Hielscher ultrazvučna tehnologija

Ултразвучно Лиза Е. Цоли

  • E. kola bakterije su najčešće korišćene bakterije u mikrobiologiji i biotehnologiji.
  • Ultrasonični razarači ćelija dostavljaju pouzdane i reproduktivne rezultate za lysis E. kola.
  • Intenzivan i precizno kontrolisano kavitaciju i šinskih snaga rezultira potpunim poremećajama i velikim princima za vađenje (npr. proteine, DNA).

Prekid ćelije kavitacijom

Esčerichia kola bakterije su pouzdano i koriste se sa ultrasonovim homogenerima.Ultrazvučni (ultrasonični) se bave i sa oko 20.000 ciklusa u sekundi (na 20kHz) i izazivaju kavitaciju tečnosti ili supulzije. Akustične kavitacije mikroskopski oblasti pritisaka vakuuma i visokih temperatura koje rušaju ćelije. Iako temperature mogu dostići nekoliko hiljada stepeni Celzijusa, Kavitacija je tako mala da ne zagrevaju proces znatno. Ultrazvuk je generisala akustične kavitacije i šelarne snage koje su probušile ili slome ćeliju od E. kola – u zavisnosti od postavke uređaja za ultrasonični homogenator.

Prednosti Ultrasonne Lizze

  • precizna kontrola Lyze (intenzitet, pojačina, temperatura)
  • optimalna prilagodjenja za određene uzorke
  • контрола температуре
  • za veoma male uzorke (μL do litara)
  • čist mehanički tretman
  • Linearna razmera-od laboratorije do proizvodnje
Ultrasonični Vialvajeter omogućava simultano Pripremanje uzorka do 10 viala pod istim uslovima procesa. (Kliknite da biste uvećali!)

ВиалТвеетер za ultrasonični tekstis

Захтев за информације




Obratite pažnju na naše Правила о приватности.


Mada hemijski i enzeptični tekstovi mogu biti problematični – s obzirom da hemijska lajsis može da izmeni proteine i uvede probleme sa pročišćavanje i enmatic lysis zahteva dugo vreme inkubacije i ne može se preproduktiviti – ultrasonični poremećaj je sofisticirani, brz metod prekida ćelije.
Ultrasonični tekstis je zasnovan samo na mehaničkim snagama. Hemikalije se ne dodaju, sonovi razbija ćelijski zid od šelarne snage. Hemijski tekstovi mogu da promene strukturu proteina i uvedu probleme sa pročišćavanja. enmatic poremećaj zahteva duge inkubacije i nije moguće ponovo da se proizvodi.

Opšte preporuke

UP400St ultrasonicator sa reaktoromSoniranost je najpopularnija tehnika za otpevavanje veoma malih, srednjih i velikih količina u ćelijama – od Pico do 100L/hr (korišćenjem ultrasonove ćelije toka). Ćelije se nalaze u vidu tečnih šinskih i Kavitacija. DNK je takođe u Soniji, tako da nije potrebno dodati DNase u ćelijske suspenzije.
Kontrola temperature:
Prehladjenje uzorka i zadržavanje uzorka tokom sonacija na ledu, uzorak toplotne degradacije uzorka može lako da se spreči.
U idealnom slučaju, uzorci bi trebalo da se čuvaju na ledu tokom Lajze, ali za većinu uzoraka je dovoljno da se temperatura ne uzdigne iznad temperature kulture ili izvora tkiva. Zato se preporučuje da se obustavi suspenzija na ledu i da se na njoj nalazi nekoliko kratkih ultrasoničara od 5-10 sec i pauzira 10-30 sec. Tokom pauzacije, toplota se može prebiti u cilju ponovnog uspostavljanja niske temperature. Za veće uzorke ćelija, dostupni su različiti reaktori u ćelijama sa rashladnim jakni.

Protokoli pripreme E. kola Lajsates

Analiza izražavanja i pročišćavanje recombinant proteina

E. kola pelet je bio sa ultrasonnim sistemom УП100Х (Hielscher). U ovu svrhu, pelet ćelije se ponovo završio u chiletenom limfom baferu (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) i ohladila se na ledu za 10 min. Nakon toga, suspenzija ćelije je sa 10 kratkih 10, a zatim i intervala od 30 s za hlađenje. Konačno, ostaci ćelije su uklonjeni sa ultracentrifugacijom na 4 ° c na 15 min u 14000 RPM. Za potvrdu o rPR izrazu, supernatant je bio pokrenut na 12% poliakrylamide gel i analiziran od strane SDS-a i zapada. Čišćenje rPR-a je urađeno sa ni2 +-NTa smole (Invitrogen, sad) prema vodiču proizvođača. U ovoj fazi je korišćen metod kreiranja matičnog metoda. Čistoća perificirana proteina ocenjena je upotrebom elektrofosresa na 12% poliakrylamidovog gela, a potom i od plavog dela. Prečišćena koncentracija proteina merila je mikro BCA proteina asizgovorite (Pirs, sad). (Azarnezhad et Al. 2016)

Ultrazvučna ćelija ultrasonator UP100H (100W) za Lyze, prekid ćelije i okiranje DNK.

