Уситњавање хроматина соникацијом

Уситњавање хроматина је кључни корак у многим радним поступцима у епигенетици и молекуларној биологији, нарочито у имунопреципитацији хроматина (ChIP), ChIP-seq и сродним анализама. Циљ је фрагментација хроматина на комплексе ДНК–протеин уз поновљиве резултате, очување интегритета епитопа и свођење губитка узорка на минимум. Међу доступним методама, ултразвучна фрагментација хроматина постала је широко коришћен приступ јер омогућава поуздану фрагментацију без реагенаса, уз одличну поновљивост.

Шта треба узети у обзир при уситњавању хроматина?

Ефикасно уситњавање хроматина захтева пажљиву контролу експерименталних параметара. Неодговарајућа фрагментација може угрозити накнадне ChIP експерименте стварањем фрагмената који су превелики, прекомерно разграђени или неуједначени између узорака.
Један од најважнијих фактора је жељена расподела величина фрагмената. За већину примена ChIP и ChIP-seq оптимални су фрагменти хроматина величине између 100 и 600 базних парова. Овај опсег величина омогућава ефикасну имунопреципитацију, истовремено обезбеђујући довољну резолуцију за геномско мапирање.

Још један кључни фактор је ефикасност унакрсног повезивања пре соникације. Већина ChIP поступака укључује фиксацију формалдехидом ради стабилизације интеракција протеин–ДНК. Међутим, прекомерно унакрсно повезивање може учинити хроматин отпорнијим на фрагментацију, што захтева дуже време соникације и потенцијално повећава изложеност топлоти.
Контрола температуре је такође од пресудног значаја. Соникација локално ствара енергију која може повећати температуру узорка. Повишене температуре могу оштетити ДНК или денатурисати протеине, што утиче на препознавање антигена антителима током ChIP поступка. Зато многи истраживачи примењују циклусе пулсне соникације у комбинацији са интервалима хлађења како би одржали стабилност узорка.
Концентрација и запремина узорка такође утичу на ефикасност фрагментације. Висококонцентроване суспензије хроматина могу захтевати дуже време соникације, док мале запремине узорака захтевају прецизно довођење енергије како би се спречила прекомерна обрада.
На крају, избор уређаја за соникацију снажно утиче на поновљивост експеримената. Уређаји намењени уситњавању хроматина обично обезбеђују контролисану ултразвучну енергију и стандардизовано руковање узорцима, омогућавајући уједначену фрагментацију више узорака.

Који соникатор одабрати за уситњавање хроматина?

Различити лабораторијски радни поступци захтевају различите конфигурације за соникацију. Оптимални систем у великој мери зависи од броја узорака који се обрађују у јединици времена, запремине и формата експеримента.

Соникатор са сондом

Соникатор са сондом доводи ултразвучну енергију директно у узорак преко титанијумске сонде. Ова конфигурација обезбеђује веома високу густину енергије и стога је погодна за снажно разарање хроматина у појединачним узорцима.

Соникатори са сондом су нарочито корисни за:

• Мали до средњи број узорака
• Хроматин који се тешко фрагментише
• Флексибилне експерименталне протоколе

Соникатор за више епрувета – VialTweeter

За лабораторије које истовремено обрађују више узорака, соникатор за више епрувета VialTweeter представља решење са високим степеном поновљивости. Систем преноси ултразвучну енергију индиректно преко држача бочица, омогућавајући фрагментацију узорака у неколико затворених епрувета под идентичним условима.

Ова конфигурација нуди значајне предности:

• Паралелно уситњавање хроматина у више узорака
• Елиминисање контаминације сонде
• Висока поновљивост између епрувета
• Поједностављен радни поступак за припрему ChIP узорака

Такви системи за више епрувета веома су погодни за рутинске ChIP експерименте и студије са средњим капацитетом обраде узорака.
 

Соникатор за микроплоче – UIP400MTP

Епигенетичке студије са великим капацитетом обраде узорака све више се ослањају на обраду узорака у микроплочама. Соникатор за микроплоче UIP400MTP пројектован је за фрагментацију хроматина директно у стандардним микроплочама, без преношења узорака.

Овај приступ омогућава:

• Истовремену обраду десетина или стотина узорака
• Радне поступке погодне за аутоматизацију
• Равномерна расподела ултразвучне енергије по бунарчићима
• Значајно смањење броја корака руковања узорцима

За велике пројекте скрининга методом ChIP-seq или епигенетичке студије са великом пропусношћу узорака, соникација у микроплочама пружа изузетну скалабилност и ефикасност. Соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP веома је погодан за интеграцију у системе за руковање течностима и аутоматизоване лабораторијске радне токове.
 

