Ултразвучна припрема узорака уз помоћ филтера (FASP): унапређење протеомских радних токова напредном соникацијом

Ултразвучна припрема узорака уз помоћ филтера (FASP) све више се издваја као високо ефикасна и репродуцибилна метода у савременој протеомици. Интегрисањем контролисане соникације у устаљене FASP радне токове, истраживачи могу значајно побољшати екстракцију протеина, ефикасност дигестије и укупан квалитет података. Са све већом потражњом за припремом узорака која омогућава високу пропусност и репродуцибилност, соникатори са фокусираним ултразвуком, попут соникатора за микроплоче UIP400MTP, добијају на научном и практичном значају.

Научни контекст: зашто је FASP важан у протеомици

Припрема узорака уз помоћ филтера (FASP) постала је златни стандард у протеомици заснованој на приступу „одоздо нагоре“ захваљујући способности да уклони детерџенте, соли и друге контаминанте, истовремено омогућавајући ефикасну ензимску дигестију. Међутим, класични FASP протоколи често се суочавају са ограничењима повезаним са непотпуном лизом, неуједначеном дигестијом и варијабилношћу узорака – нарочито при раду са сложеним или отпорним биолошким ћелијама или ткивима.
Управо ту фокусирана ултразвучна енергија (соникација) пружа одлучујућу предност. Стварањем механичких сила смицања и кавитације, соникација унапређује више кључних корака у FASP радном току без нарушавања интегритета протеина.

Позитивни ефекти соникације у ултразвучном FASP поступку

Соникација изазива контролисану акустичку кавитацију – формирање и колапс микроскопских мехурића – која ствара локализоване силе смицања и микрострујање.
Соникација унапређује и корак алкилације и корак дигестије у ултразвучном FASP поступку побољшавањем преноса масе и убрзавањем кинетике реакција. Примена ултразвучне енергије ствара кавитацију, што доводи до локализованог микрострујања и пролазних сила смицања које подстичу брзо мешање и ефикасно продирање реагенаса у протеински матрикс или средину унутар филтера. Током алкилације то доводи до уједначеније и брже модификације цистеинских остатака јодацетамидом. У кораку дигестије соникација повећава доступност места протеолитичког цепања и побољшава интеракције ензима и супстрата, чиме убрзава деловање трипсина и повећава ефикасност дигестије. У целини, ултразвучни третман скраћује време обраде уз одржавање или побољшање потпуности реакција и репродуцибилности.

У припреми узорака за протеомику, ултразвучни FASP омогућава:

• Ефикасније разарање ћелија и екстракцију протеина, чак и у жилавим ткивима или микробним узорцима
• Побољшану солубилизацију протеина
• Побољшану доступност супстрата ензимима током дигестије
• Краће време обраде и већу репродуцибилност

За разлику од конвенционалних механичких или хемијских метода лизе, ултразвучна обрада омогућава висок степен контроле и скалабилности, што је чини посебно погодном за стандардизоване протеомске радне токове.

Предности ултразвучног FASP поступка у односу на конвенционалне приступе

Интегрисање соникације у FASP протоколе пружа мерљиве предности које директно утичу на резултате накнадне масене спектрометрије.
Ултразвучни FASP омогућава потпуније издвајање протеина, нарочито из захтевних узорака као што су влакнаста ткива или биофилмови. Равномерна расподела енергије обезбеђује уједначен третман свих репликата, смањујући варијабилност – што је кључни захтев за квантитативну протеомику.
Поред тога, соникација убрзава кинетику дигестије побољшавањем интеракције ензима и супстрата. То често доводи до краћег времена дигестије и већег приноса пептида, уз очување покривености секвенце.
Са становишта радног тока, ултразвучни системи смањују потребу за ручним интервенцијама и елиминишу потребу за агресивним хемијским третманима, чувајући интегритет узорка и поједностављујући стандардизацију протокола.

Венов дијаграм који приказује повећан број идентификованих протеина применом ултразвучног FASP поступка у поређењу са FASP поступком који се спроводи преко ноћи
Слика и студија: ©Carvalho et al., 2020

Протокол: ултразвучна FASP припрема великог броја узорака помоћу UIP400MTP

За лабораторије које обрађују велике кохорте узорака, соникатор за микроплоче UIP400MTP омогућава истовремену соникацију стандардних плоча са више бунарчића (нпр. плоча са 96 бунарчића), чиме се значајно повећавају број обрађених узорака и репродуктивност.
У овом формату, узорци (обично 50–200 µL по бунарчићу) припремају се директно у микроплочама компатибилним са ултрафилтрацијом или даљом обрадом. Пуфери за лизу слични су онима који се користе у стандардним FASP протоколима.

UIP400MTP равномерно доводи ултразвучну енергију у све бунарчиће. Соникација се обично спроводи при амплитуди од 60–80% током 2–4 минута, у зависности од врсте узорка. Пратите температуру помоћу прикључивог температурног сензора. Користите пулсну соникацију и, по потреби, лабораторијски расхладни уређај.

Пример протокола:

1. У кораку алкилације, узорци се соницирају помоћу соникатора за микроплоче (UIP400MTP) при амплитуди од 40% током 7 циклуса (30 s укључено, 15 s искључено; укупно време соникације: 5 min 45 s).
2. Након соникације, раствор јодацетамида (IAA) уклања се центрифугирањем. Пре дигестије трипсином, узорци се морају испрати да би се уклонила преостала уреа, снажан хаотропни агенс који инхибира ензимску активност. Зато се узорци испирају два пута са по 200 μL раствора амонијум-бикарбоната (AmBic) концентрације 25 mM.
3. Затим се додаје 100 μL раствора трипсина (однос ензима и протеина 1:30), припремљеног у раствору амонијум-бикарбоната концентрације 12,5 mM. Дигестија протеина се потом спроводи помоћу UIP400MTP под истим условима соникације (амплитуда од 40%, 7 циклуса, 30 s укључено / 15 s искључено; укупно време: 5 min 45 s).
4. Након соникације, узорци се преносе у филтерске плоче или обрађују помоћу FASP система заснованих на плочама. Кораци редукције и алкилације спроводе се у самој плочи, чиме се одржава ефикасан ток рада.
5. Дигестија трипсином спроводи се у контролисаним условима (нпр. 37°C, 4–16 сати), уз могућност краткотрајне ултразвучне стимулације ради убрзавања ензимске активности и повећања приноса пептида.
6. Пептиди се издвајају центрифугирањем и спремни су за LC-MS/MS анализу.

Кључна предност овог система лежи у његовој способности да обезбеди идентичне услове обраде у свим бунарчићима, сводећи ефекте серије на минимум и омогућавајући поуздана квантитативна поређења у протеомским студијама великог обима.

Пројектовање, производња и саветовање – квалитет произведен у Немачкој

Hielscher ултразвучни уређаји су добро познати по највишим стандардима квалитета и дизајна. Робусност и једноставно руковање омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних уређаја у индустријска постројења. Hielscher ултразвучни уређаји лако подносе тешке услове и захтевна окружења.

Hielscher Ultrasonics је компанија са ISO сертификатом и посебну пажњу посвећује ултразвучним уређајима високих перформанси који се одликују најсавременијом технологијом и једноставним коришћењем. Наравно, Hielscher ултразвучни уређаји су усаглашени са CE захтевима и испуњавају захтеве UL, CSA и RoHs.

Литература / референце

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).