Ултразвучна лиза Е. Цоли
- Бактерије Е. цоли су најчешће коришћене бактерије у микробиологији и биотехнологији.
- Ултразвучни дисруптори ћелија дају поуздане и поновљиве резултате за лизу Е. цоли.
- Интензивне али прецизно контролисане кавитације и силе смицања резултирају потпуним прекидом и високим приносима екстракције (нпр. протеини, ДНК).
Зашто је ултразвучно уништавање ћелија Е. цоли пожељна метода?
Ултразвучни хомогенизатори или ултразвучни апарати типа сонде нуде неколико предности за лизу Е. цоли јер интензиван ултразвук ефикасно ремети ћелијске зидове и мембране. Ултрасоникатори типа сонде се широко користе за лизу Е. цоли из следећих разлога:
Екстракција протеина из ћелија Е.цоли се ефикасно изводи са ултразвучна сонда УП200Ст
Ултрасоникатор типа сонде нуди многе предности за лизу Е. цоли. Поуздана и прецизна контрола параметара ултразвучног процеса омогућава оптимизацију радних параметара као што су снага, трајање и руковање узорком како би се постигли жељени резултати.
Електрофоретске анализе геномске ДНК Е. цоли ЕДЛ933 подвргнуте ултразвуку у трајању од 0 – 15 мин. Л означава ДНК лествице.
(студија и слика: ©Басселет ет ал. 2008)
Поремећај ћелија коришћењем ултразвучне кавитације
Ултразвучни хомогенизатори типа сонде раде са прибл. 20.000 циклуса у секунди (на 20 кХз) и изазивају кавитацију у течностима или суспензијама. Акустична кавитација микроскопске области притисака сличних вакууму и високих температура које раздвајају ћелије. Иако температуре могу достићи неколико хиљада степени Целзијуса, запремине кавитације су толико мале да не загревају значајно процес. Ултразвук генерисана акустична кавитација и силе смицања перфорирају или разбијају ћелијску мембрану бактеријских ћелија као што је Е.цоли. Хиелсцхер ултрасоникатори омогућавају прецизну контролу над параметрима процеса као што су ултразвучни интензитет, амплитуда, унос енергије и температура. Тиме се ултразвучни процес лизе може оптимално прилагодити типу ћелије, ћелијској култури и циљу процеса.
- прецизна контрола лизе (интензитет, амплитуда, температура)
- поуздани, поновљиви резултати
- оптимално прилагођавање специфичним узорцима
- контрола температуре
- за веома мале до веома велике узорке (µЛ до литара)
- Чисто механичка обрада
- једноставан за коришћење, безбедан рад
- линеарно повећање од лабораторије до производње
ВиалТвеетер за ултразвучну лизу
Ултразвучни хомогенизатор против других техника лизе
Док хемијска и ензимска лиза може бити проблематична – пошто хемијска лиза може да промени структуре протеина и уведе проблеме пречишћавања, а ензимска лиза захтева дуго време инкубације и није репродуцибилна – ултразвучно ометање је софистицирани, брзи метод ометања ћелија.
Ултразвучна лиза се заснива само на механичким силама. Не додају се хемикалије, соникација разбија ћелијски зид силама смицања. Хемијска лиза може да промени структуру протеина и уведе проблеме пречишћавања. Ензимски поремећај захтева дуго време инкубације и није поновљив. Ултразвучно уништавање ћелија бактерије Е.цоли је брзо, једноставно, поуздано и поновљиво. Због тога се Хиелсцхер ултрасоникатори користе у биолошким и биохемијским лабораторијама широм света за припрему узорака, пре-аналитику, ин-витро дијагонстику и вишеструке тестове.
Опште препоруке за ултразвучну лизу
Соникација је најпопуларнија техника за лизирање веома малих, средњих и великих количина суспензија ћелија – од пико-литара до 100Л/х (користећи ултразвучну проточну ћелију). Ћелије се лизирају течним смицањем и кавитацијом. ДНК се такође сече током соникације, тако да није потребно додавати ДНАзу у ћелијску суспензију.
Контрола температуре током ултразвучне лизе Е.цоли
Претходним хлађењем узорка и чувањем узорка током ултразвучне обраде на леду, топлотна деградација узорка може се лако спречити.
У идеалном случају, узорке би требало држати на ледено хладним током лизе, али за већину узорака је довољно ако температура не порасте изнад температуре културе или извора ткива. Због тога се препоручује да се суспензија држи на леду и да се врши соникација са неколико кратких ултразвучних импулса од 5-10 секунди и паузама од 10-30 секунди. Током пауза, топлота се може распршити да би се поново успоставила ниска температура. За веће узорке ћелија, доступни су различити реактори са проточним ћелијама са расхладним омотачем.
