Протеомицс Протоцол: Нон-Цонтацт Соницатион побољшава припрему пептидног узорка за МС

Протеомика одоздо према горе је постала камен темељац модерног откривања биомаркера, структурне биологије и клиничке дијагностике. Варењем протеина у пептиде пре анализе масеном спектрометријом (МС), истраживачи могу постићи дубљу покривеност секвенце и поузданију квантификацију. Међутим, припрема биолошких узорака високе сложености за МС остаје технички захтевна. Недавна методолошка достигнућа наглашавају како се контролише ултразвучна обрада – посебно са бесконтактним ВиалТвеетер Мулти-Тубе соникатором и УИП400МТП Мицроплате соникатором – може значајно поједноставити овај ток рада, побољшати поновљивост и спречити уобичајена уска грла на инструментима.
Пронађите детаљан протокол за припрему узорка да бисте добили пептиде одговарајуће величине за анализу помоћу МС.

Ко треба да користи неконтактну соникацију за припрему узорака пептида?

Боттом-уп протеомика & Лабораторије за откривање: Истраживачи који припремају узорке високе комплексности за LC-MS или MALDI протоколе и којима је потребан конзистентан, висок принос пептида у различитим биолошким матрицама.
S-Trap™ & Корисници Суспензионе Трап технологије: Тимови који се ослањају на чишћење микро-колона којима је потребно контролисано цепање ДНК како би се спречило запушавање колоне и обезбедило глатко пуњење и дигестија узорака.
клинички & Групе за транслациона истраживања: Лабораторије које обрађују ткиво, ћелије, плазму, серум или цереброспиналну течност где су конзистентност из серије у серију и интегритет узорка критични.
Квантитативно & Тимови за циљани MS: Лабораторије које спроводе стриктне компаративне студије где поновно употребљиви сонкатори са сондом могу унети ризик од контаминације који би могао компромитовати квантитативно мерење пептида мале концентрације.
Језгрове Лабораторије & Операције Високог Протока: Групе које истовремено обрађују више биолошких репликата и које имају корист од затварања епрувета и више-блок сонета са VialTweeter-ом који елиминише потребу за чишћењем сонде, смањује ручни рад и одржава асептичке услове.
PTM & Истраживачи Структурних Протеина: Истраживачи којима је потребна нежна, температурно контролисана обрада ради очувања лабилних модификација и максималног покривања секвенце током лиже и хомогенизације ћелија.

Овај водич објашњава који тип соникатора је најбољи за ваше задатке припреме узорка као што су лиза, поремећај ћелија, изолација протеина, фрагментација ДНК и РНК у лабораторијама, анализа и истраживања. Одаберите идеалан тип соникатора за вашу апликацију, запремину узорка, број узорка и пропусност. Хиелсцхер Ултрасоницс има идеалан ултразвучни хомогенизатор за вас!

Преглед Протокола: Од Ткива и Ћелија до Пептида Спремних за MS

Широко прихваћени ток рада протеомике одоздо према горе који су описали Војткиевицз ет ал. пружа робустан, скалабилан метод за припрему узорака пептида из различитих биолошких матрица. Почевши од 50–100 мг брзо замрзнутог ткива или 1–20 милиона ћелија, протокол интегрише технологију заробљавања суспензије (С-Трап™) за ефикасно уклањање детерџената, соли и загађивача пре ензимске дигестије.
Након лизе, квантификације протеина, редукције и алкилације, узорак се закисељава и учитава на С-Трап ™ спин колону где долази до пробаве трипсин / лисЦ. Добијени пептиди се елуирају, суше и подвргавају ЛЦ-МС анализи. Када се примени на 50 мг људског срчаног ткива, овај радни ток доследно даје довољно пептида за 30-40 ињекција, идентификујући преко 4.000 јединствених протеина по трчању. Док су хемија и чишћење колоне на бази су добро дефинисани, успех цевовода у великој мери зависи од почетног физичког поремећаја и корака управљања ДНК.
Протокол препоручује употребу ВиалТвеетер Мулти-Тубе Соницатор за соникацију лизу ћелија и смицање ДНК – оба корака су критична за анализу пептида.

