Протокол за протеомику: бесконтактна соникација побољшава припрему пептидних узорака за MS

Протеомика „одоздо нагоре“ постала је камен темељац савременог откривања биомаркера, структурне биологије и клиничке дијагностике. Разградњом протеина на пептиде пре анализе масеном спектрометријом (MS), истраживачи могу постићи већу покривеност секвенце и поузданију квантификацију. Међутим, припрема биолошких узорака високе сложености за MS и даље је технички захтевна. Недавни методолошки помаци показују како контролисана ултразвучна обрада – посебно помоћу бесконтактног соникатора за више епрувета VialTweeter и соникатора за микроплоче UIP400MTP – може значајно поједноставити овај ток рада, побољшати поновљивост и спречити уобичајена уска грла у раду инструмената.
Погледајте детаљан протокол припреме узорака за добијање пептида одговарајуће величине за анализу помоћу MS.

Ко треба да користи бесконтактну соникацију за припрему пептидних узорака?

• Лабораторије за протеомику „одоздо нагоре“ и откривање: Истраживачи који припремају узорке високе сложености за LC-MS или MALDI поступке и којима је неопходно доследно добијање пептида са високим приносом из различитих биолошких матрица.
• Корисници S-Trap™ технологије и задржавања у суспензији: Тимови који се ослањају на пречишћавање помоћу микроколона и којима је потребно контролисано фрагментисање ДНК смицањем како би спречили зачепљење колона и обезбедили несметано наношење и дигестију узорака.
• Групе за клиничка и транслациона истраживања: Лабораторије које обрађују ткива, ћелије, плазму, серум или цереброспиналну течност и у којима су поновљивост између серија и интегритет узорака од пресудног значаја.
• Тимови за квантитативну и циљану MS: Лабораторије које спроводе строге упоредне студије у којима соникатори са сондом уводе ризике од унакрсне контаминације који би могли угрозити квантификацију пептида присутних у малим количинама.
• Централне лабораторијске јединице и обрада великог броја узорака: Групе које истовремено обрађују више биолошких репликата и којима користи соникација у затвореним епруветама помоћу блока за више епрувета VialTweeter, чиме се елиминише чишћење сонде, смањује време непосредног ангажовања оператера и одржавају асептични услови.
• Истраживачи посттранслационих модификација (PTM) и структуре протеина: Истраживачи којима је потребна блага обрада уз контролу температуре како би очували лабилне модификације и постигли максималну покривеност секвенце током лизе ћелија и хомогенизације.

Преглед протокола: од ткива и ћелија до пептида спремних за MS

Широко прихваћен ток рада у протеомици „одоздо нагоре“, који су описали Wojtkiewicz и сар., пружа робусну, скалабилну методу за припрему пептидних узорака из различитих биолошких матрица. Полазећи од 50–100 mg нагло замрзнутог ткива или 1–20 милиона ћелија, протокол укључује технологију задржавања у суспензији (S-Trap™) ради ефикасног уклањања детерџената, соли и контаминаната пре ензимске дигестије.
Након лизе, квантификације протеина, редукције и алкилације, узорак се закисели и нанесе на S-Trap™ центрифугалну колону, у којој се одвија дигестија трипсином/lysC. Добијени пептиди се елуирају, суше и подвргавају LC-MS анализи. Када се примени на 50 mg ткива људског срца, овај ток рада доследно даје довољно пептида за 30–40 инјектирања, уз идентификацију више од 4.000 јединствених протеина по анализи. Иако су хемијски поступци и пречишћавање помоћу колона добро дефинисани, успех целокупног поступка у великој мери зависи од почетних корака физичког разарања и обраде ДНК.
Протокол препоручује употребу соникатора за више епрувета VialTweeter за ултразвучну лизу ћелија и фрагментисање ДНК смицањем – оба корака су од пресудног значаја за анализу пептида.

Ултразвучна лиза ћелија и ткива за екстракцију протеина

У протеомичком радном току „одоздо нагоре“, соникација је кључни корак у лизи ћелијских узорака ради екстракције протеина за накнадну анализу масеном спектрометријом. Након додавања пуфера са SDS за лизу ћелија у ћелијски талог, узорци се подвргавају ултразвучној обради помоћу соникатора за више епрувета VialTweeter. У протоколу се користе микроцентрифужне епрувете од 1,5 mL и прописује се рад соникатора при 30% снаге, са 10 секунди рада и 10 секунди паузе, током 3 циклуса. Након паузе од 1 минута, циклус се понавља још два пута. Узорци се непрекидно хладе ледом.
Овај поступак не само да помаже разарању ћелија, већ је посебно неопходан за фрагментацију геномске ДНК ослобођене током лизе дејством смицања. Ефикасна фрагментација ДНК смицањем кључна је за смањење вискозности узорка и спречавање зачепљења колона S-Trap™, чиме се обезбеђују оптималан принос издвојених протеина и поуздана накнадна дигестија до пептида.

Кључна улога ултразвучне фрагментације ДНК смицањем

Један од најчешћих проблема у радним токовима заснованим на технологији S-Trap™ јесте зачепљење колоне, које готово искључиво изазива геномска ДНК велике молекулске масе ослобођена током хомогенизације ћелија или ткива. Интактна ДНК драстично повећава вискозност узорка, заробљава пептиде и блокира микропорозни слој сорбента S-Trap™.
Ултразвучна обрада решава овај проблем механичком фрагментацијом ДНК на мале, растворљиве фрагменте. Применом контролисане акустичне енергије, VialTweeter ефикасно фрагментише нуклеинске киселине смицањем, без стварања прекомерне топлоте или уношења страних контаминаната. Ово смањење вискозности обезбеђује несметано наношење узорка, уједначене протоке кроз колону и непрекинуту кинетику дигестије.

Оптимизовани параметри соникације уређајем VialTweeter

Протокол прописује режим соникације високе поновљивости, оптимизован за очување интегритета биолошких узорака и компатибилност са накнадном MS анализом. За узорке у микроцентрифужним епруветама од 1,5mL, уз употребу бесконтактног блок-соникатора Hielscher VialTweeter, следећи параметри обезбеђују лизу и оптималну фрагментацију ДНК смицањем уз очување структуре протеина:

• Амплитуда: 30% снаге
• Образац циклуса: 10 секунди УКЉУЧЕНО / 10 секунди ИСКЉУЧЕНО
• Трајање: 3 циклуса (10 секунди УКЉУЧЕНО/10 секунди ИСКЉУЧЕНО) → пауза од 1 минута на леду → поновити још 2 пута
• Управљање температуром: Узорци се током обраде постављају на лед како би се спречиле термичка денатурација и превремена ензимска активност

Овај приступ пулсној соникацији спречава локално прегревање, своди оксидацију пептида на минимум и обезбеђује уједначено излагање акустичној енергији у свим бочицама. Систем са затвореним епруветама такође елиминише потребу за чишћењем сонде између узорака, драстично смањујући време непосредног рада и варијабилност која потиче од оператера.

Кључне предности за савремене протеомичке радне токове

Укључивање уређаја VialTweeter у ваш протеомички радни ток „одоздо нагоре“ доноси неколико оперативних и научних предности:

1. Уједначена фрагментација ДНК: Уједначено довођење акустичне енергије у све бочице обезбеђује поновљиво смањење вискозности и спречава варијабилност између серија при наношењу узорака на S-Trap™.
2. Очување лабилних модификација: Обрада на ниској температури у леденом купатилу штити посттранслационе модификације (PTM) и спречава агрегацију протеина изазвану топлотом током лизе ћелија.
3. Поједностављена накнадна обрада: Лизати обрађени уређајем VialTweeter могу се директно избистрити центрифугирањем и квантификовати без додатних корака пречишћавања, чиме се убрзава прелазак на дигестију у колонама S-Trap™.
4. Скалабилност и флексибилност: Иста подешавања соникације примењују се и на веома сложене узорке ткива и на ћелијске суспензије, подржавајући радне токове протеомике усмерене на откривање, циљане квантификације и гликопротеомике. Hielscher соникатори за микроплоче омогућавају лако повећање броја узорака који се обрађују у плочама са више бунарчића.

Литература / Референце

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.