Прочитајте овде детаљне савете и препоруке за успешну ултразвучну лизу!
Протоколи за ултразвучну припрему лизата Е. Цоли
Истраживачи користе Хиелсцхер ултразвучне хомогенизаторе за поремећај ћелија Е.цоли. У наставку можете пронаћи различите тестиране и доказане протоколе за лизу Е.цоли користећи Хиелсцхер ултразвучне хомогенизаторе за различите примене у вези са Е.цоли.
Раст ћелија, умрежавање и припрема ћелијских екстраката Е. цоли коришћењем ултразвука
За СекА и РНА полимеразу ЦхИП-Цхип Е. цоли МГ1655 или МГ1655 ΔсекА је узгајан на 37°Ц до ОД600 од око 0,15 у 50 мл ЛБ (+ 0,2% глукозе) пре него што је додато 27 μл формалдехида (37%) по мл медијума (коначна концентрација 1%). Унакрсно повезивање је изведено уз споро мућкање (100 рпм) на собној температури током 20 минута, након чега је уследило гашење са 10 мл 2,5 М глицина (коначна концентрација 0,5 М). За експерименте са топлотним шоком, Е. цоли МГ1655 је узгајан у 65 мл ЛБ медијума на 30°Ц до ОД600 од око 0,3. Потом је 30 мл културе пребачено у претходно загрејану боцу на 43°Ц, а остатак је држан на 30°Ц. Унакрсно повезивање и гашење је као што је горе описано, осим што су ћелије држане на 30 или 43 ° Ц током 5 минута пре даљег спорог мућкања на собној температури. Ћелије су сакупљене центрифугирањем и испране два пута са хладним ТБС (пХ7,5). Након ресуспензије у 1 мл пуфера за лизу (10 мМ Трис (пХ 8,0), 20% сахарозе, 50 мМ НаЦл, 10 мМ ЕДТА, 10 мг/мл лизозима) и инкубације на 37°Ц током 30 минута, након чега следи додавање 4 мл ИП пуфера, ћелије су соникиране на леду са паузама од 12 пута по 30 секунди и 30 секунди коришћењем Хиелсцхер ултразвучног процесора УП400Ст при поставци снаге 100%. После центрифугирања од 10 минута на 9000 г, аликвоти од 800 μл супернатанта су чувани на -20 ° Ц. (Валдмингхаус 2010)
Прекомерна производња и пречишћавање ензима ултразвучном сондом
За прекомерну производњу протеина обележених декахистидином (Хис10), Е. цоли БЛ21(ДЕ3) је трансформисан са пЕТ19б конструктима. Прекултура преко ноћи је сакупљена центрифугирањем, а 1% је коришћено за инокулацију експресионе културе. Ћелије које носе пЕТ19мгтБ су узгајане на 22°Ц до оптичке густине на 600 нм (ОД600) од 0,7. Култура је пребачена на 17 ° Ц и индукована са 100 μМ ИПТГ. После 16 х, култура је сакупљена центрифугирањем на 7.500 × г на 4 ° Ц. Ћелије су ресуспендоване у 50 мМ физиолошком раствору пуферованом фосфатом (ПБС) са 0,3 М НаЦл при пХ 7,4 и поремећене ултразвуком сонотродом С2 са микро врхом на Хиелсцхер ултрасоникатору УП200Ст при циклусу од 0,5 и амплитуди од 75%.
Прекомерна производња декахистидином означеног ГтфЦ је индукована на 37°Ц при ОД600 од 0,6 са 100 μМ ИПТГ. Ћелије су затим инкубиране 4 х, сакупљене и лизиране као што је горе наведено за МгтБ.
Сирови ћелијски екстракти су центрифугирани на 15.000 × г и 4 ° Ц да би се седиментирали ћелијски остаци. Пречишћени екстракти су стављени на колоне ХисТрап ФФ Цруде од 1 мл коришћењем АКТАприме Плус система. Ензими су пречишћени у складу са протоколом произвођача за градијент елуације Хис-означених протеина. Елуирани протеински раствори су дијализовани два пута против 1000 запремина 50 мМ ПБС, пХ 7,4, са 0,3 М НаЦл на 4°Ц. Пречишћавање је анализирано са 12% СДС-ПАГЕ. Концентрација протеина је одређена Брадфордовом методом коришћењем Роти-Куант-а. (Рабаусцх ет ал. 2013)
Ултразвучна екстракција протеина из бактерија Е. цоли
Протеин мамаца од интереса (у овом случају, МТВ1 Арабидопсис тхалиана) је фузионисан са ГСТ ознаком и експримиран у ћелијама БЛ21 Есцхерицхиа цоли (Е. цоли).
