Соникација у микроплочама у Шотган протеомици – Напомена о примени

Shotgun proteomics depends on efficient, reproducible sample preparation to convert complex biological material into LC-MS/MS-ready peptides. The UIP400MTP microplate sonicator supports this process by enabling standardized, parallel sonication of small-volume samples, helping laboratories improve disruption, extraction, and resolubilization in microplate-based workflows. This application note describes how the UIP400MTP can be integrated into proteomic sample preparation, using a published extracellular-vesicle workflow from PLA2G12A/Th17 studies as a lab-tested example.

Microplate Sonication for More Reproducible Shotgun Proteomics

За истраживаче у протеомици, репродуктивна припрема узорака је критична за добијање висококвалитетних LC-MS/MS података. UIP400MTP сонicator за микроплате подржава стандардизовану, паралелну соникацију у радним токовима заснованим на плочама и малим волуменима/високопропусним методама.

Посебно је користан за лабораторије које раде са:

• Великим скупова узорака који захтевају конзистентну обраду у многим бунарима
• Материјалом ограниченог уноса, где је потребно минимизовати губитак и варијабилност узорка
• Узорцима богатим липидима, као што су екстрацелуларни везикули
• Комплексним биолошким припремама које захтевају ефикасну дисрупцију, екстракцију или ресолубилизацију
• Компаративном шотган протеомици, где је репродуктивност преко услова и репликата од суштинског значаја

Интегрисањем соникације микроплате пре дигестије, истраживачи могу побољшати спремност узорка за:

• Екстракцију и ресолубилизацију протеина
• Трипсин/Лиз-C дигестија
• Нано-LC/MS/MS аквизиција
• Квантитативна downstream протеомска анализа

 

Масовно припремајте своје протеомске узорке са поверењем!
Сазнајте како сонкација у микроплати помаже у смањењу ручне варијабилности, побољшању дисрупције узорака и припреми комплексних биолошких узорака за поуздану LC-MS/MS анализу.

Захтев за информацијама


Адреса е-поште (обавезно)


Производ или област интересовања



Слажем се са Политиком приватности









Захтевати информацију

Сонкација у микроплати може бити корисна за:

• Протеомске централне лабораторије
• EV истраживачке лабораторије
• Имунолошке и ћелијске биолошке лабораторије
• Групе за транслациона истраживања
• Тимове из области биолошких наука који повећавају обим од припреме једног узорка до радних токова великог обима

Припрема узорака великог обима за анализу протеома егзоцелуларних везикула

Шта је шотган протеомика?

Shotgun proteomics has become a central analytical strategy for characterizing complex biological samples, from whole-cell lysates and tissue extracts to purified organelles, extracellular vesicles, and low-input clinical specimens. Its core strength lies in the coupling of protein digestion, high-resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and computational peptide-to-protein inference. However, the quality of the final proteome dataset is determined long before the sample reaches the mass spectrometer. Efficient sample disruption, protein solubilization, removal of interfering substances, reproducible enzymatic digestion, and robust peptide recovery are all decisive for depth of coverage and quantitative reliability.
За истраживаче протеомике и лабораторије за науку о животу које раде са ограниченим или драгоценим узорцима, припрема узорака је често уско грло.

Изазов екстрацелуларних везикула у протеомици

Extracellular vesicles (EVs), for example, represent a particularly demanding sample class. They are membrane-bound, lipid-rich, nanoscale particles with relatively low protein yield and a high potential for carry-over of lipids, salts, detergents, serum proteins, and other matrix components. These features can interfere with digestion efficiency, chromatographic performance, electrospray stability, and peptide identification. A preparation workflow for EV proteomics must therefore be strong enough to disrupt vesicle structures and solubilize protein cargo, while remaining compatible with downstream enzymatic digestion and LC-MS/MS analysis.
U ovom kontekstu, ultrazvučna obrada kompatibilna sa mikropločama pruža praktičan pristup za ponovljivu, paralelizovanu obradu uzoraka. Hielscher modeli sonikatora za mikroploče UIP400MTP (400 W) i UIP550MTP (550 W) dizajnirani su za sonikaciju uzoraka u pločama sa više jažica i posudama malog volumena, podržavajući radne tokove većeg protoka od konvencionalnih sonikatora sa jednom sondom. Za laboratorije za proteomiku, ovaj format je privlačan jer može smanjiti varijabilnost pri rukovanju, poboljšati paralelnu obradu više uzoraka i prirodnije se integrisati u pipelajn pripreme uzoraka zasnovan na pločama.

Primer radnog toka

Недавни екстрацелуларни протеомика везикула протеомика ток рада у PLA2G12A-дривен Th17-ћелијске биологије пружа користан, лабораторијски тестиран пример како се ултразвук микроплоча UIP400MTP може уградити у припрему узорка сачмарице протеомике. У тој серији студија, ЕВ узорци су обрађени за анализу протеома коришћењем третмана метанолом, UIP400MTP соникације, центрифугирања, сушења, трипсин / лис-Ц варења, и нано-проток ЛЦ-високе резолуције тандем МС. Исти биолошки рад је први пут пријављен као биоРкив препринт, а затим објављен у Целл Репортс, где је анализа протеомике помогла да се карактерише како PLA2G12A мења ЕВ теретне протеине у контексту патогених одговора Т-ћелија.

