Депарафинизација и екстракција протеина из FFPE узорака

Олакшајте екстракцију протеина из пресека ткива фиксираног формалином и уклопљеног у парафин (FFPE) применом оптимизоване комбинације депарафинизације, солубилизације и соникације помоћу ултразвучног уређаја VialTweeter за више епрувета. Овај протокол подржава накнадне протеомске анализе засноване на масеној спектрометрији и компатибилан је са поступцима SP3 пречишћавања и ензимске дигестије.

Ова стандардна оперативна процедура (SOP) намењена је лабораторијском особљу које обавља протеомску анализу FFPE узорака ткива применом соникације високих перформанси. Оптимизована је за паралелну обраду до десет FFPE узорака помоћу соникатора VialTweeter за више епрувета.

VialTweeter на ултразвучном процесору UP200ST

Соникатор VialTweeter за истовремену соникацију 10 узорака, нпр. за лизу и екстракцију протеина из FFPE узорака

Протокол: екстракција протеина из FFPE узорака помоћу уређаја VialTweeter

Материјали и реагенси

Реагенси

Ксилен (квалитета за хистологију)
Етанол (апсолутни 96%)
Пуфер за лизу:

6 M гванидин-хидрохлорид
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (трис(2-карбоксиетил)фосфин)
40 mM CAA (2-хлорацетамид)

Инхибитор протеаза (опционо; нпр. cOmplete™ mini без EDTA)

Опрема

Ултразвучни уређај VialTweeter за више епрувета
Микроцентрифугалне епрувете од 1,5 mL или 2,0 mL са ниским везивањем протеина за површину
Грејни блок или инкубатор (подешавања на 95°C и 80°C)
Микроцентрифуга
Термомиксер (опционо, али препоручено)

Почетна количина узорка

1–2 пресека FFPE ткива дебљине 10 µm по узорку (тј. по бочици)

ИЛИ

Укупно ~100 µg ткива по узорку (тј. по бочици)

Напомена: Користите нова сечива за микротомију да бисте свели контаминацију остацима парафина на најмању могућу меру.

Поступак

Депарафинизација
1. Пренесите FFPE пресеке у микроцентрифугалне епрувете са ниским везивањем протеина за површину.
2. Додајте 1 mL ксилена и кратко промешајте на вортекс мешалици.
3. Инкубирајте 10 минута на собној температури.
4. Центрифугирајте при 14.000 × g током 2 минута; одбаците супернатант.
5. Поновите испирање ксиленом још једном (кораци 2–4).
6. Исперите талог са 1 mL 96% етанола, промешајте на вортекс мешалици, а затим центрифугирајте при 14.000 × g током 2 минута. Одбаците супернатант.
7. Поновите испирање етанолом још једном (укупно 2 испирања етанолом).
8. Сушите талог на ваздуху 10 минута на собној температури, са отвореним поклопцима, да би преостали етанол испарио.
Екстракција протеина и соникација
1. Додајте 200 µL пуфера за лизу сваком сувом талогу. 
  Напомена: Иако соникатор прихвата до 1 mL, 200 µL је оптимално за накнадну обраду.
2. Промешајте на вортекс мешалици или благим пипетирањем.
Прва термичка инкубација
1. Инкубирајте епрувете на 95 °C током 30 min, уз мешање при 400 rpm, користећи термомиксер или грејни блок.
2. Оставите узорке да се хладе на собној температури 5 min.
Прва соникација помоћу уређаја VialTweeter
1. Поставите епрувете у VialTweeter.
2. Подесите VialTweeter UP200St на вредности наведене у наставку и спроведите соникацију.