- Узмите једну пелету ГСТ-МТВ1 и ГСТ (што одговара 50 мл бактеријске културе) и сваку ресуспендујте у 2,5 мЛ ледено хладног пуфера за екстракцију.
- Користите ултразвучни апарат УП100Х (опремљен МС3 микротип-сонотродом за мале запремине од приближно 2-5 мЛ) да пореметите бактеријске ћелије док се не лизирају, на шта указује смањена непрозирност и повећан вискозитет. Ово се мора изводити на леду и препоручује се ултразвук у интервалима (нпр. ултразвук од 10 секунди након чега следи пауза од 10 секунди на леду и тако даље). Мора се пазити да се ултразвук не врши превисоким интензитетом. Ако се открије пењење или стварање белог талога, интензитет треба смањити.
- Пренесите раствор лизираних бактерија у епрувете за микроцентрифугу од 1,5 мЛ и центрифугирајте на 4°Ц, 16,000 кг 20 мин.
Ултрасоникатори типа сонде као што је УП400Ст користити принцип рада акустичне кавитације за ефикасну лизу Е.цоли.
Анализа експресије и пречишћавање рекомбинантног протеина коришћењем ултразвука
Пелета Е. цоли је соницирана са Хиелсцхер ултрасоникатором УП100Х. У ту сврху, ћелијска пелета је ресуспендована у охлађеном пуферу за лизу (50 мМ Трис-ХЦл пХ=7,5, 100 мМ НаЦл, 5 мМ ДТТ, 1 мМ ПМСФ) и хлађена на леду 10 мин. Затим је суспензија ћелија ултразвучна са 10 кратких рафала од 10 с, након чега је уследио интервал од 30 с за хлађење. Коначно, ћелијски остаци су уклоњени ултрацентрифугирањем на 4 ° Ц током 15 минута на 14000 рпм. За потврду експресије рПР, супернатант је стављен на 12% полиакриламидни гел и анализиран помоћу СДС-ПАГЕ и Вестерн блотинга. Пречишћавање рПР-а је обављено коришћењем Ни2+-НТА смоле (Инвитроген, САД) према упутству произвођача. У овој фази је коришћена нативна метода пречишћавања. Чистоћа пречишћеног протеина је процењена коришћењем електрофорезе на 12% полиакриламидном гелу и накнадног Цоомассие плавог бојења. Концентрација пречишћеног протеина је мерена помоћу комплета за анализу протеина Мицро БЦА (ПИЕРЦЕ, САД). (Азарнезхад ет ал. 2016)
Ултразвучни хомогенизатори за лизу Е. цоли
Хиелсцхер Ултрасоницс дизајнира, производи и снабдева ултразвучне хомогенизаторе високих перформанси за поуздану и ефикасну лизу бактерија Е. цоли и других типова ћелија, ткива и ћелијских култура.
Широк портфељ ултразвучних сонди, као и индиректних система соникације омогућава нам да вам понудимо идеалан ултразвучни хомогенизатор ткива за ваше ћелијске поремећаје и примену екстракције.
Дизајн, производња и консалтинг – Квалитет Маде ин Германи
Хиелсцхер ултрасоникатори су познати по свом највишем квалитету и стандардима дизајна. Паметан софтвер, интуитиван мени, програмабилна подешавања и аутоматско протоколирање података су само неке од карактеристика Хиелсцхер ултрасоникатора. Робусност и једноставан рад омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних апарата у истраживачке и биотехнолошке објекте. Хиелсцхер ултрасоникатори лако управљају чак и тешким условима и захтевним окружењима.
Хиелсцхер Ултрасоницс је ИСО сертификована компанија и ставља посебан нагласак на ултрасоникаторе високих перформанси са најсавременијом технологијом и једноставношћу за коришћење. Наравно, Хиелсцхер ултрасоникатори су усаглашени са ЦЕ и испуњавају захтеве УЛ, ЦСА и РоХ.
