Bioinženjering bakterijske vrste kao što su ešerihija koli kao i genetski modifikovani sisari i tipovi biljnih ćelija koriste se široko u biotehnologiji za izražavanje molekula. Da bi se oslobodili ovi sintetisani bio-molekuli, potrebna je pouzdana tehnika prekida ćelija. Ultrazvučnost visokih performansi je proverena metoda za efikasnu i pouzdanu ćelijsku lizu – lako skalabilan do velikih krozputa. Hielscher Ultrasonics vam nudi ultrazvučnu opremu visokih performansi za efikasnost ćelijske lize u cilju proizvodnje velikih zapremina visokokvalitetnih bio-molekula.

Izvlačenje molekula iz fabrika ćelija

Za proizvodnju širokog spektra biomolekula, razni modifikovani mikrobi i biljne ćelije mogu se koristiti kao fabrike mikrobioloških ćelija, uključujući Ešerihiju koli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana and algae, among many others. Ove ćelijske fabrike mogu da proizvedu proteine, lipide, biohemiju, polimere, biogoriva i oleohemičare, koji se koriste kao hrana ili sirovina za industrijsku primenu. Ćelije koje se koriste kao ćelijske fabrike su kulturne u zatvorenim bioreaktorima, gde mogu da postignu visoku efikasnost, specifičnost i niske energetske zahteve.
Da bi se ciljni molekuli izolovali od bioinženjering ćelijskih kultura, ćelije moraju biti poremećene tako da se intracelularni materijal oslobađa. Ultrazvučni poremećaji ćelija su dobro uspostavljeni kao visoko pouzdana i efikasna tehnika za dezintegraciju ćelija i oslobađanje jedinjenja.

Fabrike mikrobioloških ćelija su metabolički modifikovane ćelije koje se koriste za sintezu različitih vrednih jedinjenja. Prekid ultrazvučnih ćelija je efikasan i pouzdan metod za oslobađanje vrednih jedinjenja iz unutrašnjosti ćelije.
studija i grafika: ©Villaverde, 2010.

Prednosti ultrazvučnih ćelijskih poremećaja

Kao ne-termalna, blaga, a opet visoko efikasna tehnologija, ultrazvučni disruptori se koriste u laboratoriji i industriji za liziju ćelija i za proizvodnju visokokvalitetnih ekstrakata, npr.

Power-Ultrasound for Efficient Disruption of Microbial Cell Factories

Mehanizam i efekti poremećaja ultrazvučnih ćelija:
Prekid ultrazvučnih ćelija koristio je snagu ultrazvučnih talasa. Ultrazvučni homogenizer / ćelijski disruptor opremljen je sondom (aka sonotrode) napravljenom od titanijumske aloje koja oscilira na visokoj frekvenciji oko 20 kHz. To znači da ultrazvučna sonda paruje 20.000 vibracija u sekundi u soničnu tečnost. Ultrazvučni talasi u paru sa tečnošću karakterišu naizmenični ciklusi visokog pritiska / niskog pritiska. Tokom ciklusa niskog pritiska, tečnost se širi i izbijaju minuti vakuumskih mehurića. Ovi veoma mali mehurići rastu tokom nekoliko naizmeničnih ciklusa pritiska dok ne mogu da apsorbuju dalju energiju. U ovom trenutku, mehurići kavitacije se nasilno implodiraju i stvaraju lokalno izvanredno energetski gusto okruženje. Ovaj fenomen je poznat kao akustična kavitacija i karakterišu ga lokalno veoma visoke temperature, veoma visoki pritisci i sile. Ovi šear stresovi razbijaju efikasno zidove ćelija i povećavaju masovni prenos između unutrašnjosti ćelije i okolnog rastvaračem. Kao čisto mehanička tehnika, ultrasonično generisane špargle se široko koriste i preporučena procedura za poremećaj bakterijskih ćelija, kao i za izolaciju proteina. Kao jednostavan i brz metod prekida ćelija, sonicija je idealna za izolaciju malih, srednjih i velikih volumena. Hielscherovi digitalni ultrazvučni uređaji opremljeni su jasnim menijem podešavanja za preciznu soničnu kontrolu. Svi podaci o sonikaciji se automatski skladište na ugrađenoj SD kartici i jednostavno su dostupni. Sofisticirane opcije toplotnog rasipanja kao što su spoljašnje hlađenje, sonicija u režimu pulsa itd. Tokom procesa ultrazvučne dezintegracije obezbeđuju održavanje idealne procesne temperature i samim time netaknutost izdvojenih jedinjenja osetljivih na toplotu.

