Депарафинизација и екстракција протеина из ФФПЕ

Олакшајте екстракцију протеина из секција ткива фиксираних у парафин (ФФПЕ) користећи оптимизовану комбинацију депарафинизације, солубилизације и ултразвука са ВиалТвеетер ултрасоникатором са више епрувета. Овај протокол подржава низводну протеомику засновану на масовној спектрометрији и компатибилан је са СП3 чишћењем и радним токовима ензимске дигестије.

Овај СОП је намењен лабораторијском особљу укљученом у протеомску анализу узорака ФФПЕ ткива коришћењем ултразвучне обраде високих перформанси. Оптимизован је за до десет ФФПЕ узорака који се обрађују паралелно помоћу ВиалТвеетер Мулти-Тубе Соницатор-а.

Протокол: Екстракција протеина из ФФПЕ узорака помоћу ВиалТвеетер-а

Материјали и реагенси

реагенси

• Ксилен (хистолошки степен)
• Etanol (apsolutni 96%)
• пуфер за лизу:

6 М гванидин хидрохлорид
50 мМ Трис-ХЦл, пХ 8,5
10 мМ ТЦЕП (трис(2-карбоксиетил)фосфин)
40 мМ ЦАА (2-хлороацетамид)

• Инхибитор протеазе (опционо; нпр. цОмплете™ мини без ЕДТА)

Опрема

• ВиалТвеетер Мулти-Тубе Ултрасоницатор
• 1,5 мЛ или 2,0 мЛ епрувете за микроцентрифугу са малим везивањем
• Топлотни блок или инкубатор (95°Ц и 80°Ц подешавања)
• Микроцентрифуга
• Термомиксер (опционо, али препоручено)

Сампле Инпут

• 1–2 пресека ФФПЕ ткива дебљине 10 µм по узорку (тј. по бочици)

или

• Укупно ~100 µг ткива по узорку (тј. по бочици)

Напомена: Користите свежа сечива за микротомију да бисте минимизирали контаминацију парафинским остацима.

Процедура

1. депарафинизација
   1. Пребаците ФФПЕ секције у епрувете за микроцентрифугу са малим везивањем.
   2. Додајте 1 мЛ ксилена, кратко промешајте.
   3. Инкубирајте 10 минута на собној температури.
   4. Центрифугирајте на 14.000 × г 2 минута; одбацити супернатант.
   5. Поновите прање ксиленом још једном (кораци 2–4).
   6. Исперите пелет са 1 мЛ 96% етанола, промешајте, затим центрифугирајте на 14.000 × г 2 минута. Одбацити супернатант.
   7. Поновите прање етанолом још једном (укупно 2 прања етанолом).
   8. Пелет се суши на ваздуху 10 минута на собној температури са отвореним поклопцима да би се испарио преостали етанол.
2. Екстракција протеина и соникација
   1. Додајте 200 µЛ пуфера за лизу у сваку суву пелету.
      Напомена: Иако соникатор може да прими до 1 мЛ, 200 µЛ је оптимално за накнадну обраду.

   2. Мешати вортексом или благим пипетирањем.
3. Прва термална инкубација
   1. Инкубирајте епрувете на 95 °Ц током 30 минута, уз мешање на 400 рпм користећи термомиксер или топлотни блок.
   2. Оставите узорке да се охладе на собној температури 5 минута.
4. Прва соникација са ВиалТвеетер-ом
   1. Ставите епрувете у ВиалТвеетер.
   2. Подесите ВиалТвеетер УП200Ст на вредности испод и извршите соникацију.
Соницатор Сеттингс
• Подесите амплитуду (А) на 100%
• Подесите режим пулсирања (Ц) на 100%
• Период: Укључено
• Он Тиме: 60с
• Време искључивања: 30 с
• Гранична вредност: 15 мин (одговара 10 циклуса)
(Напомена за прорачун: (60 с укључено + 30 с искључено) × 10 циклуса = 900 с = 15 мин)
5. Друга термална инкубација
   Уклоните епрувете и поново инкубирајте на 95 °Ц током 15 минута, 400 рпм.
6. Сецонд Соницатион
   Поновите соникацију на ВиалТвеетер-у користећи иста подешавања (као горе) за додатних 10 циклуса (укупно 15 минута).
7. Појашњење лизата
   1. Центрифугирајте узорке на 13.000 × г током 10 минута на 23 ° Ц (собна температура).
   2. Пажљиво сакупите супернатант у нову Еппендорф епрувету од 2,0 мЛ Сафе-лоцк. Избегавајте ометање пелета.
8. Довнстреам Процессинг
   Лизат је сада спреман за СП3 чишћење и ензимску дигестију.

Напомене и најбоље праксе

1. Ризик од прегревања током ултразвука се смањује програмираним циклусом укључивања/искључивања.
2. Избегавајте вортексирање након соникације да бисте спречили агрегацију протеина.

Одлагање отпада и безбедност

Табела у наставку даје вам индикацију приближног капацитета обраде наших ултразвучних апарата величине лабораторије: