Протеомски радни токови са разградњом протеина високог капацитета

Протеомика је кључна област за разумевање биолошких процеса и система, а разградња протеина представља пресудан корак у њеним радним токовима. Традиционално, разградња протеина спроводи се у раствору помоћу протеолитичких ензима попут трипсина, који специфично хидролизује пептидне везе на остацима лизина и аргинина. Овим процесом настају пептиди погодни за јонизацију и фрагментацију у применама масене спектрометрије (MS). Међутим, конвенционалне методе разградње захтевају 12–24 сата до завршетка, што ствара значајна уска грла у протеомским радним токовима.
Ултразвучна обрада нуди моћну алтернативу, драстично скраћујући време разградње са више сати на свега неколико минута. У комбинацији са напредним соникаторима за више узорака, као што су Hielscher CupHorn, VialTweeter и соникатор за плоче са 96 бунарчића UIP400MTP, ултразвучна обрада омогућава убрзану протеомику високог капацитета. Ове технологије поједностављују радне токове, скраћују време припреме узорака и повећавају ефикасност без нарушавања репродуктивности или квалитета података.

Улога ултразвучне енергије у разградњи протеина

Ултразвучна обрада користи фокусиране ултразвучне таласе за стварање кавитације – локализованих микромехурића који колабирају и стварају интензивне силе смицања. Ова појава побољшава пренос масе, подстиче мешање ензима са супстратима и развија протеинске структуре, чиме места цепања постају доступна протеолитичким ензимима попут трипсина.
Резултат? Значајно скраћење времена разградње без нарушавања ефикасности или репродуктивности.

Протеолитичка разградња побољшана ултразвуком: методологија и резултати

Протокол убрзане разградње

Разградња потпомогнута ултразвуком комбинује протеолитичке ензиме и ултразвучну енергију ради убрзавања радних токова. На пример, при употреби уређаја Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), радни ток разградње одвија се на следећи начин:

1. Редукција: Узорци протеина (0,5 mg/mL, 20 µL) третирају се DTT-ом (2 µL, 110 mM) у пуферу амонијум-бикарбоната (12,5 mM). Соникација се примењује при амплитуди од 50% током 5 минута.
2. Алкилација: Након додавања IAA (2 µL, 400 mM), соникација се понавља под истим условима.
3. Разградња: Узорци се разблажују и инкубирају са наночестицама са имобилисаним трипсином. Завршни циклус соникације (5 минута) довршава разградњу. Пептиди се одвајају, суше и чувају за MS анализу.

Ова ултразвучна метода скраћује укупно време припреме са 12 сати на мање од 30 минута. Упркос убрзаном процесу, принос и квалитет пептида остају упоредиви са традиционалним методама које се спроводе преко ноћи.

Ефикасност ултразвучне разградње протеина

У упоредним студијама на протеомима E. coli:

• Идентификација протеина: У узорцима разграђеним ултразвуком идентификовано је 777 протеина за 5 минута, у поређењу са 817 за 12 сати. Удео протеина идентификованих обема методама премашио је 70%.
• Репродуктивност: Поновљене анализе показале су вредности корелације изнад 98% у оквиру сваке методе, потврђујући поузданост.
• Селективност: Свака метода је првенствено разграђивала одређене протеине, при чему је ултразвучна разградња фаворизовала 65 протеина, а разградња преко ноћи 54 протеина. Овакве суптилне разлике истичу јединствени потенцијал ултразвучне обраде за специфичне примене.

Резултати квантификације протеина без обележавања за седам протеина додатих у
узорак E. coli. Следећи протеини додати су на два различита нивоа, како је наведено у колони
под називом „Theo Ratio“. Theo Ratio је теоријски однос између два нивоа коришћена у овом
експерименту. Говеђи серумски албумин (ALBU), β-лактоглобулин (LACB), α-S1 казеин (CASA1),
α-S2 казеин (CASA2), цитохром c (CYC), овалбумин (OVAL) и карбоанхидраза 2
(CAH2). Односи су израчунати коришћењем LFQ интензитета протеина добијених
анализом у програму MaxQuant. Студентов t-тест примењен је за поређење вредности добијених сваком методом (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Студија и графички приказ: © Martins et al., 2019)

Трипсин имобилисан на наночестицама

Комбиновање наночестица са имобилисаним трипсином (нпр. T-FMNPs) са ултразвучном обрадом додатно унапређује протеомичке радне токове. Ове наночестице обезбеђују велику површину за интеракције ензима са супстратом, чиме повећавају ефикасност. Када се примени на сложене протеоме, попут протеома E. coli, комбинована метода постиже:

• Брзина: Потпуна дигестија у року од 5 минута.
• Тачност: Квантификација протеина упоредива са традиционалним методама (p > 0,01, n=3).
• Скалабилност: Прилагођавање платформама за плоче са више бунарчића, као што је UIP400MTP, омогућава обраду великог броја узорака.

