Ултразвучно Лиза Е. Цоли
- E. kola bakterije su najčešće korišćene bakterije u mikrobiologiji i biotehnologiji.
- Ultrasonični razarači ćelija dostavljaju pouzdane i reproduktivne rezultate za lysis E. kola.
- Intenzivan i precizno kontrolisano kavitaciju i šinskih snaga rezultira potpunim poremećajama i velikim princima za vađenje (npr. proteine, DNA).
Zašto je ultrazvučni ćelijski poremećaj ešerihija koli željeni metod?
Ultrazvučni homogenizatori ili ultrazvučnici tipa sonde nude nekoliko prednosti za ešerihiju koli lize jer intenzivni ultrazvuk efikasno remeti ćelijske zidove i membrane. Ultrazvučnici tipa sonde se široko koriste za ešerihiju kolis zbog sledećih razloga:
Vađenje proteina iz ćelija ešerihije koli efikasno se vrši sa ultrazvučna sonda UP200St
Ultrazvučni tip sonde nudi brojne prednosti za ešerihiju kolisa. Pouzdana i precizna kontrola nad parametrima ultrazvučnog procesa omogućava optimizaciju operativnih parametara kao što su napajanje, trajanje i rukovanje uzorkom da bi se postigli željeni rezultati.
Elektroforetičke analize genomske DNK ešerihije koli EDL933 podvrgnute 0 – 15 min ultrazvučnosti. Ukazuje na DNK merdevine.
(study and image: ©Basselet et al. 2008)
Prekid ćelija pomoću ultrazvučne kavitacije
Ultrazvučni homogenizatori tipa sonde funkcionišu sa oko 20.000 ciklusa u sekundi (na 20kHz) i izazivaju kavitaciju u tečnostima ili suspenzijama. Akustične kavitacione mikroskopske oblasti pritiska nalik vakuumu i visoke temperature koje razdiru ćelije. Iako temperature mogu dostići nekoliko hiljada stepeni Celzijusa, zapremine kavitacije su toliko male da ne zagrevaju proces značajno. Ultrazvuk je generisao akustičnu kavitaciju i štićene sile perforira ili razbija ćelijske membrane bakterijskih ćelija kao što je E.coli. Hielscher ultrazvučni uređaji omogućavaju preciznu kontrolu parametara procesa kao što su ultrazvučni intenzitet, amplitude, energetski unos i temperatura. Zbog toga se proces ultrazvučne lize može optimalno prilagoditi tipu ćelije, kulturi ćelija i cilju procesa.
- precizna kontrola Lyze (intenzitet, pojačina, temperatura)
- pouzdani, reproduktivni rezultati
- optimalna prilagodjenja za određene uzorke
- контрола температуре
- za veoma male uzorke (μL do litara)
- Čisto mehanički tretman
- prilagođen korisniku, bezbedan rad
- Linearna razmera-od laboratorije do proizvodnje
ВиалТвеетер za ultrasonični tekstis
Ultrazvučni Homogenizer vs Ostale tehnike lize
Dok hemijska i enzimska liza mogu biti problematične – s obzirom da hemijska lajsis može da izmeni proteine i uvede probleme sa pročišćavanje i enmatic lysis zahteva dugo vreme inkubacije i ne može se preproduktiviti – ultrasonični poremećaj je sofisticirani, brz metod prekida ćelije.
Ultrazvučna liza se zasniva samo na mehaničkim silama. Nema hemikalija, sonication razbija ćelijski zid od strane sila. Hemijska liza može da promeni strukturu proteina i uvede probleme sa pročišćenjem. Enzimski poremećaj zahteva duga vremena inkubacije i nije se razmnožava. Ultrazvučni poremećaj ćelija bakterija E.coli je brz, jednostavan, pouzdan i reprodukovan. Zato se Hielscher ultrazvučni sistemi koriste u biološkim i biohemijskim laboratorijama širom sveta za pripremu uzoraka, predanlitike, in-vitro dijagonstike i manifold napada.
Opšte preporuke za ultrazvučnu lizu
Soniranost je najpopularnija tehnika za otpevavanje veoma malih, srednjih i velikih količina u ćelijama – od Pico do 100L/hr (korišćenjem ultrasonove ćelije toka). Ćelije se nalaze u vidu tečnih šinskih i Kavitacija. DNK je takođe u Soniji, tako da nije potrebno dodati DNase u ćelijske suspenzije.
Kontrola temperature tokom ultrazvučne E.coli lize
Prehladjenje uzorka i zadržavanje uzorka tokom sonacija na ledu, uzorak toplotne degradacije uzorka može lako da se spreči.
