Лиза квасних ћелија у микроплочама коришћењем високоинтензивне сонікације

Микробиолози и истраживачи у области животних наука који раде са саццхаромицес церевисиае, Пицхиа пасторис / Komagataella phaffii, и другим системима квасца знају изазов: квасне ћелије су робустне, поновљива лиза може бити тешка, а ручно уништавање узорака брзо постаје usko grlo када је потребно испитати многе сојеве, клонове, услове културе или конструкције експресије.

Лиза пивских квасаца високог пропусног капацитета за микробиологију, молекуларну биологију и аналитичку биологију протеина

Хиелшерови микроплочни соникатори као што су UIP400MTP (400 W) и UIP550MTP (550 W) пружају решење високог пропусног капацитета за механичку лиѕу ћелија квасца директно у микроплочама. Уместо обраде узорака један по један помоћу сонде, целе микроплоче могу бити сонниране под уједначеним условима. Ово чини ултразвучну лизу квасца бржом, поновљивијом и лакшом за интеграцију у модерне микробиолошке, експресију протеина, скрининг ензима и омске радне токове.
Bilo da vam je potrebno oslobađanje rekombinantnih proteina iz P. pastoris, priprema kvasnih lizata za enzimatske analize, disruptovanje S. cerevisiae za analizu proteina, ili ispitivanje desetina kvasnih klonova paralelno, Hielscher mikrotalasni sonikatori pružaju moćno disruptovanje ćelija zasnovano na kavitaciji sa preciznom kontrolom procesa.

Zašto kvasne ćelije zahtevaju efikasnu mehaničku lizu

Ћелије квасца је теже лизирати од многих бактеријских или сисара ћелија јер су заштићене крутим ћелијским зидом који се састоји углавном од полисахарида, глукана, маннопротеина и хитина. Овај ћелијски зид обезбеђује механичку стабилност, али такође ограничава ослобађање интрацелуларних протеина, нуклеинских киселина, метаболита и ензима.
Conventional yeast lysis methods include bead beating, enzymatic digestion, freeze-thaw cycles, chemical lysis, and probe-type sonication. These methods can be effective, but they also have limitations. Bead beating can introduce debris and heating, enzymatic digestion can add cost and variability, and single-sample probe sonication is time-consuming when large sample numbers must be processed.
Високинтензивна, фокусирана ултразвучна кавитација превазилази ова ограничења примењујући интензивне механичке сечуће силе, флуктуације притиска и микрострујање на суспензију квасца. Резултат је брзо разарање ћелијских зидова и мембрана, побољшано ослобађање унутар ћелија и веома репродуктивна припрема узорака у формату плоче.

Сонификација микроплоча за паралелну припрему узорака квасца

Hielscher UIP400MTP и UIP550MTP су дизајнирани за равномерну соникацију микроплоча, плоча са више бунарчића, ПЦР плоча и одговарајућих рекова за узорке. За разлику од сондиране соникације, узорци не морају бити третирани појединачно. Цео плоча је изложена контролисаној ултразвучној енергији, што чини радни ток веома погодним за паралелну обработку узорака.

Ово је посебно корисно за:

• скрининг С. цервизие мутанти или експресијске линије
• Лиза П. пасторис / К. phaffii клонови након експресије рекомбинасног протеина
• Припрема квасних лијата за ензимске анализе
• Экстракција протеина за SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS или тестирање активности
• Ослобађање унутрашњих метаболита за метаболомику
• Припрема ДНК и РНК узорака након одговарајуће downstream пречишћавања
• Хитро оптимизовање лијезних буфера, адитива и услова екстракције

Како ултразвучна кавитација разара ћелије квасца

Током соникације, фокусирани ултразвук високe снаге ствара наизменичне циклусе компресије и рекомпресије у течном узорку. При довољној интензитету, ове флуктуације притиска стварају акустичку кавитацију. Кавитациони мехурићи се формирају, осцилирају и колабирају, производећи локализоване сечеће силе, микроштитове, турбуленцију и јаке градијенте притиска.
У суспензијама квасца, ови механички ефекти слабље и уништавају ћелијски зид и ћелијску мембрану. Интрацелуларни протеини, ензими, нуклеинске киселине и метаболити се ослобађају у лизис буфер. Пошто је процес механички, може се користити са многим различитим системима буфера и може се комбиновати са инхибиторима протеаза, редукујућим агенсима, детерџентима, солима или благом ензимском претходном обрадом.

Општи протокол: Лизис ћелија квасца у микроплочама

Следећи протокол пружа практичну полазну тачку за лизис квасца коришћењем Hielscher UIP400MTP или UIP550MTP сонатора за микроплоче. Параметри треба да се оптимизују у зависности од рода квасца, густине ћелија, циљне молекуле, композиције буфера, типа плоче и накнадног теста.

1. Берба и прање ћелија квасца

Узгајајте Саццхаромицес, Пицхиа, Хансенула, Дебариомицес или неки други сој квасца под жељеним условима културе. Сакупљајте ћелије центрифугирањем и уклоните медијум културе. Оперите пелет са хладном дестилованом водом, ПБС, или изабрани лиза пуфер за уклањање резидуалних компоненти медија које могу ометати низводно анализе.
За екстракцију протеина, држите узорке хладно и раде брзо. Ако су протеазе забрињавајуће, претходно охладите све пуфере и потрошни материјал.

2. Ресуспенд ћелијске пелете

Ресуспенд квасац пелет у одговарајућем хладном лизи пуфера. За ефикасно ослобађање протеина, висока густина ћелија је често корисна. Као полазну тачку, користите приближно 10–20% в / в влажних ћелија пелета или густу суспензију која одговара ОД₆₀₀ > 10, у зависности од теста.

Tipični pufer za lizis proteina kvasca može sadržati:

• pufer sistem kao što je Tris-HCl, fosfatni pufer, ili HEPES
• so kao što je NaCl ili KCl
• коктел инхибитора протеазе
• opciono redukujuće sredstvo kao što je DTT ili β-merkaptoetanol
• opciono deterdžent kao što je Triton X-100, NP-40, SDS, ili CHAPS, u zavisnosti od kompatibilnosti sa daljim analizama
• opciono inhibitore fosfataza za studije fosforilacije

Za teško lizive sojeve kvasca ili veoma nežno ekstraktovanje proteina, može se koristiti kratka prethodna obrada sa Zimolazom, Litikazom, ili drugim enzimom koji razgrađuje ćelijski zid pre sonikacije. Ova enzimatska prethodna obrada je opcionalna, ali može poboljšati efikasnost lizisa ili smanjiti potrebnu intenzitet ultrazvuka.

3. Prenesite uzorke u odgovarajući mikroplat

Дозирајте суспензију квасца у микроплочу компатибилну са ултразвуком. Плоче са округлим дном су често пожељне јер побољшавају прикупљање узорака и смањују мртве зоне. Користите једнаке количине узорака преко бунара како би се побољшала поновљивост.
Сеал плочу са одговарајућим заптивање простирку или филмом како би се спречило испаравање, формирање аеросола, и унакрсно контаминацију. Уверите се да је печат компатибилан са изабраним условима температуре и ултразвука.
Типичне радне запремине зависе од формата плоче и примене. Уобичајени формати укључују плоче са 96 бунара, плоче са дубоким бунарима, ПЦР плоче или одговарајуће полице за цеви.

4. Подесите хлађење

Лиза квасца захтева висок ултразвучни интензитет, а механички поремећај ствара топлоту. Контрола температуре је стога критична, посебно за анализу протеина, ензима, РНК или фосфорилације.

Користите одговарајућу стратегију хлађења, као што су:

• претходно охлађени пуфер лизе
• претходно охлађене микроплоче
• хлађење паузе између ултразвучних интервала
• спољно хлађење соникације платформе, где је то применљиво

Циљ је да се задржи узорак довољно хладан да спречи денатурацију протеина, инактивација ензима, деградација РНК и варијабилност узорка изазвана топлотом.

5. Соницате квасац суспензија

Поставите запечаћену плочу у Хиелсцхер UIP400MTP или UIP550MTP ултра плочу и изаберите пулсни програм ултразвука. Пулсирање се препоручује јер омогућава механички поремећај током ОН фаза и расипање топлоте током ОФФ фаза.
Као полазна тачка за лизу ћелија квасца:

За високо отпорне суспензије квасца, густа биомаса П. пасторис или тешка рекомбинантна екстракција протеина, повећавају кумулативни ОН-тиме поступно. За протеина осетљивих на топлоту или ензимских тестова, користите краће импулсе, дуже паузе за хлађење и нижу почетну амплитуду.

Високопропусна лиза квасца у мултивелл плочама са UIP400MTP

6. Разјасните лизат

Након ултразвука, центрифугирајте микроплочу или пренесите узорке у епрувете за центрифугирање. Уклоните остатке ћелија центрифугирањем на одговарајућој брзини и температури. Прикупите супернатант за низводну анализу.

У зависности од примене, лизат се може користити за:

• Квантификација протеина
• тестови активности ензима
• СДС-ПАГЕ и Вестерн блоттинг
• ЕЛИСА и имунотестови
• LC-MS/MS протеомика
• анализа метаболита
• пречишћавање ДНК или РНК

7. Оптимизујте и документујте метод

За понављачку лизу квасца, документујте све релевантне параметре, укључујући сој, услове културе, ОД₆₀₀, влажну масу ћелија, састав буфера, тип плоче, запремину узорка, амплитуду, циклус импулса, кумулативно ВК- време, метод хлађења и коначну температуру узорка.
Ако је Хиелшеров сонicator опремљен аутоматским снимањем података, подаци о процесу могу се користити за документацију, развој метода, скалирање и контролу квалитета.

Савети за оптимизацију за лизу квасца

Za maksimalno oslobađanje proteina, koristite guste suspenzije kvasca, visoku ultrazvučnu jačinu i dovoljno kumulativnog vremena uključenosti. Za osetljive proteine, smanjite amplitudu, produžite pauze za hlađenje i držite ploču hladnom tokom čitavog procesa.
Ako liza nije potpuna, postepeno povećavajte vreme sonikacije, testirajte enzimatsku predobradu, smanjite viskoznost uzorka ili optimizujte pufer. Ako proteini degradiraju ili gube aktivnost, poboljšajte hlađenje, skratite intervale uključenosti, dodajte inhibitore i proverite da li je sistem detergenta kompatibilan sa ciljnim proteinom.
Пошто се сојеви квасца значајно разликују у структури ћелијског зида, фази раста, систему експресије и густини биомасе, препоручује се кратка матрица за оптимизацију. На пример, тестирајте три амплитуде, два пулсна циклуса и два укупна ОН-пута, а затим процените ефикасност лизе и интегритет протеина.

Предности Хиелсцхер Мицроплате Соницаторс фор Иеаст Лисис

Hielscher микроплате соникатори су идеални за лабораторије којима је потребно поновљиво лизирање великог броја узорака. Они елиминишу споро руковање једним узорком појединачно приликом сондирања и снижe варијабилност узроковану ручним позиционирањем сонде, дубином уроњености и разликама у руковању узорцима.

Ključne prednosti uključuju:

• Висока пропусна обрада: Соникате велики број узорака квасца паралелно у микроплатама или компатибилним носачима узорака.
• Поновљиви услови: Исти услови соникације у свим бунарима за једнаке, упоредиве резултате лизе.
• Без укрштене контаминације сонде: Узорци остају запечаћени током соникације, смањујући пренос и потребу за чишћењем.
• Погодно за робусне ћелије: Ултразвук високе интензитета подржава разарање ћелијских зидова квасца.
• Ефикасан радни ток: Идеално за скринирање сојева, клонова, услова експресије и лизис буфере.
• Ефикасан радни ток: Програмска подешавања, аутоматско евидентирање података и погодан за лабораторијску аутоматизацију.

Primene u biotehnologiji kvasca i istraživanjima životnih nauka

Ултразвучна лиза квасца у микроплочама подржава многа истраживања и скрининг токова посла. У експресији рекомбинантних протеина, клонови П. пасторис и С. церевисиае могу се паралелно лизирати како би се упоредили нивои експресије или активност ензима. У системској биологији и омици, стандардизована лиза побољшава упоредивост у различитим условима. У микробиологији, ултразвучна обрада подржава брзу припрему лизата из више сојева, медијских услова или стресних третмана.
Типичне области примене укључују:

• квасац протеина екстракција
• рекомбинантни протеин скрининг
• ензим активност скрининг
• клон избор после трансформације
• ферментација оптимизација
• протеомика припрема узорка
• метаболомика припрема узорка
• ћелијски зид поремећај студије
• хигх-тхроугхпут микробиологија тестови

Поуздан квасац Лис почиње са Контролисана соникација

Лиза квасца може бити тешка када број узорака расте, али Hielscher микроталасни сонкатори чине процес бржим, чистијим и поновљивијим. UIP400MTP и UIP550MTP омогућавају истраживачима да обраде целе плоче под дефинисаним ултразвучним условима, побољшавајући проток уз смањење ручног рада.
За микробиологе, молекуларне биологе, научнике за протеине и биотехнолошке лабораторије, микроталасна сонкација је моћан алат за ефикасно и поновљиво ослобађање унутарћелијских компоненти квасца.

Литература / Референце