Протеомски токови рада са варењем протеина високог протока

Протеомика је суштинско поље за разумевање биолошких процеса и система, при чему варење протеина представља критичан корак у њеном току рада. Традиционално, варење протеина се спроводи у раствору коришћењем протеолитичких ензима попут трипсина, који специфично хидролизује пептидне везе на остацима лизина и аргинина. Овај процес генерише пептиде који су погодни за јонизацију и фрагментацију у применама масене спектрометрије (МС). Међутим, конвенционалне методе варења захтевају 12-24 сата да би се постигла завршетак, стварајући значајна уска грла у протеомским радним токовима.
Ултрасоницатион нуди моћну алтернативу, драматично скраћујући време варења са сати на само неколико минута. Када се комбинује са напредним соникаторима за више узорака као што су Хиелсцхер ЦупХорн, ВиалТвеетер и соникатор плоча са 96 јажица УИП400МТП, ултразвук омогућава убрзану протеомику високог протока. Ове технологије поједностављују радни процес, смањујући време припреме узорака и повећавајући ефикасност без угрожавања поновљивости или квалитета података.

Улога ултразвучне енергије у варењу протеина

Ултразвучна обрада користи фокусиране ултразвучне таласе за стварање кавитације—локализованих микромехурића који се колабирају и стварају интензивне силе смицања. Овај феномен појачава пренос масе, промовише мешање ензима са супстратима и развија протеинске структуре, излажући места цепања протеолитичким ензимима попут трипсина.
Резултат? Значајно смањење времена варења без угрожавања ефикасности или поновљивости.

Ултразвучна побољшана протеолитичка дигестија: методологија и резултати

Протокол за убрзано варење

Варење уз помоћ ултразвука комбинује протеолитичке ензиме и ултразвучну енергију како би се убрзао радни ток. На пример, коришћењем Хиелсцхер УП200Ст-ЦупХорн (200 В, 26 кХз), процес варења се одвија на следећи начин:

1. Редукција: Узорци протеина (0,5 мг/мЛ, 20 µЛ) су третирани са ДТТ (2 µЛ, 110 мМ) у амонијум бикарбонатном пуферу (12,5 мМ). Соникација се примењује при 50% амплитуде током 5 минута.
2. Алкилација: Након додавања ИАА (2 µЛ, 400 мМ), соникација се понавља под истим условима.
3. Дигестија: Узорци се разблажују и инкубирају са имобилисаним наночестицама трипсина. Последњи круг соникације (5 минута) завршава варење. Пептиди се одвајају, осуше и чувају за МС анализу.

Ова ултразвучна метода смањује укупно време припреме са 12 сати на мање од 30 минута. Упркос убрзаном процесу, принос и квалитет пептида остају у складу са традиционалним методама преко ноћи.

Ефикасност ултразвучне варења протеина

У упоредним студијама које користе протеоме Е. цоли:

• Идентификација протеина: Ултразвучно дигестирани узорци идентификовали су 777 протеина за 5 минута, у поређењу са 817 за 12 сати. Заједничке идентификације протеина премашиле су 70%.
• Поновљивост: Поновљене анализе су показале вредности корелације изнад 98% унутар сваке методе, показујући поузданост.
• Селективност: Одређени протеини су преференцијално дигестирани сваком методом, при чему је ултразвучна дигестија фаворизовала 65 протеина и варење преко ноћи 54 протеина. Такве нијансиране разлике наглашавају јединствени потенцијал ултразвучне обраде за специфичне примене.

Резултати квантификације протеина без ознака за седам протеина са шиљцима у Е. цоли
узорак. Следећи протеини су додати на два различита нивоа као што је наведено у колони
под називом „Тео Ратио“. Тхео Ратио је теоретски однос између два нивоа која се користе у овоме
експеримент. Говеђи серумски албумин (АЛБУ), β-лактоглобулин (ЛАЦБ), α-С1 казеин (ЦАСА1),
α-С2 казеин (ЦАСА2), цитохром ц (ЦИЦ), овалбумин (ОВАЛ) и карбоанхидраза 2
(ЦАХ2). Односи су израчунати коришћењем интензитета ЛФК протеина добијених од МакКуант-а
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Студија и графика: © Мартинс ет ал., 2019)

Трипсин имобилизован наночестицама

Интеграција имобилисаних наночестица трипсина (нпр. Т-ФМНП) са ултразвучном обрадом додатно побољшава токове рада протеомике. Ове наночестице обезбеђују велику површину за интеракције ензима и супстрата, повећавајући ефикасност. Када се примени на комплексне протеоме, као што је Е. цоли, комбинована метода постиже:

• Брзина: Завршите варење у року од 5 минута.
• тачност: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Прилагодљивост: Адаптација на платформе са више бунара као што је УИП400МТП омогућава обраду високог протока.

