Protocol for SARS-CoV-2 Coronavirus Inactivation with Sonication

Hielscher VialTweeter je jedinstvena ultrazvučna jedinica za pripremu više uzoraka, koja se koristi za aktiviranje koronavirusa SARS-COV-2. VialTweeter omogućava da se istovremeno pripremi do 10 uzoraka bočica i time je idealna jedinica za masovnu obradu uzoraka.

Inactivation of the SARS-CoV-2 Coronavirus with the VialTweeter

Nakon uklanjanja fiksnog, monolajeri su tri puta oprani linijom sa fosfatom (PBS) pre struganja ćelija u 1mL MEM/5% FBS i sonični (3 × 10 sekundi na, 10 sekundi isključeni na 100% snage i amplitude) koristeći Hielscher ultrazvučni procesor UP200St sa Vialvajeter Prilog. Supernaganti su razjašnjeni centrifugiranjem na 3000 × g za 10 min. 

Kompletan protokol pročitajte ovde za inaktivaciju SARS-CoV-2 koronavirusa od strane Welch et al. (2020) u nastavku:

Ćelije i virusi

Ćelije Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) su bili kulturni u modifikovanom Eagle-ovom minimalnom esencijalnom medijumu (MEM) dopunjenom sa 10% (v/v) fetalnog telećeg seruma (FCS). Virus koji se koristio bio je SARS-CoV-2 soj hCOV-19/Engleska/2/2020, izolovan od strane PHE iz prvog klastera pacijenata u Velikoj Britaniji 29.01.2020. Ovaj virus je nabavljen u prolazu 1 i korišćen je za studije inaktivacije pri prolazu 2 ili 3.
Za reagense i hemikalije koje se koriste za neaktivaciju SARS-CoV-2 kao i uklanjanje reagensne citotoksičnosti pogledajte naučni izveštaj Welch et al. (2020).

Neaktivacija virusa pomoću deterdžeta – SARS-CoV-2 Coronavirus Inactivation protocol by Welch et al. 2020

Neaktivnost SARS-CoV-2

Za komercijalne proizvode, preparate za viruse (tečnost za kulturu tkiva, titrači u rasponu od 1 × 10⁶ do 1 × 10⁸ PFU/ml) su tretirani u triplici sa reagensima u koncentracijama i za vreme kontakta preporučeno u uputstvima proizvođača za upotrebu, gde su dostupni, ili za koncentracije i vremena posebno tražena testiranjem laboratorija. Tamo gde je proizvođač dao niz koncentracija, testiran je najniži odnos proizvoda prema uzorku (npr. najniža preporučena koncentracija test proizvoda). Reagensi cevi za transport uzoraka testirani su koristeći odnos jedne zapremine tečnosti kulture tkiva na deset volumena reagensa, osim ako proizvođač nije precizirao odnos količine uzorka tečnosti prema reagensu. Deterdženti, fiksativi i rastvarači testirani su u naznačenim koncentracijama za naznačena vremena. Svi koraci neaktivacije izvedeni su na ambijentalnom sobnom nivou (18 – 25°C). Za testiranje alternativnih tipova uzoraka, virus je bio začinjen naznačenom matricom uzorka u odnosu 1:9, a zatim tretiran test reagensima kao gore. Svi eksperimenti su uključivali triplikatne kontrolne uzorke tretirane podsmešljivim uzorcima sa ekvivalentnim obimom PBS-a umesto test reagensa. Odmah nakon potrebnog vremena kontakta, obrađeno je 1mL tretiranog uzorka pomoću odgovarajuće izabrane matrice filtracije. Uklanjanje reagensa za testiranje inaktivacije izvršeno je u većem formatu spin stuba pomoću Pirs 4mL deterdženta za uklanjanje spin stubova (Termo Fišer), ili popunjavanjem praznih Pirs 10mL kapaciteta centrifuge stubova (Termo Fišer) sa SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR ili Sephadex LH-20 da bi dali 4mL pakovanje Za pročišćenje pomoću Amicon filtera, 2 × 500μl uzoraka je pročišćeno pomoću dva centrifugalna filtera metodom koja je prethodno opisana, a zatim udružena. Za formaldehyde i formaldehyde sa uklanjanjem glutaraldehyde, jedan filter je korišćen sa 1× 500μl uzorka volumena, ponovo je zamenjen nakon obrade u 500μl PBS, i dodat na 400ul MEM/5% FBS. Za neaktivnost zaraženih monolajeri, 12,5 cm² pljoske ćelija Vero E6 (2,5 × 10⁶ cells/flask in 2.5mL MEM/5% FBS) were infected at MOI 0.001 and incubated at 37°C/5% CO₂ 24 sata. Supernatant je uklonjen, a ćelije fiksirane pomoću 5mL formaldehyde, odnosno formaldehyde i glutaraldehyde na sobnoj temperaturi 15 ili 60 min. Fiksator je uklonjen, a monolajeri su tri puta oprani PBS-om pre struganja ćelija u 1mL MEM/5% FBS i sonični (3 × 10 sekundi na, 10 sekundi isključeni na 100% snage i amplitude) koristeći UP200St sa VialTweeter prilogom (Hielscher Ultrasound Technology). Supernaganti su razjašnjeni centrifugiranjem na 3000 × g za 10 min.

Details of the reagent used for SARS-CoV-2 coronavirus inactivation with the ultrasonic VialTweeter according to the protocol by Welch et al. 2020

Kompletan protokol uključujući i upotrebu Hielscher VialTweetera možete pogledati ovde:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofisticirani ultrazvučni dismebratori i poremećaji ćelija

Ultrazvučni ultrazvuk sa više uzoraka VialTweeter je samo jedno od mnogih ultrazvučnih rešenja za pripremu uzoraka u biološkim, biohemijskim i kliničkim laboratorijama. Hielscher Ultrasonics nudi idealan ultrazvučni dismebrator za vašu primenu, npr. ćelijsku lizu, vađenje ćelija, homogenizaciju tkiva, razrešavanje, degazaciju uzoraka itd.
Javite nam koliko uzoraka morate da obradite po satu i danu, ako više volite direktnu ili indirektnu sonikaciju i koja je meta ultrazvučnog uzorka tretmana. Preporučićemo vam najpogodniju ultrazvučnu jedinicu za vašu svakodnevnu radnu rutinu!
Digitalni ultrazvučni procesori Hielscher Ultrasonics opremljeni su pametnim softverom, automatskim snimanjem podataka, lakim opcijama pre podešavanja kontrole temperature, trajanjem sonication- a, ciklusom/pulsnim režimom kao i osvetljenjem uzoraka i daljinskim upravljačem pregledača. Nastojimo da naši ultrazvučni uređaji budu što pametniji kako bi vaša istraživačka i radna rutina postala što povoljnija i uspešnija.
Kliknite ovde da biste pronašli još aplikacija uključujući protokole ultrazvučnog uzorka preparata sa VialTweeter-om!