Екстракција протеина потпомогнута соникацијом за фосфопротеомику

У савременим наукама о животу, фосфопротеомика се развила у кључну технологију за дешифровање ћелијских сигналних путева и разумевање механизама болести на системском нивоу. Пошто фосфорилација управља кључним биолошким функцијама – од активности ензима до интеракција између протеина – њено прецизно мерење је неопходно и за основна истраживања и за транслациону медицину. Недавни напредак у масеној спектрометрији омогућио је идентификацију десетина хиљада догађаја фосфорилације у једном експерименту, што наглашава потребу за поузданим и репродуктивним радним поступцима припреме узорака чији се обим може повећавати.
Међу најутицајнијим помацима у овој области јесте увођење екстракције протеина потпомогнуте соникацијом, која значајно побољшава квалитет узорака, капацитет њихове обраде и репродуктивност. Ултразвучне технологије као што су VialTweeter и UIP400MTP сада редефинишу начин на који лабораторије обрађују велике групе узорака, нарочито у фосфопротеомици са високим капацитетом обраде узорака.

Научни значај ефикасне припреме узорака у фосфопротеомици

Фосфорилација протеина је веома динамична и реверзибилна посттранслациона модификација која обухвата већину протеина у људским ћелијама. Она регулише структуру протеина, њихову локализацију и мреже интеракција, а поремећај њене регулације повезан је са болестима као што су рак и неуродегенерација.
Међутим, фосфопротеомска анализа доноси јединствене техничке изазове. Фосфорилисани пептиди су често заступљени у малим количинама и захтевају пажљиво обогаћивање и веома ефикасну припрему узорака у претходним фазама. Свака неефикасност током екстракције или дигестије протеина може довести до губитка сигнала, слабе репродуктивности и непотпуне обухваћености фосфорилационих места.
Управо ту соникација постаје пресудна.

Зашто соникација мења екстракцију протеина

Соникација користи ултразвучне таласе високог интензитета за механичко разарање ћелија и ткива, омогућавајући ефикасно ослобађање протеина из ћелија, ткива, биолошких течности и ванћелијских везикула. У поређењу са конвенционалним техникама лизе, соникација нуди неколико изразитих предности:

• Прво, она обезбеђује брзо и уједначено разарање ћелија, што је посебно важно за очување пролазних стања фосфорилације. У фосфопротеомици чак и мала кашњења или непотпуна лиза могу променити сигналне профиле, због чега је брза и репродуктивна екстракција неопходна.
• Друго, соникација побољшава принос и солубилизацију протеина, нарочито код узорака који се тешко лизирају, као што су густа ткива или ћелије богате мембранама. То непосредно доводи до боље дигестије у наредним фазама и већег искоришћења фосфопептида.
• Треће, ултразвучна обрада по својој природи омогућава повећање обима. Уређаји попут VialTweeter омогућавају истовремену соникацију више заптивених епрувета, обезбеђујући идентичне услове обраде свих узорака. Тиме се елиминише варијабилност коју уноси ручно руковање.
• За захтеве за још већим капацитетом обраде узорака, UIP400MTP представља велики технолошки искорак. Он омогућава директну соникацију целих микроплоча или сталака са епруветама, укључујући бочице за аутоматске узоркиваче, што га чини идеалним за паралелну обраду стотина узорака. Ова могућност је посебно драгоцена у системској биологији и клиничким истраживањима, где су велике групе узорака стандард.

Соникација са високим капацитетом обраде узорака: VialTweeter и UIP400MTP у фокусу

Интеграција напредних ултразвучних уређаја у фосфопротеомске радне поступке није само погодност – она представља методолошко унапређење.
VialTweeter је пројектован за синхронизовану ултразвучну обраду више затворених бочица, уз свођење унакрсне контаминације на најмању меру и обезбеђивање репродуктивности. Посебно је погодан за примене са средњим капацитетом обраде узорака и стандардизоване радне поступке.
 

Насупрот томе, UIP400MTP је оптимизован за окружења са високим капацитетом обраде узорака, омогућавајући:

• Равномерна соникација целих стандардних микроплоча, нпр. плоча са 96 или 384 бунарчића
• Директна обрада сталака са епруветама и вијала за аутоматски узоркивач
• Значајно смањење времена потребног за ручни рад
• Побољшана репродуктивност у великим скуповима података

Ова скалабилност савршено одговара савременим приступима у фосфопротеомици, у којима се током радних поступака рутински паралелно обрађују десетине до стотине узорака.