Соникатор плоча са више бунара УИП400МТП

Why microplate sonication?
UIP400MTP омогућава стандардизовану, паралелну соникацију узорака малог волумена. Ово је корисно када су важни репродуктивност, мали улаз узорка и обрада више узорака истовремено.

Контролна листа квалитета

• Потврди да ли је у свим узорцима унет еквивалент протеинa EV-а.
• Користи насумичне или уравнотежене распореде обраде узорака.
• Одржавај конзистентним количину метанола, време соникације, време сушења и запремину за варење.
• Праћење приноса пептида и укупно идентификованих протеина.
• Провери стопу пропуштених цепања и дистрибуцију дужине пептида.
• Прегледај облик хроматографских пeкова и репродуктивност времена задржавања.
• Укључи празне узорке ради праћења преноса.
• Користи удружене QC узорке за већа истраживања.
• Процени коефицијент варијације репликата.
• Користи PCA или сродне методе за идентификацију ефеката серије или појединачних отклонских узорака.

Препоруке за протокол

Када објављујете или документујете овај радни ток, пријавите количину EV улаза, формат плоче, запремину метанола, амплитуду и време сондирања UIP400MTP-а, услове центрифугирања, метод сушења, буфер за дигестију, концентрацију ензима, време дигестије, услове закисељавања, LC-MS/MS платформу, режим аквизиције, верзију софтвера, базу података, FDR праг, метод нормализације и статистички радни ток.
Сви Хилсхерови микроплатни сондикатори аутоматски снимају важне параметре процеса као што су амплитуда, трајање сондирања и температура са датумом и временом као CSV датотеку на интегрисану SD-карту. Протоколисање података за репродукцију и контролу квалитета никада није било лакше!

The Study in Detail: EV Shotgun Proteomics in PLA2G12A Study

The PLA2G12A study provides a concrete example of UIP400MTP use in a shotgun proteomics workflow. The biological question was how the secreted phospholipase PLA2G12A modifies Th17-cell-derived extracellular vesicles and thereby influences pathogenic T-cell differentiation. The authors showed that PLA2G12A acts on EV membranes to produce lysophospholipids, including 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, and that downstream lysophosphatidic acid signaling via LPA2 contributes to Th17 differentiation. Beyond lipid signaling, the studies also examined EV cargo, including RNA and protein content, making shotgun proteomics an important component of the characterization strategy.
In the EV preparation workflow, Th17 cells were cultured in medium containing exosome-depleted fetal bovine serum. Culture supernatants were first centrifuged to remove cells, filtered through a 0.22 µm filter, concentrated by ultrafiltration/ultracentrifugation, washed, resuspended in PBS, and quantified by BCA protein assay. This upstream EV preparation ensured that a defined protein-equivalent amount of EV material could be carried into the proteomics workflow.
For shotgun proteomic analysis, the authors used EV samples corresponding to 5 µg protein equivalents. These samples were dried in PCR tubes, and 25 µL methanol was added. The samples were then sonicated for 3 minutes using the UIP400MTP microplate sonicator. Following sonication, the samples were centrifuged at 4°C for 20 minutes at 19,000 × g. After removal of 20 µL supernatant, the samples were centrifuged to dryness. Proteins were then dissolved by sonication in 4 µL trypsin/Lys-C solution at 100 ng/µL in 50 mM ammonium bicarbonate. Digestion was performed for 2 hours at 37°C with shaking at 300 rpm. The digest was acidified with 1 µL of 1.25% trifluoroacetic acid and submitted to nano-flow LC-high-resolution tandem mass spectrometry.
This workflow highlights several useful principles for low-input EV proteomics. First, the input was normalized by protein equivalent, which is important when comparing EVs from different genotypes or treatments. Second, methanol was used before sonication, supporting disruption and extraction while avoiding detergent systems that may complicate LC-MS/MS. Third, the sonication step was short and standardized, which is compatible with parallel sample processing. Fourth, trypsin/Lys-C digestion was performed in a very small volume, reducing dilution and supporting low-input peptide recovery. Finally, direct transition from digestion to acidification and LC-MS/MS minimized unnecessary handling steps.
Низводна ЛЦ-МС / МС метода користи нано-проток обрнутог фазног раздвајања спојеног са К-Екацтиве ХФ Орбитрап масеним спектрометром. Узорци су заробљени на C18 пре-колони, а затим одвојени на 50 μм аналитичке колоне унутрашњег пречника на 200 нЛ / мин и 40 ° Ц. Градијент се кретао од ниског органског растварача до 35% растварача Б током 60 минута, након чега је уследило високо органско прање и ре-равнотежа. МС аквизиција је изведена у позитивно-јонском режиму коришћењем података независне аквизиције са вишим енергетским судара дисоцијације. ДИА сирове датотеке су анализиране коришћењем ДИА-НН 1.8 са ин силицо предвиђеном спектралном библиотеком.