Ултразвучна екстракција протеина из култура ткива и ћелија
- Екстракција протеина је суштински корак припреме узорка у протеомици.
- Протеини се могу екстраховати из биљног и животињског ткива, квасца и микроорганизама.
- Соникација је поуздан, ефикасан метод екстракције протеина који даје високе приносе протеина у кратком времену екстракције.
Екстракција протеина из ткива и ћелија
Екстракција протеина из ткива и култивисаних ћелија је суштински корак припреме узорка који се изводи током многих биохемијских и аналитичких техника као што су ЕЛИСА, ПАГЕ, Вестерн блоттинг, масена спектрометрија или пречишћавање протеина. Ултразвучно уништавање ћелија, лиза и екстракција је прецизно контролисана, нетермална техника која обезбеђује високе приносе протеина.
Екстракција протеина из ћелија са ултразвучна сонда УП200Ст
- Рапид
- високи приноси
- Високо ефикасан
- Прецизна контрола параметара
- поновљиви резултати
- линеарна скалабилност
Општа упутства за ултразвучну лизу и екстракцију протеина
- Контрола температуре: Да би се обезбедио висок принос протеина без термичке денатурације, температура током екстракције се мора контролисати. Хиелсцхер-ови најсавременији ултразвучни хомогенизатори – такође се назива ултразвучни дезинтегратор или ултрасонификатор – се прецизно контролишу. Долазе са сензором температуре који се може прикључити. У опцијама подешавања ултразвучног хомогенизатора може се подесити максимална температура. Када се достигне ова максимална температура, ултрасоникатор се аутоматски зауставља док се узорак не охлади.
- бафер: Избор одговарајућег пуфера и праве запремине пуфера варира од ткива до ткива и мора се утврдити тестирањем покушаја и грешке.
- Изолација/пречишћавање: Протеински лизати могу садржати вишак биомолекула као што су ДНК или угљени хидрати, који се могу уклонити преципитацијом протеина (деоксихолат-трихлорсирћетна киселина) или разменом пуфера.
Цхиттапало и Ноомхорм (2009) су у својој студији објавили да се принос протеина повећао коришћењем ултразвучне обраде и да ултразвучна хомогенизација ткива и процес лизе могу значајно побољшати постојеће процесе екстракције. – омогућавајући нове комерцијалне могућности екстракције.
Ултрасониц ЦупХорн за истовремену, високо ефикасну припрему узорака више узорака под истим условима за изолацију протеина и фрагментацију ДНК.
Екстракција протеина из животињског ткива
За припрему ткива целе величине (нпр. бубрега, срца, плућа, мишића итд.), ткиво треба сецирати на веома мале комаде чистим алатима, по могућности на леду, и што је брже могуће како би се спречила деградација протеазама (нпр. пуфер за лизу као што је РИПА или хипотонични пуфер за лизу који садржи коктел инхибитора протеазе и фосфатазе). Након сецирања, узорак се урања у течни азот ради брзог замрзавања. Узорак се може чувати на -80°Ц за каснију употребу или држати на леду за тренутну хомогенизацију. Непосредно пре ултразвучне екстракције, ледено хладни пуфер за лизу (са инхибиторима протеазе ДТТ, леупептином и апротинином) се брзо додаје у епрувету за узорке (по ~10 мг ткива се препоручује око ~600 μЛ пуфера). Прибл. Препоручује се 20-60 мг ткива по епрувети за узорак.
Ултразвучна хомогенизација, лиза и екстракција се обављају ултразвучним хомогенизатором као што је УП100Х или УП200Хт, опремљеним сонотродом са микро врхом. Трајање соникације је 60-90 секунди. у режиму ултразвучног циклуса од 15 сек. соникација и 10 сек. време одмора. Узорак треба стално држати у леду.
После ултразвучне хомогенизације/екстракције, лизат се центрифугира на 27.000 г прибл. 20 мин. Након тога се сакупља супернатент, тако да се концентрација протеина може одредити протеинским тестом као што је Пирсов тест протеина БЦА.
Екстракција протеина из крвног серума
За хомогену смешу серума и фосфатног пуфера, узорак се прво вортексира пре ултразвучне лизе ћелија. За ултразвучну лизу, узорак се обрађује ултразвучним лабораторијским хомогенизатором као што је УП100Х током 8 циклуса при 20% амплитуде, за циклусе од сваких 5 секунди укључених и 15 секунди искључених. Екстракција протеина се изводи соникацијом у циклусима (начин пулсирања) и стављањем узорка на лед тако да се избегне прегревање и термичка деградација узорка. Пошто серум садржи велику количину протеина високе молекулске тежине (као што су албумин, α1-антитрипсин, трансферин, хаптоглобулин, имуноглобулин Г и имуноглобулин А), који ометају одвајање протеина мале молекулске тежине током ИЕФ-а, препоручује се њихово исцрпљивање. из серума помоћу колоне за исцрпљивање.