Општи протокол за припрему фосфопротеомских узорака уз помоћ соникације

Робустан фосфопротеомски радни поступак обједињује ефикасну екстракцију протеина, ензимску дигестију и обогаћивање фосфопептида. Следећи преглед одражава утврђене најбоље праксе прилагођене припреми заснованој на соникацији:

1. Брзо заустављање биохемијских реакција и прикупљање узорака
   Биохемијске реакције у ћелијама или ткивима брзо се заустављају – обично наглим замрзавањем – како би се очувала стања фосфорилације. Овај корак је кључан због пролазне природе догађаја фосфорилације.
2. Ултразвучна лиза ћелија и екстракција протеина
   Узорци се одмрзавају и подвргавају соникацији, обично у кратким циклусима. Ултразвучна енергија разара ћелијске мембране и ефикасно ослобађа протеине. У валидираним радним поступцима соникација се изводи у више циклуса како би се обезбедила потпуна лиза.
   Пример: Након одмрзавања узорака на леду, лиза ћелија постигнута је соникацијом, нпр. помоћу уређаја Vialtweeter током 2 циклуса, при чему је сваки циклус трајао 1 min.
3. Бистрење и квантификација протеина
   Након лизе, узорци се центрифугирају ради уклањања остатака. Супернатант који садржи растворљиве протеине прикупља се и квантификује како би се обезбедила уједначена улазна количина у свим узорцима.
4. Редукција и алкилација
   Дисулфидне везе се редукују (нпр. помоћу DTT) и алкилују (нпр. помоћу IAA) како би се протеини стабилизовали и побољшала ефикасност дигестије.
5. Протеолитичка дигестија
   Протеини се ензимски разграђују, обично трипсином, при чему настају пептиди погодни за анализу масеном спектрометријом. Прочитајте више о ултразвучно убрзаној дигестији протеина!
6. Пречишћавање пептида и одсољавање
   Пептиди се пречишћавају методама заснованим на C18 како би се уклониле нечистоће које би могле да ометају LC-MS анализу.
7. Обогаћивање фосфопептида
   С обзиром на малу заступљеност фосфорилисаних пептида, примењују се технике обогаћивања, као што су афинитетне методе са Fe-NTA или TiO₂, ради селективног издвајања фосфопептида.
8. LC-MS/MS анализа и обрада података
   Обогаћени узорци анализирају се масеном спектрометријом високе резолуције, често уз прикупљање података независно од података (DIA), ради побољшане квантификације и репродуктивности.

Посебно треба истаћи да се радни поступци великог обима могу прилагодити формату плоча са 96 бунарчића, што омогућава паралелну обраду и до више стотина узорака – приступ који је у потпуности компатибилан са соникацијом помоћу уређаја UIP400MTP.
 

Оптимизован протокол за брзо заустављање биохемијских реакција у фосфопротеому, обогаћивање фосфопептида и Phos-DIA-MS.
Протокол и слика: ©Die et al. 2023

Побољшање репродуктивности и квалитета података соникацијом

Један од главних изазова у фосфопротеомици јесте постизање доследне квантификације у великим скуповима података. Варијабилност настала током припреме узорака може прикрити биолошки значајне разлике.

Соникација решава овај проблем тако што обезбеђује:

1. Стандардизован унос енергије у све узорке
2. Смањену варијабилност услед ручног рада
3. Побољшану репродуктивност екстракције и дигестије протеина

У комбинацији са платформама за обраду великог броја узорака, као што је UIP400MTP, соникација омогућава лабораторијама да постигну ниво доследности који је неопходан за истраживања у системској биологији и откривање клиничких биомаркера.

Будућност фосфопротеомике: аутоматизација и скалабилност

Како се примена фосфопротеомике и даље шири на истраживања великог обима и клиничке примене, потражња за аутоматизацијом и капацитетом обраде узорака само ће расти. Припрема узорака заснована на соникацији, нарочито када је интегрисана са системима компатибилним са микроплочама, представља кључну технологију која то омогућава.
Комбиновањем ефикасне ултразвучне лизе, паралелне обраде и компатибилности са аутоматизованим радним токовима, уређаји као што су VialTweeter и UIP400MTP постављају нове стандарде у припреми узорака за протеомику.
Прочитајте више о интеграцији уређаја UIP400MTP у аутоматизоване лабораторијске радне токове!

Искористите предности припреме узорака потпомогнуте соникацијом у фосфопротеомици!

Екстракција протеина потпомогнута соникацијом постала је кључна компонента савремене фосфопротеомике, пружајући ненадмашну ефикасност, скалабилност и репродуктивност. Уз растућу потребу за анализом сложених биолошких система у великим кохортама узорака, ултразвучне технологије нису само корисне – оне су неопходне.
Омогућавајући стандардизоване радне токове са високим капацитетом обраде узорака, решења као што су VialTweeter и UIP400MTP убрзавају открића у области ћелијске сигнализације, механизама болести и прецизне медицине.

Пројектовање, производња и консалтинг – квалитет произведен у Немачкој

Hielscher ултразвучни уређаји добро су познати по највишим стандардима квалитета и дизајна. Робусност и једноставно руковање омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних уређаја у индустријска постројења. Hielscher ултразвучни уређаји лако се носе са тешким условима и захтевним окружењима.

Hielscher Ultrasonics је компанија са ISO сертификатом и посебан нагласак ставља на ултразвучне уређаје високих перформанси који се одликују најсавременијом технологијом и лакоћом употребе. Наравно, Hielscher ултразвучни уређаји усаглашени су са CE захтевима и испуњавају захтеве UL, CSA и RoHs.

Hielscher модели соникатора за више узорака UIP400MTP за микроплоче, VialTweeter и CupHorn: брза припрема узорака са високим капацитетом обраде