Кликните овде за детаљан протокол са упутствима корак по корак!
(уп. Martins et al., 2019)

Брза протеолитичка дигестија великог броја узорака помоћу Hielscher соникатора

Најбољи модели соникатора за протеомику

Hielscher Ultrasonics нуди различите моделе соникатора за истовремену припрему више узорака, што олакшава радне токове са великим бројем узорака. Без обзира на то да ли радите са бочицама, епруветама, плочама са више бунарчића (нпр. плочама са 6, 24 или 96 бунарчића) или Петријевим шољама – нудимо вам идеалне соникаторе за ваше експерименте.

UIP400MTP соникатор за плоче са више бунарчића

За највећи капацитет обраде узорака, UIP400MTP омогућава ултразвучну обраду плоча са 96 бунарчића. Компатибилан са сваком стандардном микроплочом, UIP400MTP не захтева скуп потрошни материјал специфичан за произвођача и даје вам слободу да изаберете најбољу плочу са више бунарчића за своје истраживање. Равномерним преносом енергије по целој плочи омогућава брзу редукцију, алкилацију и дигестију до 200 сложених протеома за само 1 сат. Овај ниво аутоматизације и ефикасности кључан је за протеомику са великим бројем узорака и клиничке примене. Сазнајте више о соникатору за плоче са више бунарчића!

VialTweeter

VialTweeter је прилагођен лабораторијама којима је потребна истовремена соникација до 10 бочица или епрувета. Његов неинвазивни приступ елиминише ризике од унакрсне контаминације, истовремено обезбеђујући репродуктивну дигестију протеина. Овај уређај је идеалан за истраживаче који раде са ограниченим запреминама узорака или разноврсним типовима узорака.
Сазнајте више о соникатору VialTweeter за више епрувета!

Hielscher UP200St-CupHorn

Соникатор CupHorn је моћан уређај намењен истовременој обради више узорака у затвореним посудама. Обезбеђује равномерну расподелу ултразвучне енергије и прецизну контролу температуре. Могућност истовремене обраде до пет узорака, заједно са компатибилношћу са радним токовима који обухватају редукцију, алкилацију и дигестију, чини CupHorn поузданим алатом за протеомику засновану на MS.
Сазнајте више о CupHorn SonoReactor!

Протокол корак по корак за протеолитичку дигестију потпомогнуту ултразвуком уз употребу трипсина имобилисаног на наночестицама

Овај протокол аутора Martins et al. (2019) оптимизован је за брзу дигестију протеина уз употребу ултразвучне енергије и трипсина имобилисаног на наночестицама (T-FMNPs). Наведени кораци обезбеђују ефикасну редукцију, алкилацију и протеолизу погодну за примене у масеној спектрометрији (MS).
Кораци протокола

1. Редукција дисулфидних веза
   • Додајте 2 µL раствора DTT (110 mM) у узорак протеина запремине 20 µL (0,5 mg/mL) у пуферу AmBic.
   • Поставите епрувету са узорком у сонореактор UP200St-CupHorn.
   • Соницирајте узорак 2,5 минута при амплитуди од 50% (200 W, 26 kHz).
   • Направите кратку паузу да бисте омогућили хлађење, а затим соницирајте још 2,5 минута под истим условима.
2. Алкилација редукованих цистеинских остатака
   • Додајте 2 µL раствора IAA (400 mM) у редуковани узорак протеина.
   • Соницирајте 2,5 минута при амплитуди од 50% да бисте олакшали алкилацију.
   • Направите паузу ради хлађења, а затим соницирајте још 2,5 минута.

   Напомена: Сведите излагање алкилованог узорка светлости на најмању могућу меру да бисте спречили разградњу IAA.

3. Разблаживање узорка
   • Разблажите алкиловани узорак протеина до коначне запремине од 100 µL користећи 25 mM пуфер AmBic који садржи 4% ацетонитрила (v/v).
   • Темељно измешајте благим пипетирањем.
4. Протеолитичка дигестија трипсином имобилисаним на наночестицама
   • Додајте 20 µL раствора T-FMNP (3 mg/mL) у разблажени узорак протеина.
   • Соницирајте смешу у сонореактору 2,5 минута при амплитуди од 50%.
   • Направите паузу ради хлађења, а затим соницирајте још 2,5 минута под истим условима.
5. Одвајање наночестица са трипсином
   • Помоћу магнета одвојите T-FMNPs од супернатанта који садржи пептиде настале дигестијом.
   • Пренесите супернатант у нову микроцентрифужну епрувету.
6. Припрема пептида за MS анализу
   • Осушите супернатант који садржи пептиде у вакуумској центрифуги.
   • Чувајте осушене пептиде на -20°C до даље анализе масеном спектрометријом.