Istraživanje podvlači snagu poremećaja i vađenja ultrazvučnih ćelija

Prof. Chemat et al. (2017) nastavlja u svojoj studiji da je "ekstrakcija uz pomoć ultrazvuka zelena i ekonomski održiva alternativa konvencionalnim tehnikama za hranu i prirodne proizvode. Glavne prednosti su smanjenje vremena izvlačenja i obrade, količina energije i rastvarači koji se koriste, operacije jedinica i CO₂ emisije."
Gabig-Ciminska et al. (2014) je koristio homogenizer visokog pritiska i ultrazvučni ćelijski dsintegrator u svojoj studiji za lizu spora kako bi oslobodio DNK. Poredeći oba metoda prekida ćelija, istraživački tim zaključuje da je u vezi sa ćelijskom lizom za spore DNK urađena analiza upotrebom ćelijskih lisata od homogenizacije visokog pritiska. Nakon toga smo shvatili da ultrazvučni poremećaj ćelija ima izuzetne prednosti u tu svrhu. Prilično je brz i može da se obradi za male uzorke volumena." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekule iz ćelijskih fabrika za proizvodnju hrane

Fabrike mikrobioloških ćelija su održiva i efikasna metodologija proizvodnje koristeći mikrobiološke organizme za proizvodnju visokih prinosa domorodačkih i nenarodnih metabolita metabolita metabolicima metaboličkim bioinženjeringom mikrobioloških mikroorganizama kao što su bakterije, kvasci, gljivice itd. Masovni enzimi se na primer proizvode koristeći mikroorganizme auch kao Aspergillus oryzae, gljive i bakterije. Ti masovni enzimi koriste se za proizvodnju hrane i pića, kao i za poljoprivredu, bioenergiju i negu domaćinstava.
Određene bakterije kao što su Acetobacter xylinum i Gluconacetobacter xylinus proizvode celulozu tokom procesa fermentacije, gde se nanofiberi sintetišu u procesu donjeg dna. Bakterijska celuloza (poznata i kao mikrobiološka celuloza) hemijski je ekvivalentna biljnoj celulozi, ali ima visok stepen kristaliteta i visoke čistoće (oslobođena lignina, hemicelluloze, pektina i drugih biogeničnih komponenti) kao i jedinstvene strukture celuloze nanofiber-tkanja trodimenzionalne (3D reanimirane mreže) (cf. Zhong, 2020) U poređenju sa celulozom izvedenom od biljaka, bakterijska celuloza je održivija i proizvedena celuloza je čista ne zahtevajući složene korake prečišćavanja. Ultrazvučnost i vađenje rastvarača pomoću NaOH ili SDS (natrijum dodecyl sulfat) su veoma efikasni za izolaciju bakterijske celuloze iz bakterijskih ćelija.

Biomolekule iz ćelijskih fabrika za proizvodnju farmaceutskih i vakcina

Jedan od najistaknutijih farmaceutskih proizvoda koji potiče iz fabrika ćelija je ljudski insulin. Za proizvodnju bioinženjeringa insulina koriste se pretežno E. coli i Saccharomyces cerevisiae. S obzirom na to da molekuli bio-sintetičke nano veličine nude visoku biokompatibilnost, biološke nanočestice kao što je feritin su povoljne za brojne aplikacije za biomanufakturiranje. Pored toga, proizvodnja u metabolički modifikovanim mikrobima često je znatno efikasnija u dobijenim prinosima. Na primer, proizvodnja artemisinske kiseline, resveratrola i likopena povećala se desetostruko na nekoliko stotina puta, a već je uspostavljena ili je u razvoju proizvodnje industrijskih razmera. (cf. Liu et al.; Mikrob. Иinjenica жelije. 2017)
Na primer, biomolekule na bazi proteina na bazi proteina sa samo-sklapajućim svojstvima kao što su feriten i čestice nalik virusu posebno su interesantne za razvoj vakcine jer oponašaju i veličinu i strukturu patogena i mogu da isplivaju na površinu konjugacije antigena kako bi se promovisala interakcija sa imunološkim ćelijama. Takvi molekuli su izraženi u takozvanim fabrikama ćelija (npr. projektovanim sojevima ešerihije koli), koje proizvode određeni ciljni molekul.

Protocol for Ultrasonic Lysis and of E. coli BL21 for Ferritin Release

Feritin je protein, a primarna funkcija je skladištenje gvožđa. Ferritin pokazuje obećavajuće sposobnosti kao samo-sklapanje nanočestica u vakcinama, gde se koristi kao vozilo za isporuku vakcina (npr. SARS-Cov-2 šiljasti proteini). Naučno istraživanje Sun et. al. (2016) pokazuje da se rekombinantni feritin može osloboditi kao rastvorljiva forma iz Ešerihije koli pri niskim NaCl koncentracijama (≤50 mmol/L). U cilju izražavanja feritina u ešerihiji koli BL21 i oslobađanja fertina, uspešno je primenjen sledeći protokol. Rekombinantni pET-28a/ferritin plasmid pretvoren je u virus E coli BL21 (DE3). Ćelije feritina E coli BL21 (DE3) su kulturne u LB medijima za rast sa 0,5% kanamycin na 37°C i indukovane na OD600 od 0,6 sa 0,4% izopropyl-β-D-thiogalactopyranoside 3 sata na 37°C. Finalna kultura je potom požnjevena centrifugacijom na 8000g na 10 minuta na 4°C, a kuglica je sakupljena. Zatim, kuglica je ponovo zamenjena u LB medium (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% ekstrakt kvasca)/lisis bafer (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.6) i različite koncentracije NaCl rastvora (0, 50, 100, 170 i 300 mmol/L). Za bakterijsku ćeliju liza, sonication je primenjen u režimu pulsa: npr. Ultrazvučni UP400St na 100% amplitude sa dežurnim ciklusom od 5 sekundi ON, 10 sekundi OFF, za 40 ciklusa) a zatim centrifugovan na 10 000g na 15 minuta na 4°C. Supernatant i padavine su analizirali natrijum dodecyl sulfat poliakrilamid gel elektroforeza (SDS-PAGE). Svi natrijum dodecil gelovi umrljani sulfatom skenirani skenerom visoke rezolucije. Gel slike su analizirane pomoću Magic Chemi 1D softvera. Radi optimalne jasnoće, proteinske trake su otkrivene podešavanjem parametara. Podaci za bendove su generisani od tehničkih triplita. (cf. Sun et al., 2016)

Ultrazvučni ćelijski disruptori za industrijsku lizu fabrika ćelija

Ultrazvučna liza i vađenje je pouzdan i udoban metod za oslobađanje metabolita iz ćelijskih fabrika i time pomaže efikasnost proizvodnje ciljnih molekula. Ultrazvučni poremećaji ćelija dostupni su od laboratorije do industrijske veličine i procesi se mogu popeti potpuno linearno.
Hielscher Ultrasonics je vaš kompetentan partner za ultrazvučne poremećaje visokih performansi i ima dugogodišnje iskustvo u oblasti ugradnje ultrazvučnih sistema u bench-top i industrijska podešavanja.
Kada je reč o sofisticiranom hardveru i softveru, Hielscher Ultrasonics sistemi za prekid ćelija ispunjavaju sve zahteve za optimalnu kontrolu procesa, lak rad i user-friendliness. Kupci i korisnik Hielscher ultrazvučnih uređaja vrednuju korist koju Hielscher ultrazvučni ćelijski disruptori i ekstraktori omogućavaju precizno praćenje i kontrolu procesa – putem digitalnog ekrana osetljivog na dodir i daljinskog upravljača pregledača. Svi važni podaci o sonikaciji (npr. neto energija, ukupna energija, amplitude, trajanje, temperatura, pritisak) automatski se skladište kao CSV fajl na integrisanoj SD-kartici. Ovo pomaže u dobijanju reproduktivnih i ponavljajućih rezultata i olakšava standardizaciju procesa, kao i ispunjavanje dobrih proizvodnih praksi (cGMP).
Naravno, Hielscher ultrazvučni procesori su izgrađeni za 24/7 rad pod punim opterećenjem i zbog toga mogu pouzdano da posluju u podešavanjima industrijske proizvodnje. Zbog velike robusnosti i slabog održavanja, pad ultrazvučne opreme je zaista nizak. CIP (clean-in-place) i SIP (sterilize-in-place) karakteristike minimiziraju radno čišćenje, naročito zato što su svi vlažni delovi glatke metalne površine (bez skrivenih otvora ili reznica).

Табела испод показује приближни капацитет обраде наших ултразвучних уређаја: