Ултразвучна лиза биоинжењерски модификованих ћелија у индустријској производњи

Биоинжењерски модификоване врсте бактерија, као што је E. coli, као и генетички модификовани типови ћелија сисара и биљака, широко се користе у биотехнологији за експресију молекула. За ослобађање ових синтетисаних биомолекула потребна је поуздана техника разарања ћелија. Ултразвучна обрада високих перформанси доказана је метода за ефикасну и поуздану лизу ћелија – која се лако може скалирати за велики обим обраде. Hielscher Ultrasonics вам нуди ултразвучну опрему високих перформанси за делотворну лизу ћелија ради производње великих количина висококвалитетних биомолекула.

Екстракција молекула из ћелијских фабрика

За производњу широког спектра биомолекула, различити модификовани микроорганизми и биљне ћелије могу се користити као микробне ћелијске фабрике, укључујући Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana и алге, између многих других. Ове ћелијске фабрике могу да производе протеине, липиде, биохемијска једињења, полимере, биогорива и олеохемикалије, који се користе као храна или сировине за индустријску примену. Ћелије које се користе као ћелијске фабрике узгајају се у затвореним биореакторима, где могу да постигну високу ефикасност и специфичност уз мале енергетске потребе.
Да би се циљни молекули изоловали из биоинжењерски модификованих ћелијских култура, ћелије се морају разорити како би се ослободио унутарћелијски материјал. Ултразвучни разарачи ћелија добро су утврђени као веома поуздана и ефикасна техника за дезинтеграцију ћелија и ослобађање једињења.

Микробне ћелијске фабрике су ћелије модификоване метаболичким инжењерством које се користе за синтезу различитих вредних једињења. Ултразвучно разарање ћелија је ефикасна и поуздана метода за ослобађање вредних једињења из унутрашњости ћелије.
студија и графички приказ: ©Villaverde, 2010.

Предности ултразвучних разарача ћелија

Као нетермичка, блага, а ипак веома ефикасна технологија, ултразвучни разарачи користе се у лабораторији и индустрији за лизу ћелија и производњу висококвалитетних екстраката, нпр. за изоловање молекула из ћелијских фабрика.

Ултразвук велике снаге за ефикасно разарање микробних ћелијских фабрика

Механизам и ефекти ултразвучних разарача ћелија:
Ултразвучно разарање ћелија користи снагу ултразвучних таласа. Ултразвучни хомогенизатор / разарач ћелија опремљен је сондом (познатом и као сонотрода) израђеном од легуре титанијума, која осцилује на високој фреквенцији од приближно 20 kHz. То значи да ултразвучна сонда преноси 20.000 вибрација у секунди у течност која се обрађује ултразвуком. Ултразвучне таласе пренете у течност карактеришу наизменични циклуси високог / ниског притиска. Током циклуса ниског притиска, течност се шири и настају сићушни вакуумски мехурићи. Ови веома мали мехурићи расту током неколико наизменичних циклуса притиска све док више не могу да апсорбују енергију. У том тренутку кавитациони мехурићи силовито имплодирају и локално стварају средину са изузетно високом густином енергије. Ова појава позната је као акустична кавитација и карактеришу је локално веома високе температуре, веома високи притисци и силе смицања. Ови смичући напони ефикасно разарају ћелијске зидове и повећавају пренос масе између унутрашњости ћелије и околног растварача. Као потпуно механички поступак, примена ултразвучно генерисаних сила смицања широко је распрострањена и препоручује се за разарање бактеријских ћелија, као и за изолацију протеина. Као једноставна и брза метода разарања ћелија, соникација је идеална за изолацију у малим, средњим и великим запреминама. Дигитални ултразвучни уређаји компаније Hielscher опремљени су прегледним менијем подешавања за прецизну контролу соникације. Сви подаци о соникацији аутоматски се чувају на уграђеној SD картици и лако су доступни. Напредне могућности одвођења топлоте, као што су спољашње хлађење, соникација у пулсном режиму итд., током процеса ултразвучне дезинтеграције обезбеђују одржавање идеалне процесне температуре, а тиме и очуваност екстрахованих једињења осетљивих на топлоту.

