвучних обрада. Алтернативно, ултразвучни хомогенизатор са сондом и микроврхом, нпр. UP200Ht са S26d2 (3 x 30 sec, пауза од 2 min. између ултразвучних циклуса, 80% амплитуде), може се користити.
• За даље кораке пречишћавања, узорци се морају држати на леду или, алтернативно, чувати на -80°C до даље обраде.

Ултразвучна лиза уз прецизну контролу температуре

Прецизна и поуздана контрола температуре од пресудног је значаја при руковању биолошким узорцима. Високе температуре покрећу топлотом изазвану разградњу протеина у узорцима.
Као и све механичке технике припреме узорака, ултразвучна обрада ствара топлоту. Међутим, температура узорака може се добро контролисати када се користи VialTweeter. Представљамо вам различите могућности праћења и контроле температуре ваших узорака док их припремате за анализу помоћу уређаја VialTweeter и VialPress.

1. Праћење температуре узорка: Ултразвучни процесор UP200St, који покреће VialTweeter, опремљен је интелигентним софтвером и прикључивим температурним сензором. Прикључите температурни сензор на UP200St и уметните врх температурног сензора у једну од епрувета са узорцима. Преко дигиталног екрана у боји осетљивог на додир можете у менију уређаја UP200St подесити одређени температурни опсег за соникацију узорака. Ултразвучни уређај ће се аутоматски зауставити када се достигне максимална температура и паузирати док температура узорка не падне на доњу вредност подешеног температурног опсега ∆. Затим се соникација аутоматски поново покреће. Ова паметна функција спречава разградњу изазвану топлотом.
2. Блок VialTweeter може се претходно охладити. Ставите блок VialTweeter (само сонотроду без претварача!) у фрижидер или замрзивач како бисте претходно охладили титанијумски блок, што помаже да се одложи пораст температуре у узорку. Ако је могуће, и сам узорак се може претходно охладити.
3. Користите суви лед за хлађење током соникације. Употребите плитку посуду напуњену сувим ледом и поставите VialTweeter на лед како би се топлота могла брзо одводити.

Корисници широм света користе VialTweeter и VialPress за свакодневну припрему узорака у биолошким, биохемијским, медицинским и клиничким лабораторијама. Захваљујући интелигентном софтверу и контроли температуре процесора UP200St, температура се поуздано контролише и избегава се разградња узорака изазвана топлотом. Ултразвучна припрема узорака помоћу уређаја VialTweeter и VialPress даје веома поуздане и репродуктивне резултате!
 

Пронађите оптимални ултразвучни уређај за разарање ћелија за вашу примену лизе

Hielscher Ultrasonics је произвођач са дугогодишњим искуством у производњи ултразвучних уређаја високих перформанси за разарање ћелија и хомогенизатора за лабораторије, стоне системе и системе индустријских размера. Величина ваше бактеријске ћелијске културе, ваш истраживачки или производни циљ и запремина ћелија коју треба обрадити на сат или дневно кључни су фактори за избор одговарајућег ултразвучног уређаја за разарање ћелија за вашу примену.
Hielscher Ultrasonics нуди разна решења за истовремену соникацију више узорака (до 10 бочица помоћу уређаја VialTweeter) и великог броја узорака (тј. микротитарских плоча / ELISA плоча помоћу уређаја UIP400MTP), као и класичне лабораторијске ултразвучне уређаје са сондом различитих снага од 50 до 400 вати, па све до потпуно индустријских ултразвучних процесора снаге до 16.000 вати по јединици за комерцијално разарање ћелија и екстракцију протеина у великој производњи. Сви ултразвучни уређаји Hielscher конструисани су за рад 24/7/365 под пуним оптерећењем. Робусност и поузданост су основне одлике наших ултразвучних уређаја.
Сви дигитални ултразвучни хомогенизатори опремљени су паметним софтвером, екраном у боји осетљивим на додир и аутоматским бележењем података, што ултразвучни уређај чини практичним радним алатом у лабораторијама и производним погонима.
Обавестите нас коју врсту ћелија, коју запремину, колико често и са којим циљем треба да обрађујете своје биолошке узорке. Препоручићемо вам најпогоднији ултразвучни уређај за разарање ћелија који одговара захтевима вашег процеса.

Табела у наставку даје преглед приближног капацитета обраде наших ултразвучних система, од компактних ручних хомогенизатора и ултразвучних уређаја за више узорака до индустријских ултразвучних процесора за комерцијалне примене:

Литература / Референце

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.