Кликните овде за детаљан протокол са упутствима корак по корак!
(уп. Мартинс ет ал., 2019)

Протеолитичко варење великом брзином и великом пропусношћу са Хиелсцхер соникаторима

Најбољи модели соникатора за протеомику

Хиелсцхер Ултрасоницс нуди различите моделе соникатора за истовремену припрему више узорака који олакшавају радни ток високог протока. Било да радите са бочицама, епруветама, плочама са више јажица (нпр. плочама са 6, 24, 96 јажица) или Петријевим посудама – нудимо вам идеалне соникаторе за ваше експерименте.

УИП400МТП соникатор плоча са више бунара

За крајњи проток, УИП400МТП пружа могућност ултразвучне обраде плоча са 96 јажица. Компатибилан са било којом стандардном микроплочом, УИП400МТП не захтева скупе власничке материјале за једнократну употребу и даје вам слободу да изаберете најбољу плочу са више јажица за ваше истраживање. Испоруком уједначене енергије преко плоче, омогућава брзу редукцију, алкилацију и варење до 200 сложених протеома за само 1 сат. Овај ниво аутоматизације и ефикасности је од кључног значаја за протеомику високе пропусности и клиничке примене. Сазнајте више о соникатору плоча са више бунара!

ВиалТвеетер

ВиалТвеетер је скројен за лабораторије које захтевају истовремену соникацију до 10 бочица или епрувета. Његов неинвазивни приступ елиминише ризике од унакрсне контаминације истовремено осигуравајући поновљиву варење протеина. Овај уређај је идеалан за истраживаче који раде са ограниченим количинама узорака или различитим типовима узорака.
Сазнајте више о ВиалТвеетер соникатору са више цеви!

Хиелсцхер УП200Ст-ЦупХорн

ЦупХорн соникатор је моћан уређај дизајниран за истовремену обраду више узорака у затвореним контејнерима. Осигурава равномерну расподелу ултразвучне енергије и прецизну контролу температуре. Могућност обраде до пет узорака истовремено, заједно са његовом компатибилношћу са смањеним, алкилованим и дигестираним радним токовима, чини ЦупХорн поузданим алатом за протеомику засновану на МС.
Сазнајте више о ЦупХорн СоноРеацтор-у!

Протокол корак по корак за протеолитичку варење уз помоћ ултразвука користећи трипсин имобилисан наночестицама

Овај протокол Мартинс ет ал. (2019) је оптимизован за брзо варење протеина коришћењем ултразвучне енергије и трипсина имобилисаног наночестицама (Т-ФМНП). Наведени кораци обезбеђују ефикасну редукцију, алкилацију и протеолизу погодну за примене масене спектрометрије (МС).
Кораци протокола

1. Редукција дисулфидних веза
   • Додати 2 µЛ ДТТ раствора (110 мМ) у узорак протеина од 20 µЛ (0,5 мг/мЛ) у АмБиц пуферу.
   • Ставите епрувету са узорком у сонореактор УП200Ст-ЦупХорн.
   • Соникирајте узорак 2,5 минута при 50% амплитуде (200 В, 26 кХз).
   • Паузирајте на кратак интервал да се охлади, а затим обрадите соникацијом још 2,5 минута под истим условима.
2. Алкилација редукованих остатака цистеина
   • Додати 2 µЛ раствора ИАА (400 мМ) редукованом узорку протеина.
   • Соницирајте 2,5 минута при 50% амплитуде да бисте олакшали алкилацију.
   • Паузирајте за хлађење, а затим обрадите соникацијом додатних 2,5 минута.

   Напомена: Минимизирајте излагање алкилованог узорка светлости да бисте спречили деградацију ИАА.

3. Разблаживање узорка
   • Разблажите узорак алкилованог протеина до крајње запремине од 100 µЛ користећи 25 мМ АмБиц пуфера који садржи 4% ацетонитрила (в/в).
   • Добро промешати благим пипетирањем.
4. Протеолитичка дигестија са трипсином имобилисаним наночестицама
   • Додати 20 µЛ раствора Т-ФМНП (3 мг/мЛ) у разблажени узорак протеина.
   • Соникирајте смешу у сонореактору 2,5 минута на 50% амплитуде.
   • Паузирајте за хлађење, а затим соникирајте још 2,5 минута под истим условима.
5. Одвајање наночестица трипсина
   • Користите магнет да одвојите Т-ФМНП од супернатанта који садржи дигестиране пептиде.
   • Пребаците супернатант у нову епрувету за микроцентрифугу.
6. Припрема пептида за МС анализу
   • Осушити супернатант који садржи пептиде у вакуумској центрифуги.
   • Чувати осушене пептиде на -20°Ц до даље анализе масеном спектрометријом.