Екстракција протеина из туморског ткива потпомогнута соникацијом – протокол

Овај протокол описује методу екстракције протеина из туморског ткива потпомогнуту соникацијом, која унапређује стандардни CPTAC поступак лизе уреом додавањем контролисаног корака соникације сондом током разарања ткива. Надовезујући се на утврђену CPTAC стратегију припреме протеома и фосфопротеома за дубинску анализу, ова модификација побољшава разарање ћелија и субћелијских структура, смањује вискозност узорка и побољшава ослобађање протеина који се обично теже издвајају само лизом уреом, посебно протеина везаних за мембране и протеина који се везују за ДНК или су повезани са једром. У студији на којој се овај протокол заснива, поступак потпомогнут соникацијом повећао је детекцију и протеина и фосфопептида, уз очување компатибилности са наредним корацима дигестије по CPTAC поступку, обележавања помоћу TMT, фракционисања, обогаћивања фосфопептида и анализе LC-MS/MS.

Екстракција протеина из туморског ткива потпомогнута соникацијом за дубинску протеомску и фосфопротеомску анализу

Следећи протокол је оптимизован за екстракцију протеина из криогено уситњеног туморског ткива у пуферу за лизу са 8 M урее: додатни корак соникације сондом побољшава издвајање тешко доступних класа протеина, посебно протеина повезаних са мембранама и протеина повезаних са ДНК или једром, пре дигестије и накнадне анализе LC-MS/MS. У студији Li et al. (2025), на којој се овај протокол заснива, додавање соникације повећало је детекцију протеина повезаних са мембранама и једром и омогућило дубинску покривеност са >12.000 протеина и >25.000 фосфопептида у оквиру њиховог поступка.

Област примене протокола

Користите овај поступак за:

• свеже замрзнуто, криогено уситњено туморско ткиво
• ћелијске талоге или друге биолошке узорке за које је екстракција на бази урее већ успостављена
• поступке глобалне протеомике и фосфопротеомике који користе трипсинску дигестију и опционо обележавање помоћу TMT

У студији Li et al. (2025) наводи се да је поступак применљив и на друге типове узорака, као што су ћелијске линије, крв и урин, али може бити потребна оптимизација у зависности од типа узорка.

Оптимизован поступак припреме узорака са уведеним кораком соникације. Оптимизовани поступак и експериментални дизајн засновани су на CPTAC протоколу припреме узорака за глобалну протеомску и фосфопротеомску анализу.
Студија и шема: ©Li et al., 2025

Принцип рада

У оригиналној студији соникација је додата стандардном CPTAC поступку лизе уреом и утврђена је побољшана детекција протеина повезаних са мембранама и једрима. Аутори наводе да се параметри соникације морају прецизно подесити у складу са величином/концентрацијом узорка – избором величине сонотроде, уноса енергије и временског распореда импулса.

На пример, за Hielscher UP200Ht и UP200St то значи:

• користите амплитуду и импулсни режим као главне контролне променљиве
• одржавајте узорке хладним све време (тј. на леду)
• почните са благим подешавањима
• оптимизујте према бистрини узорка, температури, приносу протеина и квалитету пептида за наредне кораке

 
Оба модела соникатора Hielscher снаге 200 вати, UP200Ht и UP200St, пројектована су за мале и средње запремине узорака, са подесивом амплитудом и подешавањима импулса; оба ултразвучна хомогенизатора нуде дигитално управљање преко екрана осетљивог на додир за прецизно подешавање параметара, аутоматско бележење података, прикључни температурни сензор, даљинско управљање и осветљење узорка.
 

Реагенси за екстракцију протеина потпомогнуту соникацијом

Пуфер за лизу са уреом

Припремите свеж раствор непосредно пре употребе:

• 8 M уреа
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL апротинин
• 10 µg/mL леупептин
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Коктел инхибитора фосфатаза 2, 1:100 (v/v)
• Коктел инхибитора фосфатаза 3, 1:100 (v/v)

Уреа мора бити потпуно растворена пре додавања адитива; инхибиторе треба додати непосредно пре употребе; пуфер треба држати на леду; а након додавања адитива препоручује се мешање кружним покретима уместо снажног мешања на вортекс мешалици.
 

Додатни реагенси:

• Реагенси за BCA одређивање протеина
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Јодоацетамид
• LysC
• Трипсин
• Мравља киселина
• TMT реагенси, ако се користи мултиплексна квантитативна протеомика
• IMAC реагенси, ако се врши обогаћивање фосфопептида

Опрема за екстракцију протеина потпомогнуту соникацијом

Неопходно

Препоручени избор сонде

За узорке запремине око 200–1000 µL користите сонотроду малог пречника погодну за директну обраду малих запремина високим интензитетом. Hielscher нуди сонотроде различитих пречника, а мањи пречници врха обезбеђују већи интензитет на врху.

Практична напомена: Користите најмању сонду која омогућава ефикасно мешање без прекомерног стварања пене или додиривања зида посуде.

Ако истовремено радите са више узорака, можете размотрити употребу соникатора VialTweeter за више епрувета или соникатора UIP400MTP за микроплоче!