U idealnom uslovima, uzorke treba držati ledenim tokom lize, ali za većinu uzoraka dovoljno je ako temperatura ne poraste iznad temperature kulture ili izvora tkiva. Zato se preporučuje, da se suspenzija zadrži na ledu i da se sonicira sa nekoliko kratkih ultrazvučnih pulsa od 5-10 sec i pauza od 10-30 sec. Tokom pauza, toplota može da nestane kako bi se ponovo uspostavila niska temperatura. Za veće uzorke ćelija dostupni su razni reaktori ćelija protoka sa rashladna jaknama.
Protocols for the Ultrasonic Preparation of E. Coli Lysates
Istraživači koriste Hielscher ultrazvučne homogenizatore za prekid ćelija E.coli. U nastavku možete pronaći razne testirane i proverene protokole za E.coli lysis koristeći Hielscher ultrazvučne homogenizatore za razne aplikacije vezane za ešerihiju koli.
Cell Growth, Crosslinking and Preparation of E. coli Cell Extracts using Ultrasonics
Za SeqA i RNA polimerase ChIP-Chip E. kola MG1655 ili MG1655 ΔseqA je porastao na 37 ° c OD600 od oko 0,15 u 50 ml LB (+ 0,2% gluose) pre 27 μl od formaldehida (37%) po ml mediju (konačna koncentracija 1%). Na temperaturi (100 RPM) je nastupao na sporoj prostoriji za 20 min, a zatim i 10 ml 2,5 M glycine (završna koncentracija 0,5 M). Za eksperimente OD toplote, E. kola MG1655 je porastao u 65 ml LB Medium na 30 ° c do a OD600 od oko 0,3. Naknadno je 30 ml kulture prebačeno u unapred zagrejanu pljosku na 43°C, a ostatak na 30°C. Ukrštanje i utolivanje je kao što je gore opisano osim što su ćelije držane na 30 ili 43°C 5 min pre nego što se dodatno sporo tresu na sobnoj temperaturi. Ćelije su sakupljane centrifugacijom i dva puta oprane hladnim TBS-om (pH7,5). Nakon resuspenzije u baferu od 1 ml lize (10 mM Tris (pH 8.0), 20% sucrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozyme) i inkubacija na 37°C za 30 min praćena dodatkom 4 ml IP bafera, ćelije su sonirane na ledu sa 12 puta 30 sec i 30 sec pauza koristeći Hielscher ultrazvučni procesor UP400St na 100% Nakon centrifugacije na 10 min na 9000 g, 800 μl aliquote supernatant je pohranjeno na -20°C. (Waldminghaus 2010)
Overproduction and Purification of Enzymes with an Ultrasonic Probe
Za preprodukciju proteina označenih dešahiste (His10), E. coli BL21(DE3) je transformisan sa pET19b konstrukcijama. Prekultura je tokom noći požnjevena centrifugacijom, a jedan odsto je korišćeno za vakcinu kulture izražavanja. Ćelije koje nose pET19mgtB uzgajane su na 22°C sve do optičke gustine na 600 nm (OD600) od 0,7. Kultura je prebačena na 17°C i izazvana sa 100 μM IPTG. Posle 16 h, kultura je požnjevena centrifugacijom na 7.500 × na 4°C. Ćelije su ponovo zamenjene u 50 mM fosfat-baferovanom solinu (PBS) sa 0,3 M NaCl na pH 7,4 i poremećene ultrazvučnošću sa S2 mikro-tip sonotrodom na Hielscher ultrazvučnom UP200St u ciklusu od 0,5 i pojačanjem od 75%.
Preprodukcija dekahistidina-Tagged GtfC je prouzrokovana na 37 ° c OD600 od 0,6 sa 100 μM IPTG. Ćelije su zatim bile inkubirane za 4 h, koji su se, na primer, opisani kao gorenavedeni za MgtB.
Ekstrakti sirovih ćelija su centrifugirani na 15.000 × g i 4°C da bi se talogili krhotine ćelija. Razjašnjeni ekstrakti su učitani na 1-ml HisTrap FF Crude stubova pomoću ÄKTAprime Plus sistema. Enzimi su pročišćeni prema protokolu proizvođača za izmištanje preliva proteina. Eluted proteinska rešenja su dijalizirana dva puta u odnosu na 1.000 zapremina od 50 mM PBS, pH 7,4, sa 0,3 M NaCl na 4°C. Pročišćenje je analiziralo 12% SDS-PAGE. Koncentracija proteina je određena Bredford metodom pomoću Roti-Kvanta. (Rabausch et al. 2013)
Ultrazvučno vađenje proteina iz bakterija ešerihije koli
Mamac proteina interesa (u ovom slučaju, MTV1 Arabidopis thaliana) se koristi za GST i izražava se u BL21 Esčerichia kola (E. kola) ćelije.