Табела у наставку даје вам индикацију приближних капацитета обраде наших ултразвучних апарата:
| Батцх Волуме | Проток | Препоручени уређаји |
|---|---|---|
| плоче са више јажица/микротитар | на | УИП400МТП |
| ЦупХорн за бочице или чашу | на | Ултрасониц ЦупХорн |
| ултразвучни микро-проточни реактор | на | ГДмини2 |
| до 10 бочица са 0,5 до 1,5 мЛ | на | ВиалТвеетер |
| 0.5 до 1.5 мЛ | на | ВиалТвеетер |
| 1 до 500 мл | 10 до 200 мл/мин | УП100Х |
| 10 до 2000 мл | 20 до 400 мл/мин | УП200Хт, УП400Ст |
| 0.1 до 20Л | 0.2 до 4Л/мин | УИП2000хдТ |
| 10 до 100 л | 2 до 10 л/мин | УИП4000 |
| на | 10 до 100 л/мин | УИП16000 |
| на | већи | кластер оф УИП16000 |
Контактирајте нас! / Питајте нас!
Додатни протоколи за ултразвучну лизу Е. цоли
Алицин-модификовани протеини у Е. цоли помоћу ултразвучног ВиалТвеетер-а
Одређивање садржаја сулфхидрила помоћу 5,5′-дитиобис(2-нитробензојеве киселине) (ДТНБ) теста
Култура Е. цоли МГ1655 преко ноћи је коришћена за инокулацију МОПС минималног медијума (1:100). Култура је узгајана аеробно док се не постигне А600 од 0,4. Култура је подељена на три културе од 15 мл за третман стреса. Нетретирана култура служила је као негативна контрола. У једну од преостале две културе додато је 0,79 мМ алицина (128 μг мл-1) или 1 мМ дијамида. Културе су инкубиране 15 мин. 5 мл сваке културе је сакупљено центрифугирањем (8,525 × г, 4 ° Ц, 10 мин). Ћелије су два пута испране са 1 мл ПБС (137 мМ НаЦл, 2,7 мМ КЦл, 10 мМ На2ХПО4, 2 мМ КХ2ПО4, пХ 7,4, чуване анаеробно пре употребе) и центрифугиране (13 000 × г, 4 ° Ц, 10 мин). Ћелије су ресуспендоване у пуферу за лизу (ПБС са 6 мМ гванидинијум ХЦл, пХ 7,4) пре прекидања на 4°Ц ултразвуком (ВиалТвеетер ултрасоникатор, Хиелсцхер ГмбХ, Немачка) (3 × 1 мин). Ћелијски остаци су пелетирани центрифугирањем (13.000 × г, 4 ° Ц, 15 мин). Супернатант је пребачен у КС-макро кивету од 3,5 мл (10 мм) са магнетном мешалицом и помешан са 1 мл пуфера за лизу. Екстинкција узорака је праћена на 412 нм са Јасцо В-650 спектрофотометром опремљеним ПСЦ-718 држачем ћелија са контролисаном температуром на собној температури. Додато је 100 μл 3 мМ раствора дитиобис(2-нитробензоеве киселине). Изумирање је праћено све док није дошло до засићења. Прорачун концентрације тиола је извршен коришћењем коефицијента екстинкције ϵ412 = 13.700 М-1 центиметар-1 за тио-2-нитробензојеву киселину (ТНБ). Концентрације ћелијског тиола су израчунате на основу запремине ћелија Е. цоли од 6,7 × 10-15 литар и густина ћелија А600 = 0,5 (еквивалентно 1 × 108 ћелије мл-1 културе). (Муллер ет ал. 2016)
Ин виво одређивање глутатиона помоћу ултразвучне дробилице ћелија
Е.цоли МГ1655 је узгајан у МОПС минималној подлози у укупној запремини од 200 мл док се не постигне А600 од 0,5. Култура је подељена на културе од 50 мл за третман стреса. После 15 минута инкубације са 0,79 мМ алицина, 1 мМ диамида или диметил сулфоксида (контрола), ћелије су сакупљене на 4000 г на 4 ° Ц током 10 минута. Ћелије су испране два пута са КПЕ пуфером пре ресуспендовања пелета у 700 ул КПЕ пуфера. За депротеинацију, 300 л 10% (в/в) сулфосалицилне киселине је додато пре разбијања ћелија ултразвучном обрадом (3 к 1 мин; ВиалТвеетер ултразвучни апарат). Супернатанти су сакупљени након центрифугирања (30 мин, 13,000 г, 4°Ц). Концентрације сулфосалицилне киселине су смањене на 1% додавањем 3 запремине КПЕ пуфера. Мерења укупног глутатиона и ГССГ су обављена као што је горе описано. Концентрације ћелијског глутатиона су израчунате на основу запремине ћелија Е. цоли од 6,7×10-15 литар и густина ћелија А600 0,5 (еквивалентно 1×108 ћелије мл-1 култура). Концентрације ГСХ су израчунате одузимањем 2[ГССГ] од укупног глутатиона. (Муллер ет ал. 2016)
Експресија хуманог мАспАТ у Е. цоли коришћењем ултразвучног хомогенизатора
Појединачна колонија Е. цоли БЛ21 (ДЕ3) која садржи вектор експресије у 30 мЛ Луриа-Бертани (ЛБ) медијума који садржи 100 μг/мЛ ампицилина, а затим култивисана на 37ºЦ до оптичке густине (ОД600) достигла 0,6. Ћелије су сакупљене центрифугирањем на 4.000 × г током 10 минута и ресуспендоване у 3Л свежег ЛБ медијума који садржи 100 μг/мЛ ампицилина.