Ultrazvučna liza ćelija i tkiva za ekstrakciju proteina

U hedonapronom pristupu proteomike od dna prema vrhu, sonikacija je ključni korak u lizi ćelijskih uzoraka radi ekstrakcije proteina za naknadnu analizom pomoću masene spektrometrije. Nakon dodavanja SDS pufer za lizu ćelija u ćelijski pellet, uzorci se podvrgavaju ultrazvučnoj obradi korišćenjem VialTweeter multi-tube sonikatora. Protokol koristi mikrocentrifuge epruvete od 1,5 mL i predviđa rad sonikatora na 30% snage 10 sekundi uključeno i 10 sekundi isključeno, ponovljeno kroz 3 ciklusa. Nakon čekanja od 1 minut, ciklus se ponavlja još dva puta. Uzorci se neprekidno hlade ledom.
Овај процес не само да помаже у нарушавању ћелија, већ је посебно потребан за цепање геномске ДНК која се ослобађа током лизе. Ефикасно цепање ДНК је кључно за смањење вискозности узорка и спречавање зачепљења S-Trap™ колонa, чиме се обезбеђује оптималан опоравак протеина и поуздана даља дигестија пептида.

Критична улога ултразвучног цепања ДНК

Један од најчешћих неуспеха у радним токовима заснованим на S-Trap™ јесте зачепљење колоне, које готово искључиво узрокује ДНК високог молекулског тежине која се ослобађа током хомогенизације ћелија или ткива. Интактна ДНК драматично повећава вискозност узорка, заробљава пептиде и блокира микропорозну S-Trap™ сорбентну постељу.
Ултразвучна обрада решава овај проблем механичким фрагментирањем ДНК у мале, растворљиве фрагменте. Примјеном контролисане акустичне енергије, ВиалТвеетер ефикасно сече нуклеинске киселине без стварања прекомерне топлоте или увођења страних загађивача. Ово смањење вискозности обезбеђује глатко учитавање узорка, конзистентне брзине протока и непрекидну кинетику варења.

Оптимизед ВиалТвеетер Соницатион Параметерс

Протокол одређује високо поновљив режим ултразвука оптимизован за биолошки интегритет узорка и низводно МС компатибилност. За узорак у 1.5mL мицроцентрифуге епрувете користећи Хиелсцхер ВиалТвеетер бесконтактни блок соницатор, следећи параметри испоручују лизу и оптималну ДНК смицање уз очување протеинске структуре:

Амплитуда: 30% снага
Циклус Образац: 10 секунди ОН / 10 секунди ОФФ
Трајање: 3 циклуса (10sec ОН / 10sec ОФФ) → 1 минут одмора на леду → поновите још 2 пута
Управљање температуром: Узорци се стављају на лед током обраде како би се спречило термичку денатурацију и преурањену ензимску активност

Овај пулсни приступ ултразвучности спречава локализовано прегревање, минимизира оксидацију пептида и обезбеђује равномерну акустичну изложеност у свим бочицама. Подешавање затворене цеви такође елиминише потребу за чишћењем сонде између узорака, драстично смањујући практично време и варијабилност оператера.

Бесконтактни Мулти-Тубе Соницатор ВиалТвеетер је јединствени ултразвучни систем за истовремену соникацију до 10 запечаћених бочица под потпуно истим условима без унакрсне контаминације.

Кључне предности за савремене протеомске радне токове

Интеграција VialTweeter-а у ваш протеомски pipeline доноси неколико оперативних и научних предности:

Конзистентна фрагментација ДНК: Једнолика испорука акустичне енергије у свим бочицама обезбеђује репродуктивно смањење вискозности и спречава варијабилност између серија при пуњењу S-Trap™.
Очување лабилних модификација: Обрада на ниској температури у леденој купки штити пост-транслационе модификације (PTMs) и спречава агрегацију протеина изазвану топлотом током лијеза ћелија.
Поједностављена даља обрада: Лизати обрађени VialTweeter-ом могу се директно пречистити центрифугом и квантитетити без додатних корака пречишћавања, чиме се убрзава пут до S-Trap™ дигестије.
Прилагодљивост & Флексибилност: Ista podešavanja sonikacije važe za uzorke tkiva visoke kompleksnosti i suspenzije ćelija, podržavajući otkrivanje proteomike, ciljno kvantifikovanje i radne tokove glikoproteomike. Hielscher mikroplatični sonikatori omogućavaju jednostavno povećanje obima za veliki broj uzoraka u više bunara.

Sonikatori za pripremu proteomskih uzoraka

Priprema uzoraka peptida viskog kvaliteta za masenu spektrometriju zahteva više od efikasne lize. – захтева прецизну контролу над смицањем ДНК, температуром и превенцијом контаминације. Уграђивањем Хиелсцхер ВиалТвеетер-а у ваш ток рада протеомике одоздо према горе, можете елиминисати зачепљење С-Трап™, обезбедити репродуктиван опоравак протеина и одржавати чистоћу потребну за осетљиве МС анализе. Без обзира да ли обрађујете људско ткиво, култивисане ћелије или сложене лизате, ултразвучна обрада блокова пружа поузданост, скалабилност и контролу процеса коју захтевају модерне лабораторије за протеомику.
Да бисте повећали број узорака, искористите предности Хиелсцхер фокусираних, бесконтактних модела соникатора за микроплоче УИП400МТП и УИП550МТП! Обрадите било коју стандардну плочу са више бунара за протеомику високог протока!

Обрада у затвореној епрувети против традиционалних сонатора са сондовима

Историјски, истраживачи су се ослањали на сонде за директан контакт за цепање ДНК. Иако ефикасни, системи са сондама уносе неколико критичних ограничења у протеомским радним токовима:

Ризик од контаминације: Поновна употреба сонде на више узорака ствара аеросолне преносе и уноси контаминанте који искривљују кванитативне MS резултате.
Губитак узорка: Директно убацивање може довести до прскања, испаравања и прилепљивања драгоцених пептида на површину сонде.
Чишћење: Темељна деконтаминација сонде између циклуса је дуготрајна и често непотпуна, компромитујући студије протеина мале количине.

ВиалТвеетер блок соникатор обрађује узорке у потпуности у затвореним епруветама за микроцентрифугу. Овај дизајн затвореног система елиминише контакт сонде са узорком, спречава стварање аеросола и одржава строге асептичке услове током хомогенизације и лизе. За лабораторије које обрађују лизате ткива високе сложености или више ћелијских линија, ово се преводи у чистије МС податке, већи опоравак пептида и поузданије биолошке реплике.

Повећајте до припреме узорака високог протока у плочама са више јажица

Са моделима Мицроплате Соницатор УИП400МТП и УИП550МТП, обрада епрувете се може лако скалирати до обраде узорака високе пропусности у било којој стандардној плочи са више бунара.

Мицроплате соницатор UIP400MTP омогућава истовремену екстракцију протеина из узорака у мулти-wелл и мултисцреен плочама - олакшавајући припрему узорака високе пропусности у протеомици

Соникатор плоча са више бунара УИП400МТП za ekstrakciju proteina visoke propusnosti iz uzoraka

Повезане теме

Често постављана питања о Соницатион за припрему пептидног узорка

Зашто је потребна соникација пре обраде пептида С-Трап ™? 

Соницатион је неопходно за смицање геномске ДНК високе молекуларне тежине ослобођене током лизе ћелија или ткива. Нетакнута ДНК драстично повећава вискозност узорка, који може зачепити С-Трап ™ микро-колоне и трап пептида, озбиљно смањује опоравак и МС компатибилност.

Како ВиалТвеетер блок Соницатор побољшати припрему узорка у односу на традиционалне сонде соницаторс?

За разлику од сонікатора са директним контактом који захтевају пажљиво чишћење између коришћења и ризик од преноса аеросола, VialTweeter обрађује узорке у потпуности у затвореним флашицама и микроцентрифугалним епруветама. Овај дизајн са затвореним епруветама елиминише унакрсну контаминацију, спречава губитак узорка и одржава строго асептичке услове током хомогенизације и лизе ћелија.

Који су оптимални параметри соникације за припрему узорака за протеомику?

За биолошке узорке као што су ћелије и ткива, препоручени протокол користи VialTweeter сонікатор на 30% снаге са циклусом 10 секунди укључено / 10 секунди искључено, понављано 3 пута. Узорке треба држати на леду током обраде, а циклус поновити још два пута ако се обрађује ≥5 милиона ћелија. (пор. Wojtkiewicz et al., 2021)

Шта да радим ако се моја С-Трап™ колона зачепи током пуњења узорка?

 Зачепљење колоне је обично узроковано високим вискозитетом ДНК или недовољним појашњењем. Да бисте ово решили, темељно центрифугирајте свој лизат пре пипетирања и уверите се да је ДНК адекватно резана ултразвуком.

Како бесконтактна соникација користи квантитативним радним токовима протеомике? 

У квантитативним студијама, чак и трагови унакрсне контаминације између узорака могу искривити мерења пептида мале количине. Затворена епрувета ВиалТвеетер-а обрада са више бочица елиминише уметање сонде, обезбеђује поновљивост од серије до серије и одржава интегритет узорка за прецизне упоредне анализе.

Који принос протеина и дубина МС могу да очекујем од овог протокола?

Počevši sa 50 mg ljudskog srčanog tkiva ili 5 miliona ćelija, S-Trap™ radni tok obično daje dovoljno peptida za 30–50 LC-MS injekcija, dosledno identifikujući preko 4.000 jedinstvenih proteina po eksperimentu. (vidi Wojtkiewicz i saradnici, 2021)

Литература / Референце

FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.