Sonikation-uz pomoć ekstrakcije proteina iz tumorskog tkiva – протокола

Ovaj protokol opisuje metodu ekstrakcije proteina uz pomoć ultrazvuka za tumorsko tkivo koja unapređuje standardni CPTAC tok lize uree dodavanjem kontrolisanog koraka sonde tokom poremećaja tkiva. Oslanjajući se na uspostavljenu strategiju pripreme CPTAC proteoma i fosfoproteoma, ova modifikacija poboljšava poremećaj ćelijske i subcelularne strukture, smanjuje viskoznost uzorka i poboljšava oslobađanje proteina koji se obično teže oporavljaju samo lizom uree, posebno proteina vezanih za membranu i vezivanje DNK ili proteina povezanih sa jezgrom. U osnovnoj studiji, tok rada uz pomoć ultrazvuka povećao je detekciju i proteina i fosfopeptida uz očuvanje kompatibilnosti sa nizvodnim varenjem u stilu CPTAC-a, TMT označavanjem, frakcioniranjem, obogaćivanjem fosfopeptida i LC-MS / MS analizom cevovoda.

Ekstrakcija proteina uz pomoć ultrazvuka iz tumorskog tkiva za duboku proteomsku i fosfoproteomsku analizu

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Oblast primene Protokola

Koristite ovu proceduru za:

• sveže zamrznuto, kriopulverizovano tumorsko tkivo
• ćelijske pelete ili druge biološke uzorke u kojima je već uspostavljena ekstrakcija na bazi uree
• globalni tokovi proteomike i fosfoproteomike koji koriste triptičko varenje i opciono TMT označavanje

Studija Li et al. (2025) navodi da je radni tok primenljiv i na druge tipove uzoraka, kao što su ćelijske linije, krv i urin, međutim optimizacija može biti potrebna prema tipu uzorka.

Optimizovan tok pripreme uzorka sa implementiranim korakom ultrazvuka. Optimizovani tok posla i eksperimentalni dizajn zasnivaju se na protokolu pripreme uzorka CPTAC za globalnu proteomsku i fosfoproteomsku analizu.
Studija i šema: ©Li et al., 2025

Принцип рада

Prvobitna studija dodala je ultrazvuk standardnom CPTAC toku lize uree i pronašla poboljšanu detekciju proteina povezanih sa membranama i jezgrama. Autori navode da parametri ultrazvuka moraju biti fino podešeni u pogledu veličine uzorka / koncentracije – izborom veličine sonotrode, unosa energije i vremena impulsa.

Primerno, za Hielscher UP200Ht i UP200St, to znači:

• Koristite amplitudni i pulsni režim kao glavne kontrolne varijable
• Držite uzorke hladne tokom cele (tj. Na ledu)
• Počnite sa konzervativnim podešavanjima
• optimizacija protiv jasnoće uzorka, temperature, prinosa proteina i nizvodnog kvaliteta peptida

 
Oba Hielscher 200 vati sonicator modeli UP200Ht i UP200St su dizajnirani za male i srednje zapremine uzoraka, sa podesivim amplitude i podešavanja pulsa; Oba ultrazvučna homogenizatora obezbeđuju digitalnu kontrolu ekrana osetljivog na dodir za precizno podešavanje parametara, automatsko snimanje podataka, senzor temperature pluggable, daljinski upravljač, osvetljenje uzorka.
 

Reagensi za ekstrakciju proteina uz pomoć ultrazvuka

Pufer za lizu uree

Pripremite sveže neposredno pre upotrebe:

• 8 M uree
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8.0
• 1 mM EDTA
• 2 μg / ml aprotinin
• 10 μg / ml leupeptina
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 μM PUGNAc
• Koktel inhibitora fosfataze 2, 1: 100 (v / v)
• Koktel inhibitora fosfataze 3, 1:100 (v / v)

Urea mora biti potpuno rastvorena pre dodavanja aditiva; inhibitore treba dodati neposredno pre upotrebe; tampon treba držati na ledu; i vrtloženje, a ne snažno vrtloženje se preporučuje nakon dodavanja aditiva.
 

Dodatni reagensi:

• BCA protein test reagensi
• 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
• Bilten
• Jodoacetamid
• OMILjENO
• трипсин
• Mravlja kiselina
• TMT reagensi, ako se koristi multipleksirana kvantitativna proteomika
• IMAC reagensi, ako se vrši obogaćivanje fosfopeptida

Oprema za ekstrakciju proteina uz pomoć ultrazvuka

Obavezno

Preporučeni izbor sonde

Za uzorke oko 200–1000 μL, koristite sonotrodu malog prečnika koja je pogodna za direktnu obradu malih količina visokog intenziteta. Hielscher nudi više prečnika sonotrode, a manji prečnici vrhova obezbeđuju veći intenzitet na vrhu.

Praktična napomena: Koristite najmanju sondu koja daje efikasno mešanje bez prekomernog penjenja ili kontakta sa zidom posude.

Ako radite sa više uzoraka u isto vreme, možete razmotriti Multi-Tube Sonicator VialTveeter или Microplate Sonicator UIP400MTP!

Korak-po-korak uputstva: Postupak ekstrakcije proteina uz pomoć ultrazvuka

A. Prethodno ohladite i pripremite

1. Ohladite centrifugu na 4 ° C.
2. Pripremite svež pufer za lizu uree i držite ga na ledu.
3. Podesite UP200Ht ili UP200St na postolje unutar zvučnog kućišta.
4. Pripremite ledenu kupku dovoljno veliku da drži epruvete za uzorke uspravno i stabilno.