Екстракција протеина из биљног ткива
Свеже, меко биљно ткиво, нпр. маховина итд., може се лако пореметити једноставним стављањем сецканог материјала узорка у пуфер за лизу за соникацију. Чврста, лигаста биљна ткива, као што су семе, иглице јеле итд., треба суво самлети. Неки тврди, дрвенасти биљни материјали морају бити замрзнути и млевени у течном азоту пре екстракције ултразвучном обрадом. За суспензије биљних ћелија, ултразвучни третман између 30 и 150 секунди у пуферу за лизу је углавном довољан. Чвршћи материјал као што су семенке бундеве захтевају интензивнију соникацију као што је описано у наставку.
Протокол за ултразвучну екстракцију албумина из семена бундеве
За ултразвучну екстракцију протеина албумина из фино млевеног праха семена бундеве, 10 г одмашћеног праха семена бундеве и 100 мЛ дејонизоване воде као растварача додају се у стаклену чашу од 250 мЛ. Екстракција протеина се састоји од два корака: Прво, узорак се обрађује соникацијом ултрасоникатор типа сонде УП400Ст (400В, 24кХз) опремљен сонотродом С24д7. Стаклена чаша се ставља у купатило са хладном водом током ултразвучне хомогенизације. Прикључни температурни сензор и подешавања за контролу температуре ултрасоникатора УП400Ст обезбеђују да се температура узорка увек одржава испод 30°Ц. Прецизном контролом температуре током соникације избегава се денатурација албумина. Друго, екстракција је изведена миксером при брзини од 200 о/мин и на 30°Ц. Након тога, чаша се пребацује у термостатски шејкер. Глобулин се уклања дијализом са дестилованом водом. Након уклањања глобулина, екстракт протеина се може узети за одређивање профила албумина и затим се подешава на пИ=3,0 коришћењем 0,1 М ХЦл за коагулацију албумина. Чврста фаза је одвојена центрифугирањем на 5000 г, 20°Ц и поново растворена у дејонизованој води. Коагулација албумина се изводи два пута да би се повећао однос протеина у концентрату албумина.
Ултразвучна алкална екстракција протеина за припрему концентрата протеина из пиринчаних мекиња показује да ултразвучни третман доводи до већег приноса протеина у знатно краћем времену екстракције – у поређењу са конвенционалним методама екстракције.
Протокол за припрему узорка за функционални иНОС ензим
Да би се добио потпуно функционалан иНОС ензим (нпр. за скрининг лекова), препоручује се следећи протокол: Суспензија ћелија треба да се стави на лед и обради ултразвуком са УП100Х при амплитуди 10 µм у режиму циклуса од 5 секунди. соникација и 25 сек. одморити на леду. Поступак треба поновити цца. 3 пута. Време одмора између циклуса соникације смањује пораст температуре и стога смањује ризик од денатурације.
ултразвучна солубилизација протеина
Соникација може убрзати процес солубилизације протеина, који обично захтева неколико сати. Како се узорак не би прегрејао и спречила деградација протеина и модификације у растворима који садрже уреу, ултразвучни удари не би требало да трају дуже од неколико секунди.
Ултрасоницатор УП200Хт са микроврхом од 2 мм С26д2 за соникацију малих узорака.
Ултразвучна опрема за екстракцију протеина
Хиелсцхер Ултрасоницс нуди широк спектар ултразвучних хомогенизатора за дезинтеграцију ћелија, ткива, бактерија, микроорганизама, квасца и спора.
Хиелсцхер лабораторијски ултрасоникатори су моћни и лаки за руковање. Направљени за рад 24/7, дизајнирани су као робусни и ефикасни лабораторијски и стони уређаји. За све уређаје, излаз енергије и амплитуда се могу прецизно контролисати. Широк спектар додатне опреме отвара додатне могућности подешавања. Дигитални ултрасоникатори као што су ВиалТвеетер, УП200Хт, УП200Ст и УП400Ст имају интегрисану контролу температуре и уграђену СД картицу за аутоматско снимање података.
За индиректну, унакрсну контаминацију и истовремену соникацију више узорака, нудимо ВиалТвеетер или ултразвучни ЦупХорн.
Табела испод даје вам преглед наших ултразвучних апарата за припрему узорака, разбијање ћелија и екстракцију. Кликните на тип уређаја да бисте добили више информација о сваком ултразвучном хомогенизатору. Наше добро обучено техничко особље са дугогодишњим искуством ће вам радо помоћи да изаберете најпогоднији ултразвучни апарат за припрему узорка!
| Батцх Волуме | Проток | Препоручени уређаји |
|---|---|---|
| до 10 бочица или епрувета | на | ВиалТвеетер |
| мултибунарице / микротитарске плоче | на | УИП400МТП |
| више цеви / судова | на | цупхорн |
| 1 до 500 мл | 10 до 200 мл/мин | УП100Х |
| 10 до 1000 мл | 20 до 200 мл/мин | УП200Хт, УП200Ст |
| 10 до 2000 мл | 20 до 400 мл/мин | УП400Ст |
У зависности од ваше примене, материјала и запремине узорка, ми ћемо вам препоручити најприкладније подешавање за вашу припрему узорка. Контактирајте нас данас!
Контактирајте нас! / Питајте нас!
Хиелсцхер дигитални ултрасоникатори имају даљински управљач претраживача и аутоматско протоколирање података на интегрисаној СД картици.
ВиалТвеетер за индиректну соникацију.
Чињенице које вреди знати
протеомика
Протеомика је поље истраживања које истражује протеине и протеоме. Протеини испуњавају широк спектар виталних функција у организмима. Протеом је цео скуп протеина изражених од стране генома, ћелије, ткива или организма у одређено време. Протеом варира са временом и различитим захтевима, или стресовима, којима се ћелија или организам подвргавају. Тачније, то је скуп експримираних протеина у датом типу ћелије или организма, у датом тренутку, под дефинисаним условима. Термин је мешавина протеина и генома. Протеомика је проучавање протеома.
беланчевина
Протеини су велики биомолекули, такозвани макромолекули – који су састављени од једног или више дугих ланаца аминокиселинских остатака. Протеини су присутни у свим организмима и биљног и животињског порекла и кључни су за већину биолошких функција. Пошто протеини садрже много биолошких информација, они се екстрахују у аналитичке сврхе, нпр. за протеомска истраживања. Најважнија функција коју обављају протеини укључује катализу метаболичких реакција, репликацију ДНК, одговор на стимулусе и транспорт молекула са једне локације на другу. Протеини се разликују једни од других првенствено по свом редоследу аминокиселина, који је диктиран нуклеотидном секвенцом њихових гена, а који обично резултира савијањем протеина у специфичну тродимензионалну структуру која одређује његову активност. Протеини су – поред пептида – једна од кључних компоненти хране. Стога је протеомика моћно оруђе у науци о храни за оптимизацију процеса, безбедност хране и процену исхране.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction је преданалитички поступак за одвајање и претходно концентрирање аналита. У комбинацији са ултразвуком, екстракција тачке замућења се може интензивирати, чинећи процес ефикаснијим, бржим и еколошки прихватљивијим. Уз ултразвучну обраду, екстракција тачке замућења је знатно ефикаснија метода припреме аналита. Прочитајте више о екстракцији тачке замућења уз помоћ ултразвука!Гел електрофореза
Гел електрофореза је главна метода за раздвајање и анализу макромолекула као што су ДНК, РНК и протеини, као и њихових фрагмената, на основу њихове величине и наелектрисања. Користи се у клиничкој хемији за раздвајање протеина по набоју и/или величини (ИЕФ агароза, у суштини независна од величине) и у биохемији, молекуларној биологији и протеомици за раздвајање мешовите популације ДНК и РНК фрагмената по дужини, да би се проценила величина ДНК и РНК фрагменте или да одвоје протеине наелектрисањем.
ћелијске културе
Ћелијска култура је контролисани процес раста којим се ћелије култивишу у контролисаним условима. Услови културе ћелија се разликују за сваки тип ћелије. У принципу, окружење ћелијске културе се састоји од одговарајуће посуде (нпр. Петријеве посуде) са супстратом или медијумом који снабдева есенцијалне хранљиве материје (аминокиселине, угљене хидрате, витамине, минерале), факторе раста, хормоне и гасове (ЦО).2, О2), и регулише физичко-хемијско окружење (пХ пуфер, осмотски притисак, температуру). Већини ћелија је потребан површински или вештачки супстрат, док се друге ћелијске културе могу култивисати слободно лебдећи у медијуму за културу (суспензиона култура, ћелијска суспензија).
Масовне културе животињских ћелијских линија се користе у индустријској производњи вирусних вакцина и других биотехнолошки добијених производа. Људске матичне ћелије се узгајају да би се повећао број ћелија и диференцирали ћелије у различите типове соматских ћелија за потребе трансплантације.
Узорци ткива
Термин ткиво описује ћелијски интермедијер, где је ћелијски материјал на организационом нивоу између ћелија и целог органа. У ткиву се склапају сличне ћелије истог порекла које заједно врше одређену функцију. Функционалним груписањем више ткива формирају се сложене структуре органа.
Ткиво се узима за истраживања у биологији, хистологији/хистопатологији, паразитологији, биохемији, имунохистохемији, као и за култивацију и екстракцију ДНК. Може се разликовати између животињског (пододељење: ткиво сисара) и биљног ткива. Животињска ткива су груписана у четири основна типа везивног, мишићног, нервног и епителног ткива. Биљно ткиво се дели на следећа три система ткива: епидермис, приземно ткиво и васкуларно ткиво.
Узорци ткива се могу припремити од животињских или биљних делова, нпр. кости, мишића, листова итд.
Телесне течности
Крв, серум, плазма, цереброспинална течност, пљувачка и синовијална течност су телесне течности, које нуде одличан извор дијагностички релевантних информација. Због тога је важна софистицирана припрема узорака телесних течности за анализу. Прва потешкоћа је повезана са широким динамичким опсегом компоненти присутних у телесним течностима.
Одређивање концентрације протеина
Брадфордов тест, Ловријев тест и бицинхонинска киселина (БЦА) су уобичајени тестови за одређивање концентрације протеина. Говеђи серум албумин (БСА) је један од најчешће коришћених стандарда протеина.
пуфер за лизу
Пуфер за лизу мора бити изабран у складу са ћелијским материјалом или ткивом (култура ткива, биљка, бактерије, гљиве, итд.), и да ли су ћелије у структури и типу структуре. Широк спектар пуфера за лизу за екстракцију протеина, мембрана и органела је формулисан са једним или више детерџената. Детерџент се обично бира путем тестова покушаја и грешака или – ако је на располагању – према постојећем протоколу екстракције протеина. Детерџент мора бити компатибилан са извором ткива и протеинима. Генерално, најблажи детерџент који делује на одређено ткиво/протеин, бира се како би се одржала максимална функционалност екстракта. Штавише, у случају екстракције мембрана и органела, благи детерџент одржава мембрану нетакнутом. Често коришћени детерџенти у пуферима за лизу су углавном нејонски или цвитерјонски, нпр. ЦХАПС, деоксихолат, Тритон™ Кс-100, НП40 и Твеен 20.
На пример, ткива као што су мозак, јетра, црева, бубрези, слезина итд. могу се једноставно пуферовати са РИПА – међутим инхибиторе протеазе и ДТТ (нпр. за гел електрофорезу) треба укључити.
Пуфер за лизу за ткиво скелетних мишића (ледено хладно): 20 мМ Трис (пХ 7,8), 137 мМ НаЦл, 2,7 мМ КЦл, 1 мМ МгЦл2, 1 % Тритон Кс-100, 10 % (в/в) глицерол, 1 мМ ЕДТА , 1 мМ дитиотреитол допуњен коктелом инхибитора протеазе и фосфатазе
Табела уобичајених пуфера и њиховог пХ опсега. Генерално, ови пуфери се обично користе у концентрацијама од 20-50 мМ.
| тампон | пХ опсег |
|---|---|
| Лимунска киселина – НаОХ | 2.2 – 6.5 |
| Натријум цитрат – Лимунска киселина | 3.0 – 6.2 |
| Натријум ацетат – сирћетна киселина | 3.6 – 5.6 |
| Натријумова со какодилне киселине – ХЦл | 5.0 – 7.4 |
| МЕС – НаОХ | 5.6 – 6.8 |
| Натријум дихидроген фосфат – динатријум хидроген фосфат | 5.8 – 8.0 |
| имидазол – ХЦл | 6.2 – 7.8 |
| МОПС – КОХ | 6.6 – 7.8 |
| Триетаноламин хидрохлорид – НаОХ | 6.8 – 8.8 |
| Трис – ХЦл | 7.0 – 9.0 |
| ХЕПЕС – НаОХ | 7.2 – 8.2 |
| Трицине – НаОХ | 7.6 – 8.6 |
| Натријум тетраборат – Борна киселина | 7.6 – 9.2 |
| Бицине – НаОХ | 7.7 – 8.9 |
| глицин – НаОХ | 8.6 – 10.6 |
Већина пуфера показује пХ-зависност од температуре. Ово посебно важи за Трис бафере. ПКа се мења од 8,06 на 25°Ц до 8,85 на 0°Ц.
(пХ и пКа пуфера: пХ мери концентрацију водоникових јона у воденом раствору. пКа (= константа дисоцијације киселине) је сродна, али специфичнија мера, по томе што помаже да се предвиди како ће молекул деловати на одређеном пХ вредност.)
ТРИзол
ТРИзол је хемијски раствор који се користи за екстракцију РНК/ДНК/протеина током екстракције гванидинијум тиоцијанат-фенол-хлороформ. Употреба ултразвучне екстракције ТРИзола резултира високим приносима ДНК, РНК и протеина из истог узорка и тиме надмашује друге методе екстракције.
Литература/Референце
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.