Истраживања истичу предности ултразвучног разарања ћелија и екстракције

Проф. Chemat и сарадници (2017) у својој студији закључују да је „екстракција потпомогнута ултразвуком еколошки прихватљива и економски исплатива алтернатива конвенционалним техникама за храну и природне производе. Главне предности су скраћење времена екстракције и обраде, смањење количине утрошене енергије и растварача, броја јединичних операција и CO₂ емисија.”
Gabig-Ciminska и сарадници (2014) у својој студији користили су хомогенизатор високог притиска и ултразвучни дезинтегратор ћелија за лизу спора ради ослобађања ДНК. Упоређујући обе методе разарања ћелија, истраживачки тим закључује да је, у погледу лизе ћелија ради добијања ДНК из спора, „анализа спроведена коришћењем ћелијских лизата добијених хомогенизацијом под високим притиском. Након тога смо увидели да ултразвучно разарање ћелија има изузетне предности за ову намену. Прилично је брзо и може се применити на мале запремине узорака.” (Gabig-Ciminska и сарадници, 2014)

Биомолекули из ћелијских фабрика за производњу хране

Микробне ћелијске фабрике представљају одрживу и ефикасну производну методологију која користи микробне организме за постизање високих приноса метаболита који су им природно својствени и оних који им нису својствени, применом метаболичког биоинжењеринга микроорганизама као што су бактерије, квасци, гљиве итд. Ензими се, на пример, производе у великим количинама помоћу микроорганизама као што су Aspergillus oryzae, гљиве и бактерије. Ти ензими се користе у производњи хране и пића, као и у пољопривреди, биоенергетици и одржавању домаћинства.
Одређене бактерије, као што су Acetobacter xylinum и Gluconacetobacter xylinus, производе целулозу током процеса ферментације, при чему се нановлакна синтетишу поступком изградње од мањих ка већим структурама. Бактеријска целулоза (позната и као микробна целулоза) хемијски је еквивалентна биљној целулози, али има висок степен кристалиничности и високу чистоћу (без лигнина, хемицелулозе, пектина и других биогених компоненти), као и јединствену структуру тродимензионалне (3D) мреже испреплетених целулозних нановлакана. (уп. Zhong, 2020) У поређењу са целулозом биљног порекла, бактеријска целулоза је одрживија, а произведена целулоза је чиста и не захтева сложене кораке пречишћавања. Ултразвучна обрада и екстракција растварачем уз употребу NaOH или SDS (натријум-додецил-сулфата) веома су ефикасне за изоловање бактеријске целулозе из бактеријских ћелија.

Биомолекули из ћелијских фабрика за производњу фармацеутских производа и вакцина

Један од најистакнутијих фармацеутских производа добијених из ћелијских фабрика јесте хумани инсулин. За производњу инсулина применом биоинжењеринга претежно се користе E. coli и Saccharomyces cerevisiae. Пошто биосинтетисани молекули нанометарских димензија имају високу биокомпатибилност, биолошке наночестице као што је феритин пружају предности у бројним применама у биопроизводњи. Поред тога, производња у микроорганизмима модификованим метаболичким инжењерингом често је знатно ефикаснија у погледу остварених приноса. На пример, производња артемизининске киселине, ресвератрола и ликопена повећана је од десет пута до неколико стотина пута и већ је успостављена у индустријским размерама или је у фази развоја ка таквој производњи. (уп. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
На пример, биомолекули нанометарских димензија на бази протеина који имају способност самосклапања, као што су феритин и честице сличне вирусима, посебно су занимљиви за развој вакцина јер опонашају и величину и структуру патогена, а на њиховој површини могу се конјуговати антигени ради подстицања интеракције са имунским ћелијама. Такви молекули се експримирају у такозваним ћелијским фабрикама (нпр. модификованим сојевима E. coli), које производе одређени циљни молекул.

