Ултразвучна екстракција протеина из ткива и ћелијских култура

• Екстракција протеина је суштински корак припреме узорака у протеомици.
• Протеини се могу екстраховати из биљних и животињских ткива, квасаца и микроорганизама.
• Соникација је поуздана, ефикасна метода екстракције протеина која даје високе приносе протеина за кратко време екстракције.

Екстракција протеина из ткива и ћелија

Екстракција протеина из ткива и култивисаних ћелија је суштински корак припреме узорака који се спроводи у оквиру многих биохемијских и аналитичких техника, као што су ELISA, PAGE, вестерн блотинг, масена спектрометрија или пречишћавање протеина. Ултразвучно разарање ћелија, лиза и екстракција представљају нетермичку технику која се може прецизно контролисати ради обезбеђивања високих приноса протеина.

Општа упутства за ултразвучну лизу и екстракцију протеина

• Контрола температуре: Да би се обезбедио висок принос протеина без термичке денатурације, температура током екстракције мора да се контролише. Најсавременији ултразвучни хомогенизатори компаније Hielscher – који се називају и ултразвучни дезинтегратори или ултразвучни сонификатори – могу се прецизно контролисати. Испоручују се са прикључивим температурним сензором. У опцијама подешавања ултразвучног хомогенизатора може се подесити максимална температура. Када се достигне та максимална температура, ултразвучни уређај се аутоматски зауставља док се узорак не охлади.
• Пуфер: Избор одговарајућег пуфера и његове одговарајуће запремине разликује се од ткива до ткива и мора се утврдити испитивањем методом покушаја и грешке.
• Изолација / пречишћавање: Протеински лизати могу садржати вишак биомолекула као што су ДНК или угљени хидрати, који се могу уклонити таложењем протеина (деоксихолат–трихлорсирћетна киселина) или заменом пуфера.

Chittapalo и Noomhorm (2009) су у својој студији навели да се принос протеина повећао применом соникације и да процес ултразвучне хомогенизације и лизе ткива може значајно унапредити постојеће процесе екстракције – отварајући нове могућности за комерцијалну екстракцију.
 

Екстракција протеина из животињског ткива

За припрему ткива у целини (нпр. бубрега, срца, плућа, мишића итд.), ткиво треба исећи на веома ситне комаде чистим алатом, по могућности на леду, и што је брже могуће да би се спречила разградња протеазама (нпр. пуфер за лизу као што је RIPA или хипотонични пуфер за лизу који садржи коктел инхибитора протеаза и фосфатаза). Након сечења, узорак се потапа у течни азот ради наглог замрзавања. Узорак се може чувати на -80°C за каснију употребу или држати на леду ради непосредне хомогенизације. Непосредно пре ултразвучне екстракције, у епрувету са узорком брзо се додаје ледено хладан пуфер за лизу (са инхибиторима протеаза DTT, леупептином и апротинином) (препоручује се приближно ~600 μL пуфера на ~10 mg ткива). Препоручује се приближно 20–60mg ткива по епрувети са узорком.
Ултразвучна хомогенизација, лиза и екстракција спроводе се помоћу ултразвучног хомогенизатора као што је UP100H или UP200Ht, опремљеног сонотродом са микроврхом. Соникација траје 60–90 секунди у цикличном ултразвучном режиму са 15 секунди соникације и 10 секунди паузе. Узорак треба све време држати у леду.
Након ултразвучне хомогенизације / екстракције, лизат се центрифугира на 27.000g приближно 20 минута. Затим се сакупља супернатант како би се концентрација протеина могла одредити тестом за протеине као што је Pierce BCA тест за протеине.

Екстракција протеина из крвног серума

Да би се добила хомогена смеша серума и фосфатног пуфера, узорак се пре ултразвучне лизе ћелија најпре меша на вортекс мешалици. За ултразвучну лизу, узорак се соницира ултразвучним лабораторијским хомогенизатором као што је UP100H током 8 циклуса при амплитуди од 20%, при чему сваки циклус обухвата 5 секунди рада и 15 секунди паузе. Екстракција протеина спроводи се соникацијом у циклусима (пулсни режим) и постављањем узорка на лед како би се избегли прегревање и термичка разградња узорка. Пошто серум садржи велику количину протеина велике молекулске масе (као што су албумин, α1-антитрипсин, трансферин, хаптоглобулин, имуноглобулин G и имуноглобулин A), који ометају раздвајање протеина мале молекулске масе током IEF, препоручује се њихово уклањање из серума помоћу колоне за уклањање ових протеина.