Ultrasonični homogenizer УП100Х 100W

Rast ćelija, hod po žici i priprema E. kola ćelije

Za SeqA i RNA polimerase ChIP-Chip E. kola MG1655 ili MG1655 ΔseqA je porastao na 37 ° c OD600 od oko 0,15 u 50 ml LB (+ 0,2% gluose) pre 27 μl od formaldehida (37%) po ml mediju (konačna koncentracija 1%). Na temperaturi (100 RPM) je nastupao na sporoj prostoriji za 20 min, a zatim i 10 ml 2,5 M glycine (završna koncentracija 0,5 M). Za eksperimente OD toplote, E. kola MG1655 je porastao u 65 ml LB Medium na 30 ° c do a OD600 od oko 0,3. Tada je 30 ml kulture prebačeno na prevrtan pljosku na 43 ° c, a ostatak držao na 30 ° c. Na neki način je opisan iznad svega što su ćelije zadržale u 30 ili 43 ° c, pre nego što se dalje sporo trese na sobnoj temperaturi. Ćelije su prikupljane centrifugalizacijom i oprane dvaput sa hladnim TBS (pH 7,5). Nakon ponovnog uspivanja u 1ml tampon bafera (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sučrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozyme) i Inkubacija na 37 ° c za 30 min, a uz dodatak 4 ml IP bafera, ćelije su bile sonirane na ledu sa 12 puta 30 sekundi i 30 sec na na УП400Ст ultrasonični procesor (Hielscher Ultrasonics GmbH) sa 100% energije. Nakon centrifugacije za 10 min u 9000 g, 800 μl alinavodnike iz supernatanta je pohranjena na-20 ° c. (Waldminghaus 2010)

Preprodukcija i čišćenje enzima.

Za preproizvodnju dekahistidine (His10)-Tagged proteina, E. kola BL21 (DE3) je transformisan sa pET19b konstrukcionom. Prekultura je bila na probi od strane centrifugacije, a 1% je korišćeno za neokiranje izraženih kultura. Ćelije sa pET19mgtB su porasle na 22 ° c do optičkog gustina u 600 Nm (OD600) od 0,7. Kultura je prebačena na 17 ° c, a prouzrokovala je 100 μM IPTG. Posle 16 h, kultura je bila na 7.500 × g na 4 ° c. Ćelije su ponovo završene u 50 mM fosfata-baferane uradiš (JRS) sa 0,3 M NaCl na pH 7,4 i poremećeno ultrasonovom sa S2 mikro-tipom УП200Ст ultrasonator (Hielscher, telo, Nemačka) u ciklusu 0,5 i 75%.
Preprodukcija dekahistidina-Tagged GtfC je prouzrokovana na 37 ° c OD600 od 0,6 sa 100 μM IPTG. Ćelije su zatim bile inkubirane za 4 h, koji su se, na primer, opisani kao gorenavedeni za MgtB.
Ekstrakti sirove ćelije su centrifugirani na 15.000 × g i 4 ° c da bi se zavetili ostaci ćelije. Razjašnjene ekstrakte su učitane na 1-ml HisTrap f sirovim kolonama koristeći sistem ÄKTAprime plus (GE). Enzima je bila prečišćena u skladu sa protokolom proizvođača zbog preliva od njegovih označenih proteina. Elblaženi protein rešenja su dva puta na 1.000 od 50 mM JRS, pH 7,4, sa 0,3 M NaCl na 4 ° c. Čišćenje je analizirala 12% SDS-stranica. Koncentracija proteina je utvrđena Bradford metodom koristeći Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruon, Nemačka). (Rabausch et Al. 2013)

Vađenje proteina iz E. kola bakterija
Mamac proteina interesa (u ovom slučaju, MTV1 Arabidopis thaliana) se koristi za GST i izražava se u BL21 Esčerichia kola (E. kola) ćelije.
1. Uzmite jedan pelet GST-MTV1 i GST (koji odgovara 50 ml bakterijske kulture) i ponovo se prijavite u 2,5 mL baferu hladnog ekstrakta.
2. upotreba ultrasonicatora УП100Х (opremljena MS3 Micro-sonotom za male volumene (2-5mL)) da bi se poremetili bakterijske ćelije dok se ne smanje, što je označeno smanjenom netransparentijom i povećanom viskozitetom. Ovo mora biti izvršeno na ledu, a preporučuje se da se u intervalima (npr. 10 sekundi prati 10 sekundi na ledu i tako dalje). Briga mora se preduzeti da se ne Sonne sa previsokim intenzitetom. Ako se detektuje ili se formira neka bela padavina, intenzitet mora biti smanjen.
3. prenesite na 1,5 mL microcentrifuge tube i centrifugi na 4 ° c, 16.000 x g za 20 min.

Alličin-modifikovane belančevine u E. kola

Vialvajer je udoban ultrasonator za malu homogenizacijuUtvrđivanje Sumfhidetskih sadržaja za 5, 5 ′-Dithiobis (2-nitrobenzoična kiselina) (DTNB) Asreci
E. kola MG1655 preko noći kultura je bila iskorišćena za neokoraciju MOPS minimalne srednje (1:100). Kultura je porasla aerobically sve dok se ne postigne A600 od 0,4. Kultura je bila podeljena na 3 15-ml kultura za stres tretman. Netretirana kultura služila je kao negativna kontrola. 0,79 mM alličin (128 μg ml-1) ili 1 mM diamide je dodat u jednu od preostale dve kulture. Kulture su bile inkubirane za 15 min. 5 ml svake kulture bio je namenjen centrifugacijom (8.525 × g, 4 ° c, 10 min). Ćelije su oprane dva puta sa 1 ml JRS (137 mM, a 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, uskladišten anaerobically pre upotrebe) i centrifugirane (13.000 × g, 4 ° c, 10 min). Ćelije su ponovo završene u tampon baferu (JRS sa 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) pre poremećaja na 4 ° c, uz ultrazvučne (ВиалТвеетер ultrasonicator, Hielscher GmbH, Nemačka) (3 × 1 min). Olupina ćelija je bila peletovana od strane centrifugacije (13.000 × g, 4 ° c, 15 min). Supernatant je prebačen na 3,5-ml QS-makro cuvette (10 mm) sa magnetnom trakom za mešanje i pomešana sa 1 ml bafera lysis. Izumiranje uzoraka nadgledalo se na 412 Nm-a sa Jaskom V-650 Spektrofotometar 718 opremljenom nosom (Jaskom) na sobnoj temperaturi. 100 μl of 3 mM dithiobis (2-nitrobenzoic kiselina) je dodato rešenje. Istrebljenje je nadgledan dok ne dostigne zasićenost. Kalkulacija thiol koncentracije izvršena je upotrebom koeficijenta za nestanak ε412 = 13.700 M-1 Cm-1 za thio-2-nitrobenzske kiseline (TNB). Mobilna etiol koncentracija je izračunata na osnovu obima E. kola ćelija od 6,7 × 10-15 Litar i gustina ćelije600 = 0,5 (ekvivalentno sa 1 × 108 ćelije ml-1 kulture). (Müller et Al. 2016)

U pogledu odlučnosti Vive Glutatione

E. kola MG1655 je porastao u MOPS minimalnim srednjim u ukupnoj količini od 200ml do600 od 0,5. Kultura je bila podeljena na 50-ml kultura za stres tretman. Nakon 15 min inkubacije sa 0,79 mM alličinom, 1 mM diamide, ili dimetyl sulfokid (kontrola), ćelije su bile na 4, 000g na 4 ° c za 10 min. ćelije su oprane dvaput sa KPE bafera pre ponovnog isimanja Peleta u 700 μl od KPE bafera. Za deprotetaminaciju, 300l od 10% (w/v) sulfosalicylic kiselina je dodana pre Razlomila ćelija (3 x 1 min; ВиалТвеетер ultrasonicator). Supernatansi su prikupljeni nakon centrifugacije (30 min, 13, 000g, 4 ° c). Sulfosalicylic kiselinski koncentraciju smanjen je na 1% uz dodatak 3 volumene KPE bafera. Merenja totalne glutatione i GSSG su izvršene kao što je gore opisano. Koncentracija "Mobilna glutationa" se obračunava na osnovu obima E. kola ćelija 6,7×10-15 Litar i gustina ćelije600 0.5 (ekvivalentno sa 1×108 ćelije ml-1 kulture). Koncentracija GSH obračunala je rashodima 2 [GSSG] od ukupne glutatione-a. (Müller et Al. 2016)

Ultrasonični razarač za ćelijsku litis i vađenje biološkog materijala (kliknite da biste povećali!)