Sveža priprema pufera i hladno rukovanje su kritični.

B. Inicijalna ekstrakcija uree

1. Držite kriopulverizovano tkivo na ledu.
2. Dodati 200 μL rashlađenog pufera za lizu uree na 50 mg vlažnog tkiva.
3. Vrtlog 5–10 s pri velikoj brzini.
4. Inkubirati 15 min na 4 ° C.
5. Ponovite korak vrtloga plus inkubacije još jednom.
6. Centrifuga na 20.000g za 10 min na 4°C.
7. Prenesite lizat / supernatant u čistu cev sa niskim vezivanjem.

C. Sonikacija sa korišćenjem UP200Ht ili UP200St

Polazni uslovi za sonikaciju

• Amplituda: počnite od 20–30%
• Dužina impulsa: 5 s ON
• Hlađenje: 2 min na ledu između impulsa
• Broj ciklusa: 4 ciklusa
• Ukupno aktivno vreme ultrazvuka: 20 s
• Ukupno vreme procesa, uključujući hlađenje: oko 8–10 min

Sonication Koraci

1. Prenesite lizat u cev pogodnu za sonikaciju. Koristite usku, tankozidnu cev koja omogućava dobru razmenu toplote i sigurno uranjanje sonde.
2. Stavite cev u ledenu kupku. U radu se identifikuje hlađenje tokom ultrazvuka kao kritično za sprečavanje oštećenja toplote.
3. Uronite vrh sonde u uzorak. Držite vrh dovoljno potopljen za stabilnu kavitaciju, ali ne dozvolite da dodiruje zid ili dno cevi.
4. Pokrenite jedan KSNUMKS s puls na početnoj amplitudi.
5. Odmah vratite uzorak u potpunosti u led za 2 min.
6. Ponavljajte dok se ne završe 4 ciklusa.
7. Pregledajte lizat nakon ciklusa.
8. Nastavite samo ako je potrebno, koristeći jedan dodatni 5 s puls u isto vreme, uvek praćeno punim hlađenjem.
9. Zaustavite se kada lizat postane ujednačen i manje žilav / viskozan.
   Krajnja tačka je prozirniji lizat koji formira kapi, a ne kontinuirani viskozni protok.
10. Centrifuga na oko 16,000g za 15 min na 4 ° C.
11. Prenesite razjašnjeni supernatant u svežu epruvetu i izmerite koncentraciju proteina.

Poređenje globalne proteomike i fosfoproteomike između sonicated i ne-sonicated uzoraka.
a. Broj identifikovanih proteina (globalna proteomika) u svim PDKS tumorskim tkivima sa ili bez ultrazvuka. b. Broj identifikovanih fosfopeptida (IMAC obogaćivanje) u svim PDKS tumorskim tkivima sa ili bez ultrazvuka. Brojani su samo proteini i fosfopeptidi sa odnosom obilja većim ili jednakim 25. percentilu. Odnos obilja je izračunat između istih tipova uzoraka.
Studija i grafikoni: ©Li et al., 2025

Nizvodno varenje i analiza

Nakon ultrazvuka i pojašnjenja, postupite kao što je opisano u originalnom toku posla u stilu CPTAC-a:

1. Razblažite lizat 1: 3 (v / v) sa 50 mM Tris-HCl pH 8.0 da biste smanjili ureu na <2 M.
2. Dodajte LysC na 1 mAU na 50 μg proteina i inkubirajte 2 h na 25 ° C.
3. Dodajte tripsin na 1:49 enzim: supstrat (v / v) i svarite preko noći na 25 ° C.
4. Ugasite mravljom kiselinom do 1% finala.
5. Nastavite sa dessalting, TMT označavanje, frakcioniranje, fosfopeptid obogaćivanje, i LC-MS / MS po potrebi.

Diferencijalna ekspresija fosfopeptida iz TMT-obeleženog MS-a.
a. Bazalni podtip, naglašavajući neke ljudske fosfopeptide (protein-sekvenca početak i kraj) upregulisana u sonicated uzorcima u poređenju sa nesonicated uzorcima. b. Luminalni podtip, naglašavajući neke ljudske fosfopeptide (protein_sequence počinju i završavaju) regulisani u sonicated uzorcima u poređenju sa nesonicated uzorcima. c. Obogaćeni KEGG putevi zasnovani na proteinima regulisanih fosfopeptida u sonikiranom bazalnom podtipu tumora. d. Obogaćeni KEGG putevi zasnovani na proteinima upregulisanih fosfopeptida u sonicated luminal podtip tumora.
Studija i grafikoni: ©Li et al., 2025

Дизајн, производња и консалтинг – Квалитет Маде ин Германи

Хиелсцхер ултрасоникатори су познати по свом највишем квалитету и стандардима дизајна. Робусност и једноставан рад омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних апарата у индустријске објекте. Хиелсцхер ултрасоникатори се лако носе са тешким условима и захтевним окружењима.

Хиелсцхер Ултрасоницс је ИСО сертификована компанија и ставља посебан нагласак на ултрасоникаторе високих перформанси са најсавременијом технологијом и једноставношћу за коришћење. Наравно, Хиелсцхер ултрасоникатори су усаглашени са ЦЕ и испуњавају захтеве УЛ, ЦСА и РоХ.

Литература / Референце