Екстракција протеина из биљног ткива

Свеже, меко биљно ткиво, нпр. маховина итд., може се лако разорити једноставним стављањем уситњеног материјала узорка у пуфер за лизу ради соникације. Жилава, одрвенела биљна ткива, као што су семенке, јелове иглице итд., треба самлети на суво. Неки тврди, дрвенасти биљни материјали морају се замрзнути и самлети у течном азоту пре екстракције соникацијом. За суспензије биљних ћелијских култура углавном је довољан ултразвучни третман у трајању од 30 до 150 секунди у пуферу за лизу. Жилавији материјал, као што су семенке бундеве, захтева интензивнију соникацију, као што је описано у наставку.
 

Протокол за ултразвучну екстракцију албумина из семенки бундеве

За ултразвучну екстракцију протеина албумина из фино самлевеног праха семенки бундеве, у стаклену чашу од 250mL додају се 10 g одмашћеног праха семенки бундеве и 100 mL дејонизоване воде као растварача. Екстракција протеина састоји се од два корака: најпре се узорак соницира помоћу ултразвучног уређаја са сондом UP400St (400W, 24kHz), опремљеног сонотродом S24d7. Стаклена чаша се током ултразвучне хомогенизације поставља у купатило са хладном водом. Прикључиви температурни сензор и подешавања контроле температуре ултразвучног уређаја UP400St обезбеђују да се температура узорка увек одржава испод 30°C. Прецизном контролом температуре током соникације избегава се денатурација албумина. У другом кораку, екстракција је изведена мешалицом при брзини од 200 rpm и температури од 30°C. Након тога, чаша се преноси у термостатирану тресилицу. Глобулин се уклања дијализом са дестилованом водом. Након уклањања глобулина, може се узети узорак протеинског екстракта ради одређивања профила албумина, а затим се екстракт подешава на pI=3,0 помоћу 0,1 M HCl ради коагулације албумина. Чврста фаза се издваја центрифугирањем при 5000g и 20°C и поново раствара у дејонизованој води. Коагулација албумина спроводи се два пута како би се повећао удео протеина у концентрату албумина.

Ултразвучна алкална екстракција протеина за припрему протеинског концентрата из пиринчаних мекиња показује да ултразвучни третман доводи до већег приноса протеина за знатно краће време екстракције – у поређењу са конвенционалним методама екстракције.

Протокол припреме узорка за функционални ензим iNOS

За добијање потпуно функционалног ензима iNOS (нпр. за скрининг лекова), препоручује се следећи протокол: ћелијску суспензију треба поставити на лед и соницирати уређајем UP100H при амплитуди од 10µm у цикличном режиму са 5 секунди соникације и 25 секунди паузе на леду. Поступак треба поновити приближно 3 пута. Пауза између циклуса соникације смањује пораст температуре и стога ће смањити ризик од денатурације.

Ултразвучна солубилизација протеина

Соникација може убрзати процес солубилизације протеина, који обично захтева неколико сати. Да се узорак не би прегрејао и да би се спречиле разградња и модификације протеина у растворима који садрже уреу, ултразвучни импулси не би требало да трају дуже од неколико секунди.

Ултразвучна опрема за екстракцију протеина

Hielscher Ultrasonics нуди широк асортиман ултразвучних хомогенизатора за дезинтеграцију ћелија, ткива, бактерија, микроорганизама, квасаца и спора.
Лабораторијски ултразвучни уређаји Hielscher су снажни и једноставни за руковање. Направљени су за рад 24/7 и пројектовани као робусни и ефикасни лабораторијски и стони уређаји. Код свих уређаја излазна енергија и амплитуда могу се прецизно контролисати. Широк асортиман додатне опреме пружа додатне могућности конфигурације. Дигитални ултразвучни уређаји као што су VialTweeter, UP200Ht, UP200St и UP400St имају интегрисану контролу температуре и уграђену SD картицу за аутоматско бележење података.
За индиректну и истовремену соникацију више узорака без унакрсне контаминације нудимо VialTweeter или ултразвучни CupHorn.
Табела у наставку даје преглед наших ултразвучних уређаја за припрему узорака, разарање ћелија и екстракцију. Кликните на тип уређаја да бисте добили више информација о сваком ултразвучном хомогенизатору. Наше добро обучено техничко особље са дугогодишњим искуством радо ће вам помоћи да одаберете најпогоднији ултразвучни уређај за припрему ваших узорака!
 

У зависности од ваше примене, материјала и запремине узорка, препоручићемо вам најпогоднију конфигурацију за припрему ваших узорака. Контактирајте нас данас!