- Uzmite po jednu kuglicu GST-MTV1 i GST (koja odgovara bakterijskoj kulturi od 50 ml) i ponovo zamenite svaku u baferu za ekstrakciju leda od 2,5 mL.
- Koristite ultrazvučni UP100H (opremljen MS3 mikrotip-sonotrode za male zapremine aproks. 2-5mL) da biste ometali bakterijske ćelije dok se ne natalože, što je naznačeno smanjenom neprozirnošću i povećanom viskoznošću. Ovo mora da se sprovede na ledu, a preporučuje se da se sonicira u intervalima (npr. 10 sec sonicanje praćeno pauzom od 10 sec na ledu i tako dalje). Briga mora da se vodi da se ne sonicira prevelikim intenzitetom. Ako se detektuje pena ili formiranje bele padavine, potrebno je smanjiti intenzitet.
- Prebacite rastvor lisnatih bakterija na 1,5 mL mikrocentrifuge cevi i centrifuge na 4°C, 16.000 x g za 20 min.
Ultrazvučnici tipa sonde kao što je UP400St koristite radni princip akustične kavitacije za efikasnu lizu E.coli.
Expression Analysis and Purification of Recombinant Protein using Sonication
Kuglica E. coli je bila sonična sa Hielscher ultrazvučnim UP100H. U tu svrhu, ćelijska kuglica je ponovo zamenjena u ohlađenom baferu od lize (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) i hladjena na ledu 10 min. Zatim, vešanje ćelija je bilo sonicirano sa 10 kratkih rafala od 10, praćenih intervalom od 30 s za hlađenje. Konačno, krhotine ćelija su uklonjene ultracentrifugacijom na 4°C za 15 min na 14000 rpm. Za potvrdu rPR izraza, supernatant je bio pokrenuti na 12% poliakrilamidnom gelu i analiziran od strane SDS-PAGE i Western blotting. Prečišćavanje rPR-a obavljeno je korišćenjem Ni2+-NTA smole (Invitrogen, SAD) prema uputstvu proizvođača. U ovoj fazi korišćen je način prečišćavanja maternjeg. Čistoća prečišćenog proteina procenjena je korišćenjem elektroforeze na 12% poliakrilamidnog gela i naknadno Coomassie plave fleke. Prečišćenu koncentraciju proteina merio je Micro BCA proteinski asay komplet (PIERCE, SAD). (Azarnezhad et al. 2016)
Ultrazvučni homogenizeri za ešerihiju koli Lisis
Hielscher Ultrasonics dizajnira, proizvodi i snabdeva ultrazvučnim homogenizatorima visokih performansi za pouzdanu i efikasnu lizu bakterija ešerihije koli i drugih tipova ćelija, tkiva i ćelijskih kultura.
Širok portfolio ultrazvučnih sondi kao i indirektnih sistema za soniciju omogućavaju nam da vam ponudimo idealan ultrazvučni homogenizer tkiva za vašu aplikaciju za prekid ćelija i vađenje.
Dizajn, proizvodnja i konsalting – Kvalitet napravljen u Nemačkoj
Hielscher ultrazvučni su dobro poznati po najvišim standardima kvaliteta i dizajna. Pametni softver, intuitivni meni, programska podešavanja i automatsko protokolarstvo podataka su samo nekoliko funkcija Hielscher ultrazvučnika. Robustnost i lak rad omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnika u istraživačke i biotehnološke objekte. Čak i grube uslove i zahtevna okruženja lako rešavaju Hielscher ultrazvučni.
Hielscher Ultrasonics je ISO sertifikovana kompanija i poseban akcenat stavlja na ultrazvučnike visokih performansi koji sadrže vrhunsku tehnologiju i user-friendliness. Naravno, Hielscher ultrazvučni su CE usaglašeni i ispunjavaju zahteve UL, CSA i RoHs.
Табела испод показује приближни капацитет обраде наших ултразвучних уређаја:
| батцх tom | Проток | Препоручени уређаји |
|---|---|---|
| višestruko dobro / mikrotiter ploče | Н.А. | UIP400MTP |
| CupHorn za bočice ili beaker | Н.А. | Ultrasonični CupHorn |
| ultrazvučni mikro-flow reaktor | Н.А. | ГДмини2 |
| do 10 bočica sa 0,5 do 1,5mL | Н.А. | ВиалТвеетер |
| 0.5 до 1.5мЛ | Н.А. | ВиалТвеетер |
| 1 до 500 мл | 10 до 200мЛ / мин | УП100Х |
| 10 до 2000мЛ | 20 до 400мЛ / мин | УП200Хт, УП400Ст |
| 0.1 до 20Л | 0.2 до 4Л / мин | УИП2000хдТ |
| 10 до 100Л | 2 до 10Л / мин | УИП4000 |
| Н.А. | 10 до 100Л / мин | УИП16000 |
| Н.А. | веће | кластер УИП16000 |
Контактирајте нас! / Питајте нас!
Dodatni protokoli za ultrazvučni E. coli Lysis
Allicin-modified Proteins in E. coli using an Ultrasonic VialTweeter
Utvrđivanje Sumfhidetskih sadržaja za 5, 5 ′-Dithiobis (2-nitrobenzoična kiselina) (DTNB) Asreci
Kultura noćenja E. coli MG1655 korišćena je za vakcinu MOPS minimalnog medijuma (1:100). Kultura je uzgajana aerobno dok nije postignut A600 od 0,4. Kultura je podeljena na tri kulture od 15 ml za lečenje stresa. Nelečena kultura poslužila je kao negativna kontrola. 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) ili 1 mM diamide je dodat u jednu od preostale dve kulture svaka. Kulture su inkubirane 15 min. 5 ml svake kulture požnjevene su centrifugacijom (8.525 × g, 4°C, 10 min). Ćelije su oprane dva puta sa 1 ml PBS-a (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, uskladišteno anaerobno pre upotrebe) i centrifugirano (13.000 × g, 4°C, 10 min). Ćelije su ponovo zamenjene u baferu lize (PBS sa 6 mM guanidinium HCl, pH 7.4) pre poremećaja na 4°C ultrazvučno (ВиалТвеетер ultrazvučni, Hielscher GmbH, Nemačka) (3 × 1 min). Krhotine ćelija su pelcovane centrifugacijom (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant je prebačen na 3,5-ml QS-macro cuvette (10 mm) sa magnetnom šipkom za mešanje i pomešan sa 1 ml bafera od lize. Izumiranje uzoraka je praćeno na 412 nm sa Jasco V-650 spektrofotometrom opremljenim držačem ćelija pod kontrolom PSC-718 na sobnoj temperaturi. Dodato je 100μl rastvora ditiobisa od 3 mM(2-nitrobenzoinska kiselina). Izumiranje je praćeno dok nije dostiglo zasićenje. Izračunavanje koncentracije tiola izvršeno je korišćenjem koeficijenta izumiranja ε412 = 13.700 M-1 Cm-1 za thio-2-nitrobenzske kiseline (TNB). Mobilna etiol koncentracija je izračunata na osnovu obima E. kola ćelija od 6,7 × 10-15 litar i gustina ćelije A600 = 0,5 (ekvivalentno 1 × 108 ćelije ml-1 kulture). (Müller et Al. 2016)
In Vivo Glutathione Determination using an Ultrasonic Cell Crusher
E.coli MG1655 je uzgajan u MOPS minimalnom medijumu u ukupnom obimu od 200ml dok nije postignut A600 od 0,5. Kultura je podeljena na 50-ml kultura za lečenje stresa. Nakon 15 min inkubacije sa 0,79 mM allicin, 1 mM diamide, ili dimetil sulfoksid (kontrola), ćelije su požnjevene na 4.000g na 4°C za 10 min. Ćelije su dva puta oprane KPE baferom pre ponovne resuspenzije kuglica u 700μl KPE bafera. Za deproteination, 300l od 10% (w/v) sulfosalicylic acid je dodato pre prekidanja ćelija ultrazvučnošću (3 x 1 min; ВиалТвеетер ultrasonicator). Supernatansi su prikupljeni nakon centrifugacije (30 min, 13, 000g, 4 ° c). Sulfosalicylic kiselinski koncentraciju smanjen je na 1% uz dodatak 3 volumene KPE bafera. Merenja totalne glutatione i GSSG su izvršene kao što je gore opisano. Koncentracija "Mobilna glutationa" se obračunava na osnovu obima E. kola ćelija 6,7×10-15 litar i gustinu ćelije A600 0,5 (ekvivalentno 1×108 ćelije ml-1 kulture). Koncentracija GSH obračunala je rashodima 2 [GSSG] od ukupne glutatione-a. (Müller et Al. 2016)
Expression of Human mAspAT in E. coli using an Ultrasonic Homogenizer
Jedna kolonija E. kola BL21 (DE3) je najdosadna od vektora za izraz u 30 mL "Vreja-Bertani (LB)" koji sadrži 100μg/mL ampicilin, a zatim se kultivisao na 37 º C do optičkog gustine (OD600) dostigao je 0,6. Ove ćelije su bile sapune ventilacije na 4.000 × g za 10 min, a ponovo se završilo u 3L svežoj srednje od 100gr/mL ampicilin.
Naknadno je proteinski izraz indukovan sa 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalactopyranoside (IPTG) za 20 h na 16ºC. Ćelije su požnjevene centrifugacijom na 8.000 × g za 15 min i oprane tamponom A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Približno 45g (vlažne težine) ćelija dobijeno je iz 3 L kulture. Nakon centrifugacije, ćelijske kuglice su ponovo zamenjene u 40 mL (za 1 L kulturu) bafer za ekstrakciju leda A, i lisnate ultrazvučno na ledenoj temperaturi koristeći Hielscher ultrazvučnu ćeliju crusher UP400St. Ćelijska liza je centrifugirala na 12.000 rpm za 15 min da bi se razdvojili rastvorljivi (supernatantni) i prenagljeni (pelet) razlomci. (Jiang et al. 2015)
Чињенице вреди знати
Е. цоли
Escherichia kola (E. kola) je gram-negativna, fasadna, podna, u obliku rod, koliform bakterijum Genus Esčerichije koji se najčešće nalazi u donjem cremu toplih i endoorganizama (endoskopi). Postoji veliki broj E. kola vrste (ili podtipova) sa različitim karakteristikama. Većina E. kola ih je bezopasna za ljude, npr. B i K-12 vrste koje se obično koriste za istraživačke aplikacije u laboratorijama. Međutim, neke vrste su štetne i mogu izazvati ozbiljnu bolest.
E. kola igra važnu ulogu u modernom biološkom inženjerstvu i industrijskoj mikrobiologiji, s obzirom da je bakterije lako manipulisati. Uobičajene laboratorijske aplikacije koje često uključuju upotrebu E. kola, na primer, za stvaranje recombinant deoksidyribonukleske kiseline (DNK) ili da deluju kao model organizma.
E. kola je veoma raznovrstan domaćin za proizvodnju heterolognih proteina, a sistem za izražavanje i višestruki protein je dostupan za proizvodnju recombinant proteina u E. kola. Upotrebom plazmida koji dozvoljavaju izražavanje izrazavanja na visokom nivou proteina, geni mogu da se uvedu u bakterije, što omogućava proizvodnju takvih proteina u velikim količinama u procesima industrijske fermentacije.
E.coli se koristi kao fabrika ćelija za proizvodnju insulina. Dalje primene uključuju upotrebu modifikovanih ćelija ešerihije koli za razvoj i proizvodnju vakcina i nepokretnih enzima, za proizvodnju biogoriva, kao i za bioremediju.
"Virus K-12" je mutant oblik E. kola koji je iznad-izražava enme Alkaline Fosinhatase (ALP). Ovo mutacije se javlja zbog kvara u genu koji konstantno kodove za enme. Ako Džin proizvodi proizvod bez ikakvih inhibiranja, to je poznato kao konstitutivnih aktivnosti. Ovaj specifični mutant obrazac se koristi za izolaciju i pročišćavanja ALP enme.
Bakterije ešerihije koli se takođe široko koriste kao fabrike ćelija. Projektovani mikrobi (npr. bakterije) i biljne ćelije mogu se koristiti kao takozvane ćelijske fabrike. Ove genetski modifikovane ćelije proizvode molekule, hemikalije, polimere, proteine i druge supstance, koje se koriste na primer u farmaceutskoj, prehrambenoj i hemijskoj industriji. U cilju oslobađanja molekula proizvedenih u unutrašnjosti takvih bioinženjering ćelija, ultrazvučna liza je uobičajena metoda da se poremete zidovi ćelija i da se ciljne supstance prebace u okolnu tečnost. Pročitajte više o lizi bioinženjering ćelija!
Ултразвучни ДНА Схеаринг
Ultrazvučne čaršije su uobičajena metoda za oslobađanje molekula, organela i proteina iz unutrašnjosti ćelije, kao i za razbijanje DNK pramenova na komade. Akustična kavitacija razbija zidove ćelija i membrane kako bi izvukla DNK iz ćelija i generisala fragmente od oko 600 – 800 BP, koja je idealna za analizu.
Kliknite ovde da saznate više o ultrasonični homogeneri za fragmentaciju DNK!
Literatura/reference
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi od Лаб до industrijske veličine.