Протокол за ултразвучну лизу E. coli BL21 ради ослобађања феритина

Феритин је протеин чија је примарна функција складиштење гвожђа. Феритин показује обећавајуће могућности као наночестице које се самосклапају у вакцинама, где се користи као носач за испоруку вакцине (нпр. протеина шиљка SARS-Cov-2). Научно истраживање Sun et al. (2016) показује да се рекомбинантни феритин може ослободити у растворљивом облику из Escherichia coli при ниским концентрацијама NaCl (≤50 mmol/L). За експресију феритина у E. coli BL21 и његово ослобађање успешно је примењен следећи протокол. Рекомбинантни плазмид pET-28a/ferritin унет је трансформацијом у сој E coli BL21 (DE3). Ћелије E coli BL21 (DE3) које производе феритин узгајане су у LB хранљивој подлози са 0,5% канамицина на 37°C, а експресија је индукована при OD600 од 0,6 помоћу 0,4% изопропил-β-D-тиогалактопиранозида током 3 сата на 37°C. Коначна култура је затим сакупљена центрифугирањем при 8000g током 10 минута на 4°C, а талог је прикупљен. Затим је талог ресуспендован у LB подлози (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% екстракта квасца)/пуферу за лизу (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) и растворима NaCl различитих концентрација (0, 50, 100, 170 и 300 mmol/L), редом. За лизу бактеријских ћелија примењена је ултразвучна обрада у импулсном режиму: нпр. користећи ултразвучни уређај UP400St при амплитуди од 100% са радним циклусом од 5 секунди УКЉУЧЕНО, 10 секунди ИСКЉУЧЕНО, током 40 циклуса), а затим је извршено центрифугирање при 10 000g током 15 минута на 4°C. Супернатант и талог анализирани су електрофорезом у полиакриламидном гелу са натријум-додецил-сулфатом (SDS-PAGE). Сви гелови обојени натријум-додецил-сулфатом скенирани су скенером високе резолуције. Слике гелова анализиране су помоћу софтвера Magic Chemi 1D. Ради оптималне јасноће, протеинске траке детектоване су подешавањем параметара. Подаци за траке добијени су из три техничка понављања. (уп. Sun и сар., 2016)

Ултразвучни дезинтегратори ћелија за индустријску лизу ћелијских фабрика

Ултразвучна лиза и екстракција представљају поуздан и практичан метод за ослобађање метаболита из ћелијских фабрика, чиме се подржава ефикасна производња циљних молекула. Ултразвучни дезинтегратори ћелија доступни су у величинама од лабораторијских до индустријских, а процеси се могу увећавати потпуно линеарно.
Hielscher Ultrasonics је ваш стручни партнер за ултразвучне дезинтеграторе високих перформанси и има дугогодишње искуство у увођењу ултразвучних система у стоне и индустријске поставке.
Када је реч о софистицираном хардверу и софтверу, системи компаније Hielscher Ultrasonics за разарање ћелија испуњавају све захтеве за оптималну контролу процеса, једноставно руковање и лакоћу коришћења. Купци и корисници Hielscher ултразвучних уређаја цене предност коју пружају Hielscher ултразвучни дезинтегратори ћелија и екстрактори, омогућавајући прецизно праћење и контролу процеса – преко дигиталног екрана осетљивог на додир и даљинског управљања путем прегледача. Сви важни подаци о соникацији (нпр. нето енергија, укупна енергија, амплитуда, трајање, температура, притисак) аутоматски се чувају као CSV датотека на уграђеној SD картици. То помаже у добијању репродуктивних и поновљивих резултата и олакшава стандардизацију процеса, као и испуњавање захтева важеће добре произвођачке праксе (cGMP).
Наравно, Hielscher ултразвучни процесори конструисани су за рад 24/7 под пуним оптерећењем и зато могу поуздано да раде у условима индустријске производње. Захваљујући великој робусности и малим потребама за одржавањем, време застоја ултразвучне опреме је заиста кратко. Функције CIP (чишћење на месту) и SIP (стерилизација на месту) своде напорно чишћење на минимум, нарочито зато што сви делови у контакту са течношћу имају глатке металне површине (без скривених отвора или млазница).

Табела у наставку даје увид у приближан капацитет обраде наших ултразвучних уређаја: