Ултразвучна екстракција протеина из култура ткива и ћелија
- Ekstrakcija proteina je suštinski preparat za pripremu u proteomici.
- Proteini se mogu izdvojiti iz biljnih i životinjskih tkiva, obala i mikroorganizama.
- Soniranost je pouzdan, efikasan metod ekstrakcije proteina i daje visok rast proteina u kratkom vremenskom periodu.
Proteini iz tkiva i ćelija
Vađenje proteina iz tkiva i kulturnih ćelija je esencijalni korak pripreme uzorka koji se izvodi tokom mnogih biohemijskih i analitičkih tehnika kao što su ELISA, PAGE, Zapadna blotting, masovna spektrometrija ili pročišćavanje proteina. Ultrazvučni poremećaj ćelija, liza i vađenje je precizno kontrolna, ne-termalna tehnika kako bi se osigurali visoki prinosi proteina.
Vađenje proteina iz ćelija sa ultrazvučna sonda UP200St
- Brzo
- Visoki prinosi
- Vrlo efikasno
- Precizna kontrola parametara
- Ponovno produktivljiv rezultati
- Линеарна скалабилност
Opšta uputstva za ultrazvučnu lizu i vađenje proteina
- Kontrola temperature: Da bi se obezbedila visoka proteina bez termo-denatacije, temperature se moraju kontrolisati tokom izdvajanja. Hielscher, najmoderniji ultrasonični homogeneri – naziva se i ultrazvučni dezintegrator ili ultrasonifikator – su precizno kontrolisano. Dolaze sa senzorskim senzorima. U opcijama za postavljanje ultrasonne homogenera može se postaviti maksimalna temperatura. Kada se dostigne ova temperatura, ultrasonator se automatski zaustavlja dok se uzorak ne ohladi.
- Bafer: Korišćenje odgovarajućeg bafera i pravog obima bafera varira od tkiva do tkiva i mora biti odjavljan putem ispitivanja probne i greške.
- Izolacija/pročišćavanja: Proteini mogu da sadrže višak biomolekula, kao što su DNK ili ugljenih hidrata, koji mogu biti uklonjeni od strane proteina (deokykolata-trihloroaktička kiselina) ili razmene bafera.
Chittapalo i Noomhorm (2009) su u svojoj studiji izvestili da je prinos proteina povećan korišćenjem sonication i da proces homogenizacije ultrazvučnog tkiva i lize može značajno da poboljša postojeće procese vađenja – Omogućavanje novih poslovnih prilika za izdvajanje.
Proteini iz životinjskih tkiva
Za pripremu cijelog tkiva (npr. bubreg, srce, pluća, mišića itd.), tkivo treba da se raspadne u veoma male figure sa čistim alatima, na ledu, a što je pre moguće da bi se sprečilo degradacija proteaze (npr. bafer za litis, kao što je RIPA ili hidpotonski bafer koji sadrži protezu i izlizanje inhibitorskog koktela. Nakon što se raspadne, uzorak se pretvara u tečni azotan za zamrzavanje. Uzorak može da se uskladišti na-80 ° c za kasniju upotrebu ili da bude na ledu za neposrednu homogenizaciju. Neposredno pre ultrazvučne ekstrakcije, sladoledni limfni međuspremnik (sa protezom i inhibaze DTT, leupeptin i aprotinin) se brzo dodaje u probnu cev (po ~ 10 mg od tkiva u kojima je otprilike. ~ 600 μL bafera se preporučuje). Oko 20-60mg tkiva se preporučuje po probnoj cevi.
Ultrazvučna homogenizacija, liza i vađenje se vrši ultrazvučnim homogenizerom kao što su UP100H ili UP200Ht, opremljen mikro-savetom sonotrode. Trajanje sonikacije je 60-90 sec. na ultrazvučnom režimu ciklusa od 15 sec. sonication i 10 sec. vreme odmaranja. Uzorak treba držati u ledu sve vreme.
Nakon ultrasonove homogenizacije, lysate je na oko 27, 000g za oko 20 min. nakon prikupljanja supernatenta, tako da koncentracija proteina može da se odredi od strane proteina, kao što je Pirs protein asinhron.
Proteini iz krvne serum
Za homogenu mešavinu seruma i bafera fosfata, uzorak se prvo vrti pre ultrazvučne ćelijske lize. Za ultrazvučnu lizu, uzorak je soničan ultrazvučnim laboratorijskim homogenizerom kao što je UP100H za 8 ciklusa uz 20% amplitude, za cikluse od svakih 5 sekundi na i 15 sekundi isključen. Sonocation se sprovodi sonikacijom u ciklusima i stavljanjem uzorka na led tako da se izbegne prejedanje i toplotna degradacija uzorka. S obzirom na to da serum sadrži veliku količinu proteina visoke molekularne težine (kao što su albumin, 1-antitripsin, transferrin, haptoglobulin, imunoglobulin G i imunoglobulin A), koji ometaju odvajanje proteina niske molekularne težine tokom IEF-a, preporučuje se iscrpljivanje iz seruma pomoću kolone za iscrpljivanje.
Vađenje proteina iz biljnih tkiva
Sveže, meke biljne tkivo, npr. mahovina, lako se može poremećati jednostavnim postavljanjem iseckanog uzorka materijala u bafer za soniranost. Gruba, ligoznih biljnih tkiva, kao što su Seme, jela i Dr. Neki tvrde, Woody biljni materijali moraju biti zamrznuti i prizemljiti u tečnim azikima pre nego što ih je vadila. Za suspenzije biljnih kultura, ultrasonični tretman između 30 i 150 sekunde u baferu lysis je uglavnom dovoljan. Stroži materijal, kao što je seme bundeve, zahteva intenzivniju sonaciju kao što je opisano ispod.
Protokol za ultrasonovo vađenje albumona iz semena bundeva
Za ultrazvučno vađenje proteina od albumina iz fino mlevenog praha od semenki bundeve, 10 g defatted bundevinog semena u prahu i 100 mL deionizovane vode kao rastvarač dodaju se u stakleni posudu od 250mL. Vađenje proteina se sastoji u dva koraka: Prvo, uzorak je soničan sa ultrazvučni tip sonde UP400St (400W, 24kHz) opremljen sonotrodom S24d7. Stakleni posuda se nalazi u kadi sa hladnom vodom tokom ultrazvučne homogenizacije. Postavka ultrazvučnog UP400St sa senzorom za dodatnu temperaturu osigurala je da se temperatura uzorka uvek drži ispod 30°C. Preciznom kontrolom temperature tokom sonikacije izbegava se denaturacija albumina. Drugo, izvlačenje je izvršeno mikserom brzinom od 200 rpm i na 30°C. Nakon toga se beaker prenosi u termostatski šejker. Globulin se uklanja preko dijalize destilovanom vodom. Nakon uklanjanja globulina, ekstrakt proteina se može uzorkovati radi utvrđivanja profila albumina i naknadno se prilagođava pI=3.0 koristeći 0,1 M HCl za koagulaciju albuma. Čvrsta faza se odvaja centrifugacijom na 5000g, 20°C i preraspodelom u deionizovanoj vodi. Albumin koagulacija se izvodi dva puta kako bi se povećao odnos proteina u koncentratima albuma.
Ultrazvučni ekstrakti proteina za pripremu proteina koncentrat iz Bran pokazuje da ultrasonični tretman rezultira višim protezom u znatno kraćim vremenskim vremenom – u poređenju sa konvencionalnim metodama izdvajanja.
Probni protokol za funkcionalno iNOS enme
Da bi se dobio potpuno funkcionalan iNOS enzim (npr. za skrining droge), preporučuje se sledeći protokol: Ogibljenje ćelija treba staviti na led i sonično je sa UP100H na 10μm amplitude u režimu ciklusa od 5 sec. sonication i 25 sec. odmor na ledu. Postupak treba ponoviti oko 3 puta. Vreme odmora između ciklusa sonicije smanjuje porast temperature i samim tim će smanjiti rizik od denaturacije.
Ultrazvučna Solsonizacija
Soniranost mogu ubrzati proces solubilizacije proteina, koji obično zahteva nekoliko sati. Da ne biste pregoreli uzorak i sprečili degradaciju proteina i modifikacije u rešenjima koja sadrže Urea, ultrasonični burni ne traju duže od nekoliko sekundi.
Ultrazvučni UP200Ht sa mikrotipom od 2mm S26d2 za sonikaciju malih uzoraka.
Ultrazvučna oprema za vađenje proteina
Hielscher Ultrasonics nudi širok spektar ultrasonovih homogeničara za dezificorove ćelija, tkiva, bakterije, mikroorganize, kvasca i spore.
Hielscher laboratorijski ultrazvučni su moćni i jednostavni za rad. Napravljeni za 24/7 operaciju, dizajnirani su kao robusni i efikasni laboratorijski i vrhunski uređaji. Za sve uređaje, izlaz energije i amplitude mogu se precizno kontrolisati. Širok spektar dodatne opreme otvara dodatne opcije podešavanja. Digitalni ultrazvučnici kao što su VialTweeter, UP200Ht, UP200St i UP400St imaju integrisanu kontrolu temperature i ugrađenu SD karticu za automatsko snimanje podataka.
Za indirektnu, unakrsnu kontaminaciju i istovremenu soniciju više uzoraka, nudimo VialTweeter ili ultrazvučni CupHorn.
Sledeća tabela vam daje pregled naših ultrazvučnika za pripremu uzoraka, prekid ćelija i vađenje. Kliknite na tip uređaja da biste dobili više informacija o svakom ultrazvučnom homogenizeru. Naša dobro obučena i dugotrajna iskustva Tehničko osoblje će vam rado pomoći da odaberete najpogodniji ultrazvučni za vašu pripremu uzorka!
| батцх tom | Проток | Препоручени уређаји |
|---|---|---|
| do 10 bočica ili cevi | Н.А. | ВиалТвеетер |
| multiwell / mikrotiter ploče | Н.А. | UIP400MTP |
| više cevi / posuda | Н.А. | Cuphorn |
| 1 до 500 мл | 10 до 200мЛ / мин | УП100Х |
| 10 do 1000mL | 20 do 200mL/min | УП200Хт, УП200Ст |
| 10 до 2000мЛ | 20 до 400мЛ / мин | УП400Ст |
U zavisnosti od aplikacije, materijala i uzorka volumena, preporučujemo vam najprikladnije Podešavanje za vaš probni avans. Kontaktirajte nas danas!
Контактирајте нас! / Питајте нас!
Hielscher digitalni ultrazvučnici imaju daljinski upravljač pregledača i automatsko protokoliranje podataka na integrisanoj SD kartici.
ВиалТвеетер za indirektne sonsikaciju.
Чињенице вреди знати
Proteomici
Proteomika je istraživački teren koji istražuje proteine i proteoma. Proteini imaju veliki niz vitalnih funkcija u organizama. Proteoma je celokupan skup proteina koje su u određenom trenutku izražavali genoma, ćelija, tkivo ili organizam. Proteoma varira u odnosu na vreme i posebne zahteve, ili naglašava da ćelija ili organizam prolazi. Preciznije, to je skup izraženu proteina u datom tipu ćelije ili organizma, u datom trenutku, pod definisanim uslovima. Pojam je mešavina proteina i genoma. Proteomika je studija proteoma.
Proteina
Proteini su veliki biomolekuli, takozvani makromolekuli – koje se sastoje od jednog ili više dugih lanaca amino kiseline. Belančevine su prisutne u svim organizama vegetalnog i životinjskog porekla i od presudnog su značaja za većinu bioloških funkcija. S obzirom da proteini sadrže mnogo bioloških informacija, oni su izdvojeni u analitičke svrhe, npr. Najvažnija funkcija koju izvode proteini uključuju i katalakaciju METABOLIČKIH reakcija, DNK replikaciju, odgovor na štulove i transport molekula sa jedne lokacije na drugu. Proteini se razlikuju od drugih prvenstveno u svojoj sekvenci amino kiselina, koje diktiraju nukleotide iz svog gena, a to obično rezultira protekotinama u specifičnoj trodimenzionalnom strukturi koja određuje njegovu delatnost. Proteine su – Osim pepticida – jedna od ključnih komponenti hrane. Prema tome, proteomika je moćna alatka za prehrambene nauke kako bi se optimizovali procesi, sigurnost hrane i prehrambena procena.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je pre-analitička procedura za razdvajanje i pre-uobraženje analitika. U kombinaciji sa ultrazvučnoљжu, vaрenje oblaиnih t taиaka se moћe intenzivirati, љto иuva proces efikasnijim, brћim i udobnijim po okolini. Sa ultrazvučnoљжu, vaрenje oblaиnih t mesta je znatno efikasnija metoda pripreme analita. Pročitajte više o ultrasonično asistiranom vađenju cloud pointa!Gel Elektroforesis
Gel elektrofosis je glavni metod odvajanja i analize makromolekula kao što su DNK, RNA i proteina, kao i njihove fragmente, na osnovu njihove veličine i naplate. Koristi se u kliničkoj hemiji za odvajanje belančevina po naplati i/ili veličini (IEF agrose, u suštini nezavisno) i u biohemiji, molekularnu biologiju i proteomiku da razdvoji mešoviti broj DNK i RNA fragmenata po dužini, da proceni veličinu Od DNA i RNA fragmenata ili da razdvajaju proteine naplaćivanjem.
Ćelijskih kultura
Ćelijska kultura je rastući proces u kojem se sve ćelije kultivise pod kontrolisanim uslovima. Uslovi kulture ćelije se razlikuju za svaki tip ćelije. Generalno gledano, okolina ćelijskih kultura se sastoji od prikladnog broda (npr. Petri jelo) sa substrima ili srednjim koji snabdeva suštinske hranljive (amino kiseline, ugljenih hidrata, vitamina, minerala), faktore rasta, hormona i gasova (CO2O2) i regulišu fizio-hemijski ambijent (pH, osmotski pritisak, temperatura). Većini ćelija potrebna je površina ili veštačko substrate, dok druge ćelije kulture mogu da se slobodno plutaju u kulturnom mediju (u kulturi, vešanje ćelije).
Masovne kulture životinjskih linija koriste se u industrijskoj proizvodnji virusnih vakcina i drugih biotatronički izvedenih proizvoda. Ljudske matične ćelije su Kultivisana da bi proširili broj ćelija i razlikacijom ćelija u različitim tipovima ćelija somatskih u svrhe transplantacije.
Uzorci tkiva
Pojam tkiva opisuje celularni srednji nivo, gde se materijal ćelije nalazi na organizacionom nivou između ćelija i kompletnog organa. U tkivu, slične ćelije, iz istog porijekla koje zajedno obavljaju specifičnu funkciju. Funkcionalnim grupisanjem višestruke tkiva formirane su složene strukture organa.
Tkivo je samostručno za istraživanje u biologiji, histologiji/histopatologiji, parazitologiji, biohemija, imunohistohemija, kao i za negovivanje i izdvajanje DNK. Može se razlikovati od životinja (subdivizije: sismal tkiva) i biljnih tkiva. Životinjski tkivo se grupišu u četiri osnovne vrste vezivnog, mišićnog, nervnog i kožnog tkiva. Biljnih tkiva je podijeljena u sledeće tri sisteme tkiva: epidermis, kopneni tkivo i vaskularni tkivo.
Uzorci tkiva se mogu pripremiti od životinjskih delova, poput kosti, mišića, lišća itd.
Tjelesne tečnosti
Krv, serum, plazma, cerebralna tečnost, pljuvačka i sirnovijalna tečnost su telesna tečnost koja nudi veliki izvor dijagnostički relevantnih informacija. Zato je bitna sofisticirana priprema uzoraka tela za analizu. Prvi problem je povezan sa širokom dinamičnom spektrom komponenti koji su prisutni u telesnim tečnosti.
Utvrđivanje koncentracije proteina
Bredford askaze, Lowry askaze i bicinchoninić kiselina (BCA) askaže da su uobičajeni askaze da utvrde koncentraciju proteina. Spongiformna serum belančevina (BSA) je jedan od najčešće korišćenih standarda proteina.
Bafer za lysis
Bafer za lysis se mora izbiti u skladu sa sirovim materijalom ili Tkom (kultura tkiva, biljka, bakterije, gljivice, itd.), kao i da li su ćelije u strukturi i tipu strukture. Širok raspon limne bafera za vađenje proteina, membova i organama formulisani su sa jednim ili više deterdženata. Deterdžent je obično odabran pomoću testova za suđenje i greške ili – Ako je dostupna – Prema postojećem protokolu za izdvajanje proteina. Deterdžent mora biti kompatibilan sa izvorom tkiva i belančevina. Generalno gledano, u cilju održavanja maksimalne funkcionalnosti ekstrakta, bira se i najpoznatiji deterdžent koji radi za određeno tkivo/proteine. Pored toga, u slučaju ekstrakta membova i organelola, blago deterdžent je netaknut. Često korišćeni deterdženti u Limu baferi su uglavnom nejonski ili zwitterionički, npr. momci, deoxykolat, Triton™ X-100, NP40 i Tween 20.
Na primer, tkivo kao što su mozak, jetra, creva, bubreg, slezen i Dr. mogu se jednostavno umirati sa RIPA – Međutim, potrebno je uključiti inhibaze i DTT (npr. za gel elektrofosresis).
Bafer za limfnu maramicu (ledeno hladno): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w/v) glicol, 1 mM EDTA, 1 mM dijthio3 itol dopunjen sa proteaze i fosfatom inhibitorom koktel
Tabela uobičajenih bafera i njihovih pH asortimana. Uopšteno, ovi baferi se obično koriste u koncentracijama od 20-50 mM.
| Bafer | pH |
|---|---|
| Limunsku kiselinu – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Natrijum – Limunsku kiselinu | 3,0 – 6,2 |
| Natrijum – aketička kiselina | 3,6 – 5,6 |
| Cacodylic kiselina natrijum-so – Hcl | 5,0 – 7,4 |
| PRIJATELJI – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Natrijum-dihidrogen fosfata – dezodium hidrogen fosfata | 5,8 – 8,0 |
| Imidazole – Hcl | 6,2 – 7,8 |
| Krpa – Koh | 6,6 – 7,8 |
| Trietanolamin hidrohlorid – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Vežba – Hcl | 7,0 – 9,0 |
| ZAVESE – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Troseći – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Natrijum – borična kiselina | 7,6 – 9,2 |
| Bicine – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glycine – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Većina bafera pokazuje pH-zavisnost sa temperaturi. Ovo je posebno istinito za Tris bafere. PKa se menja sa 8,06 na 25 ° c na 8,85 na 0 ° c.
(pH i pKa bafera: pH Meri koncentraciju hidrogena u izlučnom rešenju. pKa (= konstanta kiseline) je povezana, ali više specifičnije, u tome pomaže da se predvidi kako će molekul delovati na određenu pH vrednost.)
TRIzol
TRIzol je hemijsko rešenje koje se koristi za izdvajanje RNA/DNK/proteina tokom guanidinium thiocanos-fenol-hloroform ekstrakcija. Korišćenje ultrasonično upotrebnog za ekstrakciju TRIzol-a u visokom DNK, RNA i proteini iz istih uzorka i uzbuđuju i na druge načine izdvajanja.
Литература / Референце
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.