Соникација у микроплочама у шотган протеомици – Напомена о примени

Шотган протеомика зависи од ефикасне, репродуктивне припреме узорака којом се сложени биолошки материјал претвара у пептиде спремне за LC-MS/MS анализу. Соникатор за микроплоче UIP400MTP подржава овај процес омогућавајући стандардизовану, паралелну соникацију узорака мале запремине, чиме помаже лабораторијама да побољшају разарање, екстракцију и поновно растварање у радним поступцима заснованим на микроплочама. Ова напомена о примени описује како се UIP400MTP може интегрисати у припрему узорака за протеомику, користећи објављени радни поступак за екстрацелуларне везикуле из студија PLA2G12A/Th17 као лабораторијски испитан пример.

Соникација у микроплочама за репродуктивнију шотган протеомику

За истраживаче у области протеомике, репродуктивна припрема узорака је пресудна за висококвалитетне LC-MS/MS податке. Соникатор за микроплоче UIP400MTP подржава стандардизовану, паралелну соникацију у радним поступцима заснованим на плочама и поступцима са малим запреминама и великим капацитетом обраде узорака.

Посебно је користан за лабораторије које раде са:

• Великим скуповима узорака који захтевају уједначену обраду у великом броју бунарчића
• Материјалом у ограниченој почетној количини, код којег се губитак узорка и варијабилност морају свести на минимум
• Узорцима богатим липидима, као што су екстрацелуларне везикуле
• Сложеним биолошким препаратима који захтевају ефикасно разарање, екстракцију или поновно растварање
• Упоредном шотган протеомиком, у којој је репродуктивност између различитих услова и репликата од суштинског значаја

Увођењем соникације у микроплочама пре дигестије, истраживачи могу побољшати припремљеност узорака за:

• Екстракцију и поновно растварање протеина
• Дигестију трипсином/Lys-C
• Прикупљање података методом нано-LC/MS/MS
• Накнадну квантитативну протеомску анализу

Соникација у микроплочама може бити корисна за:

• Централне лабораторије за протеомику
• Лабораторије за истраживање екстрацелуларних везикула (EV)
• Лабораторије за имунологију и ћелијску биологију
• Групе за транслациона истраживања
• Тимове у области наука о животу који прелазе са припреме појединачних узорака на радне поступке са већим капацитетом обраде узорака

Припрема узорака са великим капацитетом обраде за анализу протеома екстрацелуларних везикула

Шта је шотган протеомика?

Шотган протеомика постала је централна аналитичка стратегија за карактеризацију сложених биолошких узорака, од лизата целих ћелија и екстраката ткива до пречишћених органела, екстрацелуларних везикула и клиничких узорака са малом почетном количином материјала. Њена основна предност лежи у повезивању дигестије протеина, течне хроматографије спрегнуте са тандемском масеном спектрометријом високе резолуције и рачунарског закључивања о протеинима на основу пептида. Међутим, квалитет коначног скупа података о протеому одређује се много пре него што узорак стигне до масеног спектрометра. Ефикасно разарање узорка, растварање протеина, уклањање ометајућих супстанци, репродуктивна ензимска дигестија и поуздано издвајање пептида пресудни су за дубину покривености протеома и квантитативну поузданост.
За истраживаче у области протеомике и лабораторије у области наука о животу које раде са ограниченим количинама узорака или драгоценим узорцима, припрема узорака често представља уско грло.

Изазов екстрацелуларних везикула у протеомици

Ванћелијске везикуле (EV), на пример, представљају посебно захтевну класу узорака. То су честице нанометарских димензија, окружене мембраном и богате липидима, са релативно ниским приносом протеина и великом могућношћу преношења липида, соли, детерџената, серумских протеина и других компоненти матрикса у наредне кораке обраде. Ове особине могу ометати ефикасност дигестије, хроматографске перформансе, стабилност електроспреја и идентификацију пептида. Зато поступак припреме за протеомику EV мора бити довољно делотворан да разори структуре везикула и раствори протеине које оне носе, а да истовремено остане компатибилан са накнадном ензимском дигестијом и LC-MS/MS анализом.
У овом контексту, ултразвучна обрада компатибилна са микроплочама нуди практичан приступ репродуктивној, паралелној обради узорака. Модели Hielscher соникатора за микроплоче UIP400MTP (400 W) и UIP550MTP (550 W) пројектовани су за соникацију узорака у плочама са више бунарчића и посудама мале запремине, омогућавајући поступке са већим капацитетом обраде узорака него конвенционални соникатори са једном сондом. За протеомске лабораторије овај формат је привлачан јер може смањити варијабилност услед ручног рада, побољшати паралелну обраду више узорака и природније се уклопити у поступке припреме узорака у плочама.

Пример поступка

Недавно објављен поступак протеомске анализе ванћелијских везикула у истраживању биологије Th17 ћелија под утицајем PLA2G12A пружа користан, лабораторијски испитан пример укључивања соникатора за микроплоче UIP400MTP у припрему узорака за шотган протеомику. У тој серији истраживања, узорци EV обрађени су за анализу протеома применом третмана метанолом, соникације уређајем UIP400MTP, центрифугирања, сушења, дигестије трипсином/Lys-C и течне хроматографије са нанопротоком спрегнуте са тандемском масеном спектрометријом високе резолуције. Биолошки део истраживања објавили су Mochizuki-Ono и сарадници 2026. године, а протеомска анализа помогла је да се окарактерише како PLA2G12A мења протеине које носе EV у контексту патогених одговора Т ћелија.

Соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP

Зашто соникација у микроплочама?
UIP400MTP омогућава стандардизовану, паралелну соникацију узорака мале запремине. То је корисно када су важни репродуктивност, мала почетна количина узорка и капацитет обраде више узорака.


Контролна листа за контролу квалитета

• Потврдите да је почетна количина EV, изражена као протеински еквивалент, једнака за све узорке.
• Користите рандомизоване или уравнотежене распореде обраде узорака.
• Одржавајте уједначену запремину метанола, време соникације, време сушења и запремину дигестије.
• Пратите принос пептида и укупан број идентификованих протеина.
• Проверите стопу пропуштених цепања и расподелу дужина пептида.
• Испитајте облик хроматографских пикова и репродуктивност ретенционог времена.
• Укључите слепе пробе ради праћења преноса остатака између узорака.
• Користите збирне узорке за контролу квалитета у већим студијама.
• Процените коефицијент варијације репликата.
• Користите PCA или сродне методе за идентификацију ефеката серије или узорака који одступају.

Препоруке за евидентирање

Приликом објављивања или документовања овог тока рада, наведите почетну количину EV, формат плоче, запремину метанола, амплитуду и време соникације уређајем UIP400MTP, услове центрифугирања, методу сушења, пуфер за дигестију, концентрацију ензима, време дигестије, услове закисељавања, LC-MS/MS платформу, режим аквизиције података, верзију софтвера, базу података, праг FDR, методу нормализације и ток статистичке обраде.
Сви Hielscher соникатори за микроплоче аутоматски бележе важне процесне параметре, као што су амплитуда, трајање соникације и температура, са ознаком датума и времена, у облику CVS датотеке на уграђеној SD картици. Бележење података ради поновљивости и контроле квалитета никада није било лакше!

Детаљан приказ студије: шотган протеомика EV у студији PLA2G12A

Студија PLA2G12A пружа конкретан пример употребе UIP400MTP у поступку шотган протеомике. Биолошко питање било је како секретована фосфолипаза PLA2G12A модификује екстрацелуларне везикуле пореклом из Th17 ћелија и тиме утиче на диференцијацију патогених Т-ћелија. Аутори су показали да PLA2G12A делује на мембране EV и ствара лизофосфолипиде, укључујући 1-олеоил-лизофосфатидилетаноламин, као и да даља сигнализација лизофосфатидне киселине посредством LPA2 доприноси диференцијацији Th17 ћелија. Поред липидне сигнализације, студије су испитивале и садржај EV, укључујући РНК и протеине, чиме је шотган протеомика постала важна компонента стратегије карактеризације.
У поступку припреме EV, Th17 ћелије су култивисане у медијуму који је садржао фетални говеђи серум осиромашен егзозомима. Супернатанти култура су најпре центрифугирани ради уклањања ћелија, филтрирани кроз филтер од 0,22 µm, концентровани ултрафилтрацијом/ултрацентрифугирањем, испрани, ресуспендовани у PBS и квантификовани BCA тестом за одређивање протеина. Ова претходна припрема EV обезбедила је да се у протеомички поступак може увести дефинисана количина материјала EV изражена као протеински еквивалент.
За шотган протеомичку анализу аутори су користили узорке EV који одговарају протеинском еквиваленту од 5 µg. Ови узорци су осушени у PCR епруветама, а затим је додато 25 µL метанола. Узорци су потом соницирани 3 минута помоћу соникатора за микроплоче UIP400MTP. Након соникације, узорци су центрифугирани на 4°C током 20 минута при 19.000 × g. После уклањања 20 µL супернатанта, узорци су центрифугирани до сува. Протеини су затим растворени соникацијом у 4 µL раствора трипсина/Lys-C концентрације 100 ng/µL у 50 mM амонијум-бикарбонату. Дигестија је спроведена током 2 сата на 37°C уз мешање при 300 rpm. Дигест је закисељен додавањем 1 µL 1,25% трифлуоросирћетне киселине и подвргнут течној хроматографији са нанопротоком спрегнутој са тандемском масеном спектрометријом високе резолуције.
Овај поступак истиче неколико корисних принципа за протеомику EV са малом почетном количином узорка. Прво, почетна количина је нормализована према протеинском еквиваленту, што је важно при поређењу EV из различитих генотипова или третмана. Друго, метанол је употребљен пре соникације, чиме су потпомогнути разарање и екстракција, уз избегавање система са детерџентима који могу отежати LC-MS/MS анализу. Треће, корак соникације био је кратак и стандардизован, што је компатибилно са паралелном обрадом узорака. Четврто, дигестија трипсином/Lys-C спроведена је у веома малој запремини, чиме је смањено разблажење и потпомогнуто добијање пептида из мале почетне количине узорка. На крају, директан прелазак са дигестије на закисељавање и LC-MS/MS свео је непотребне кораке руковања на минимум.
Наредна LC-MS/MS метода користила је реверзнофазно раздвајање са нанопротоком спрегнуто са масеним спектрометром Q-Exactive HF Orbitrap. Узорци су задржани на C18 претколони, а затим раздвојени на аналитичкој колони унутрашњег пречника 50 µm при протоку од 200 nL/min и температури од 40°C. Градијент се кретао од ниског удела органског растварача до 35% растварача B током 60 минута, након чега су уследили испирање високим уделом органског растварача и поновно уравнотежавање. Прикупљање MS података спроведено је у режиму позитивних јона, применом аквизиције независне од података са колизионом дисоцијацијом при вишој енергији. Необрађене DIA датотеке анализиране су помоћу DIA-NN 1.8 уз спектралну библиотеку предвиђену in silico.