Зашто одабрати соникацију уместо других техника смицања хроматина?

У поређењу са ензимским приступима, соникација за ChIP омогућава фрагментацију без пристрасности, јер процес не зависи од активности ензима специфичне за одређене секвенце. То је посебно важно за епигенетичке студије на нивоу целог генома, у којима је равномерна покривеност неопходна.
Још једна велика предност је скалабилност. Ултразвучни системи могу да обрађују појединачне узорке, више епрувета или целе микроплоче, што лабораторијама омогућава да одаберу најпогоднију конфигурацију за свој обим експерименталне обраде узорака.
Коначно, соникација пружа одличну контролу над параметрима фрагментације. Подешавањем импулсних циклуса, трајања и нивоа снаге, истраживачи могу поуздано да постигну жељену расподелу величина фрагмената.

Како да одредим количину и проценим квалитет добијеног хроматина након ултразвучне фрагментације?

Након соникације за ChIP, истраживачи морају да процене и количину и квалитет фрагментисаног хроматина. Овај корак провере осигурава да фрагментација хроматина испуњава захтеве наредних примена, као што су ChIP-qPCR или ChIP-seq.
Квантификација обично почиње мерењем концентрације ДНК. Спектрофотометријске методе, као што је анализа помоћу уређаја Nanodrop, или флуорометријски тестови, као што је квантификација ДНК помоћу уређаја Qubit, пружају поуздане процене приноса хроматина након уклањања унакрсних веза и пречишћавања.
Међутим, сама концентрација ДНК не открива да ли је фрагментација била успешна. Истраживачи зато процењују расподелу величина фрагмената помоћу електрофоретских техника. Електрофореза у агарозном гелу и даље је често коришћен приступ за визуелизацију фрагмената ДНК и проверу да ли је већина унутар циљног опсега величина.
Напредније лабораторије често користе системе за капиларну електрофорезу, као што су Agilent Bioanalyzer или TapeStation. Ове платформе пружају прецизне профиле расподеле величина и омогућавају истраживачима да открију прекомерну фрагментацију или непотпуно смицање.

При процени квалитета хроматина након ултразвучне фрагментације, истраживачи обично потврђују следеће:

• Већина фрагмената ДНК налази се у опсегу 100–600 bp
• Расподела фрагмената је уједначена међу репликатним узорцима
• Разградња ДНК је минимална
• Укупан принос хроматина довољан је за планирани ChIP тест

Правилна контрола квалитета обезбеђује да корак ултразвучног фрагментирања хроматина даје поновљиве и биолошки значајне резултате.

Закључак: Ултразвучно фрагментирање хроматина за поуздана истраживања

Поуздано фрагментирање хроматина основа је успешних ChIP и епигенетичких истраживања. Ултразвучна фрагментација нуди моћно решење јер омогућава прецизно и поновљиво разбијање хроматина без реагенаса у широком распону експерименталних формата.
Пажљивом оптимизацијом параметара соникације, провером расподеле величина фрагмената и избором одговарајућег система за соникацију – било да је то соникатор са сондом, VialTweeter за више епрувета или соникатор за микроплоче UIP400MTP са високом пропусном моћи – истраживачи могу постићи уједначену фрагментацију хроматина која омогућава висококвалитетне ChIP и ChIP-seq резултате.
Како се епигенетичка истраживања све више усмеравају ка већој пропусној моћи и већој поновљивости експеримената, ултразвучно фрагментирање хроматина остаје једна од најсвестранијих и најпоузданијих метода доступних савременим лабораторијама за молекуларну биологију.

Пројектовање, производња и саветовање – квалитет произведен у Немачкој

Hielscher ултразвучни уређаји познати су по највишим стандардима квалитета и дизајна. Робусност и једноставно руковање омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних уређаја у индустријска постројења. Hielscher ултразвучни уређаји лако савладавају тешке услове и захтевна окружења.

Hielscher Ultrasonics је компанија са ISO сертификатом и посебан нагласак ставља на ултразвучне уређаје високих перформанси који се одликују најсавременијом технологијом и једноставном употребом. Наравно, Hielscher ултразвучни уређаји усаглашени су са CE захтевима и испуњавају захтеве UL, CSA и RoHs.

Литература / Референце

• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
• Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
• José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
• Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)