Након тога, експресија протеина је индукована са 1 мМ изопропил β-ᴅ-1-тиогалактопиранозидом (ИПТГ) током 20 х на 16ºЦ. Ћелије су сакупљене центрифугирањем на 8.000 × г током 15 минута и испране пуфером А (20 мМ НаХ2ПО4, 0,5 М НаЦл, пХ 7,4). Приближно 45 г (мокра тежина) ћелија је добијено из културе од 3 Л. После центрифугирања, ћелијске пелете су ресуспендоване у 40 мЛ (за 1 Л културе) ледено хладног екстракционог пуфера А, и лизиране ултразвучном обрадом на ледено хладној температури коришћењем Хиелсцхер ултразвучне дробилице ћелија УП400Ст. Ћелијска лиза је центрифугирана на 12.000 рпм током 15 мин да би се одвојиле растворљиве (супернатант) и преципитиране (пелет) фракције. (Јианг ет ал. 2015)
Чињенице које вреди знати
Е.цоли
Есцхерицхиа цоли (Е. цоли) је грам-негативна, факултативно анаеробна, штапићаста колиформна бактерија из рода Есцхерицхиа која се обично налази у доњем цреву топлокрвних организама (ендотерме). Постоји велики број сојева (или подтипова) Е. цоли са различитим карактеристикама. Већина сојева Е. цоли је безопасна за људе, нпр. сојеви Б и К-12 који се обично користе за истраживачке примене у лабораторијама. Међутим, неки сојеви су штетни и могу изазвати озбиљне болести.
Е. цоли игра важну улогу у савременом биолошком инжењерингу и индустријској микробиологији јер је бактеријама лако манипулисати. Уобичајене лабораторијске примене које често укључују употребу Е. цоли, нпр. за стварање рекомбинантне деоксирибонуклеинске киселине (ДНК) или за деловање као модел организма.
Е. цоли је веома свестран домаћин за производњу хетерологних протеина, а на располагању су вишеструки системи експресије протеина за производњу рекомбинантних протеина у Е. цоли. Користећи плазмиде који омогућавају висок ниво експресије протеина, гени се могу унети у бактерије, што омогућава производњу таквих протеина у великим количинама у процесима индустријске ферментације.
Е.цоли се користе као фабрике ћелија за производњу инсулина. Даље примене укључују употребу модификованих ћелија Е. цоли за развој и производњу вакцина и имобилизованих ензима, за производњу биогорива, као и за биоремедијацију.
Сој К-12 је мутантни облик Е. цоли који прекомерно експримира ензим алкалну фосфатазу (АЛП). Ова мутација настаје због дефекта гена који стално кодира ензим. Ако ген производи производ без икакве инхибиције, то је познато као конститутивна активност. Овај специфични мутантни облик се користи за изолацију и пречишћавање АЛП ензима.
Е. цоли бактерије се такође широко користе као фабрике ћелија. Конструисани микроби (нпр. бактерије) и биљне ћелије могу се користити као такозване фабрике ћелија. Ове генетски модификоване ћелије производе молекуле, хемикалије, полимере, протеине и друге супстанце, које се користе на пример у фармацеутској, прехрамбеној и хемијској индустрији. Да би се ослободили молекули произведени у унутрашњости таквих биоинжињеринг ћелија, ултразвучна лиза је уобичајена метода за ометање ћелијских зидова и преношење циљних супстанци у околну течност. Прочитајте више о лизи биоинжењерских ћелија!
Ултразвучно ДНК стрижење
Ултразвучне силе смицања су уобичајена метода за ослобађање молекула, органела и протеина из унутрашњости ћелије, као и за разбијање ланаца ДНК на комаде. Акустична кавитација разбија ћелијске зидове и мембране да би извукла ДНК из ћелија и створила фрагменте од око 600 – 800 бп дужине, што је идеално за анализу.
Кликните овде да сазнате више о ултразвучним хомогенизаторима за фрагментацију ДНК!
Литература / Референце
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Хиелсцхер Ултрасоницс производи ултразвучне хомогенизаторе високих перформанси од лаб до индустријска величина.