Ultrasonicator u tipu istrage УП400Ст

Izraz ljudskog Masova u E. kola

Ultrasonijski razarač ćelija (400W) za vađenje intraćelijske materije (npr. proteine, organelles, DNK, RNA itd.)Jedna kolonija E. kola BL21 (DE3) je najdosadna od vektora za izraz u 30 mL "Vreja-Bertani (LB)" koji sadrži 100μg/mL ampicilin, a zatim se kultivisao na 37 º C do optičkog gustine (OD600) dostigao je 0,6. Ove ćelije su bile sapune ventilacije na 4.000 × g za 10 min, a ponovo se završilo u 3L svežoj srednje od 100gr/mL ampicilin.
Nakon toga, izraz proteina je imao 1 mM isoproyl β-ᴅ -1-thiogalactopyranoside (IPTG) za 20 h na 16 º C. Ćelije su bile isprostrane centrifugale u 8.000 × g za 15 min i oprane sa tampon A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Približene 45g (vlažne težine) ćelije su dobijene iz 3 L kulture. Nakon centrifugacije, ćelijske pelene su završene u 40 mL (za 1 L Culture) led-hladna bafer A i otrezan od ultrasoncije na ledu-hladnoj temperaturi pomoću УП400Ст instrument (Dr Hielscher GmbH, Nemačka). Ćelija sa Limom je bila centrifugovana u 12.000 RPM za 15 min, da bi se odvojio rastvorljiv (supernatant) i izbile (peletirane) frakcije. (Jiang et Al. 2015)

Табела испод показује приближни капацитет обраде наших ултразвучних уређаја:

батцх tom Проток Препоручени уређаји
0.5 до 1.5мЛ Н.А. ВиалТвеетер
1 до 500 мл 10 до 200мЛ / мин УП100Х
10 до 2000мЛ 20 до 400мЛ / мин УП200Хт, УП400Ст
0.1 до 20Л 0.2 до 4Л / мин УИП2000хдТ
10 до 100Л 2 до 10Л / мин УИП4000
Н.А. 10 до 100Л / мин УИП16000
Н.А. веће кластер УИП16000

Контактирајте нас! / Питајте нас!

Молимо вас да користите образац испод, ако желите да затражите додатне информације о ултразвучној хомогенизацији. Биће нам драго да вам понудимо ултразвучни систем који одговара вашим захтевима.









Molimo vas da zabeležite naše Правила о приватности.


Литература / Референце



Чињенице вреди знати

Е. цоли

Escherichia kola (E. kola) je gram-negativna, fasadna, podna, u obliku rod, koliform bakterijum Genus Esčerichije koji se najčešće nalazi u donjem cremu toplih i endoorganizama (endoskopi). Postoji veliki broj E. kola vrste (ili podtipova) sa različitim karakteristikama. Većina E. kola ih je bezopasna za ljude, npr. B i K-12 vrste koje se obično koriste za istraživačke aplikacije u laboratorijama. Međutim, neke vrste su štetne i mogu izazvati ozbiljnu bolest.
E. kola igra važnu ulogu u modernom biološkom inženjerstvu i industrijskoj mikrobiologiji, s obzirom da je bakterije lako manipulisati. Uobičajene laboratorijske aplikacije koje često uključuju upotrebu E. kola, na primer, za stvaranje recombinant deoksidyribonukleske kiseline (DNK) ili da deluju kao model organizma.
E. kola je veoma raznovrstan domaćin za proizvodnju heterolognih proteina, a sistem za izražavanje i višestruki protein je dostupan za proizvodnju recombinant proteina u E. kola. Upotrebom plazmida koji dozvoljavaju izražavanje izrazavanja na visokom nivou proteina, geni mogu da se uvedu u bakterije, što omogućava proizvodnju takvih proteina u velikim količinama u procesima industrijske fermentacije.
E. kola se koriste kao fabrike ćelija za proizvodnju insulin. Dodatne aplikacije uključuju upotrebu modifikovane E-kola ćelije za razvoj i proizvodnju vakcina i immobiliranog enzima, za proizvodnju bioloških goriva, kao i za bioremedijacije.
"Virus K-12" je mutant oblik E. kola koji je iznad-izražava enme Alkaline Fosinhatase (ALP). Ovo mutacije se javlja zbog kvara u genu koji konstantno kodove za enme. Ako Džin proizvodi proizvod bez ikakvih inhibiranja, to je poznato kao konstitutivnih aktivnosti. Ovaj specifični mutant obrazac se koristi za izolaciju i pročišćavanja ALP enme.

Ултразвучни ДНА Схеаринг

Ultrasonični sila se najčešće koristi da bi se odvojio od ćelije i razbilo u komadiće DNK. Akustična Kavitacija razbija zid ćelije i potice da bi izdvojili DNK iz ćelija i generisali delove od oko 600 – 800 BP, koja je idealna za analizu.
Kliknite ovde da saznate više o ultrasonični homogeneri za fragmentaciju DNK!