Упутства корак по корак: поступак екстракције протеина потпомогнуте соникацијом

A. Претходно хлађење и припрема

1. Охладите центрифугу на 4°C.
2. Припремите свеж пуфер са уреом за лизу и држите га на леду.
3. Поставите UP200Ht или UP200St на сталак унутар звучноизолационог кућишта.
4. Припремите ледено купатило довољно велико да епрувете са узорцима стоје усправно и стабилно.

Припрема свежег пуфера и рад на ниској температури од пресудног су значаја.

B. Почетна екстракција уреом

1. Држите криопулверизовано ткиво на леду.
2. Додајте 200 µL охлађеног пуфера са уреом за лизу на сваких 50 mg влажног ткива.
3. Мешајте на вортекс мешалици 5–10 s великом брзином.
4. Инкубирајте 15 min на 4°C.
5. Поновите корак мешања на вортекс мешалици и инкубације још једном.
6. Центрифугирајте на 20.000g током 10 min на 4°C.
7. Пренесите лизат/супернатант у чисту епрувету са слабим везивањем протеина.

C. Соникација помоћу UP200Ht или UP200St

Почетни услови за соникацију

• Амплитуда: почните са 20–30%
• Трајање импулса: 5 s укључено
• Хлађење: 2 min на леду између импулса
• Број циклуса: 4 циклуса
• Укупно време активне соникације: 20 s
• Укупно време поступка, укључујући хлађење: око 8–10 min

Кораци соникације

1. Пренесите лизат у епрувету погодну за соникацију. Користите уску епрувету танких зидова која омогућава добру размену топлоте и безбедно урањање сонде.
2. Ставите епрувету у ледено купатило. У раду је хлађење током соникације наведено као пресудно за спречавање оштећења услед загревања.
3. Уроните врх сонде у узорак. Држите врх довољно уроњен за стабилну кавитацију, али не дозволите да додирује зид или дно епрувете.
4. Примените један импулс од 5 s при почетној амплитуди.
5. Одмах вратите цео узорак на лед на 2 min.
6. Понављајте док се не заврше 4 циклуса.
7. Прегледајте лизат након циклуса.
8. Наставите само ако је потребно, примењујући по један додатни импулс од 5 s, увек уз потпуно хлађење након њега.
9. Зауставите поступак када лизат постане уједначенији и мање кончаст/вискозан.
   Крајња тачка је прозрачнији лизат који образује капи уместо непрекидног вискозног млаза.
10. Центрифугирајте на око 16.000g током 15 min на 4°C.
11. Пренесите избистрени супернатант у нову епрувету и измерите концентрацију протеина.

Поређење глобалне протеомике и фосфопротеомике соницираних и несоницираних узорака.
a. Број идентификованих протеина (глобална протеомика) у свим PDX туморским ткивима са соникацијом или без ње. b. Број идентификованих фосфопептида (IMAC обогаћивање) у свим PDX туморским ткивима са соникацијом или без ње. Убројани су само протеини и фосфопептиди чији је однос заступљености већи од или једнак 25. перцентилу. Однос заступљености израчунат је између истих типова узорака.
Студија и графикони: ©Li et al., 2025

Накнадна дигестија и анализа

Након соникације и бистрења, наставите како је описано у оригиналном поступку по моделу CPTAC:

1. Разблажите лизат у односу 1:3 (v/v) пуфером 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, да бисте смањили концентрацију урее на <2 M.
2. Додајте LysC у количини од 1 mAU на 50 µg протеина и инкубирајте 2 h на 25°C.
3. Додајте трипсин у односу ензим:супстрат 1:49 (w/w) и спроводите дигестију преко ноћи на 25°C.
4. Зауставите реакцију додавањем мравље киселине до коначне концентрације од 1%.
5. Наставите са одсољавањем, TMT обележавањем, фракционисањем, обогаћивањем фосфопептида и LC-MS/MS анализом према потреби.

Диференцијална експресија фосфопептида утврђена масеном спектрометријом уз TMT обележавање.
a. Базални подтип, са истакнутим појединим хуманим фосфопептидима (почетак и крај протеинске секвенце) чија је експресија повећана у соникованим узорцима у поређењу са несоникованим узорцима. b. Луминални подтип, са истакнутим појединим хуманим фосфопептидима (почетак и крај протеинске секвенце) чија је експресија повећана у соникованим узорцима у поређењу са несоникованим узорцима. c. Обогаћени KEGG путеви на основу протеина којима припадају фосфопептиди са повећаном експресијом у соникованим туморима базалног подтипа. d. Обогаћени KEGG путеви на основу протеина којима припадају фосфопептиди са повећаном експресијом у соникованим туморима луминалног подтипа.
Студија и графикони: ©Li et al., 2025

Пројектовање, производња и саветовање – квалитет произведен у Немачкој

Ултразвучни уређаји Hielscher познати су по највишим стандардима квалитета и дизајна. Робусност и једноставно руковање омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних уређаја у индустријска постројења. Ултразвучни уређаји Hielscher лако се носе са тешким условима и захтевним окружењима.

Hielscher Ultrasonics је компанија са ISO сертификатом и посебан нагласак ставља на ултразвучне уређаје високих перформанси који се одликују најсавременијом технологијом и једноставношћу употребе. Наравно, ултразвучни уређаји Hielscher усаглашени су са CE и испуњавају захтеве UL, CSA и RoHs.

Литература / Референце

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.