Подешавања соникатора
• Подесите амплитуду (A) на 100%
• Подесите пулсни режим (C) на 100%
• Тајмер периода: укључен
• Време рада: 60s
• Време паузе: 30s
• Гранична вредност: 15 min (одговара 10 циклуса)
(Напомена о прорачуну: (60 s рада + 30 s паузе) × 10 циклуса = 900 s = 15 min)

Друга термичка инкубација
Извадите епрувете и поново инкубирајте на 95 °C током 15 min, при 400 rpm.
Друга соникација
Поновите соникацију на уређају VialTweeter са истим подешавањима (као горе) током додатних 10 циклуса (укупно 15 min).
Бистрење лизата
1. Центрифугирајте узорке при 13.000 × g током 10 min на 23°C (собна температура).
2. Пажљиво пренесите супернатант у нову епрувету Safe-lock Eppendorf од 2,0 mL. Пазите да не пореметите талог.
Накнадна обрада
Лизат је сада спреман за SP3 пречишћавање и ензимску дигестију.

VialTweeter је јединствен ултразвучни систем за истовремену соникацију до 10 бочица под потпуно истим условима, без унакрсне контаминације.

VialTweeter са Eppendorf епруветама од 2,0mL за поуздану припрему узорака у стерилним условима

Hielscher VialTweeter са 10 Eppendorf епрувета

Напомене и препоручене праксе

Ризик од прегревања током соникације смањује се програмираним циклусима укључивања/искључивања.
Избегавајте мешање на вортекс мешалици након соникације да бисте спречили агрегацију протеина.

Одлагање отпада и безбедност

Ксилен и гванидин-хидрохлорид су опасне хемикалије; рукујте њима у дигестору.

Сав отпад од растварача и биолошки отпад одложите у складу са институционалним протоколима за биолошку безбедност и хемијску хигијену.

Табела у наставку даје преглед приближног капацитета обраде наших лабораторијских ултразвучних уређаја:

Препоручени уређаји	Запремина шарже	Проток
Соникатор UIP400MTP за плоче са 96 бунарчића	плоче са више бунарчића / микротитарске плоче	n.a.
Ултразвучни CupHorn	CupHorn за бочице или лабораторијску чашу	n.a.
GDmini2	ултразвучни микропроточни реактор	n.a.
VialTweeter	0,5 до 1,5mL	n.a.
UP100H	1 до 500mL	10 до 200mL/min
UP200Ht, UP200St	10 до 1000mL	20 до 200mL/min
UP400St	10 до 2000mL	20 до 400mL/min
Ултразвучни тресач сита	n.a.	n.a.

Ултразвучни хомогенизатори са високим смицањем користе се у лабораторијској, стоној, пилотској и индустријској обради.

Hielscher Ultrasonics производи ултразвучне хомогенизаторе високих перформанси за мешање, дисперговање, емулговање и екстракцију у лабораторијским, пилотским и индустријским размерама.

Повезане теме

Литература / Референце

Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.

Често постављана питања

Зашто се узорци ткива фиксирају као FFPE?

Конзервирање фиксацијом у формалину и уклапањем у парафин (FFPE) стабилизује морфологију ткива и структуре протеина стварањем ковалентних попречних веза посредством формалдехида. Уклапање у парафин омогућава дуготрајно чување на собној температури уз очување хистолошког и молекуларног интегритета за ретроспективне анализе.

Како да депарафинизујем FFPE узорке?

Депарафинизација обухвата узастопна испирања растварачима ради уклањања парафина: обично две инкубације са ксиленом, након којих следе два испирања етанолом (96%). Након центрифугирања и сушења, ткиво је спремно за накнадну екстракцију. Овај поступак поново чини узорак доступним за лизу и ензимску дигестију.

Која је сврха термичке инкубације?

Термичка инкубација подразумева контролисано излагање узорка одређеној температури током одређеног временског периода ради изазивања биохемијских или физичких промена. У протеомици се обично користи за денатурацију протеина, раскидање попречних веза насталих дејством формалдехида у FFPE ткивима или повећање ефикасности пуфера за лизу. Температура и трајање су кључни параметри, прилагођени циљној реакцији или типу узорка.

Шта је SP3 дигестија?

Припрема узорака у једној посуди, потпомогнута чврстом фазом (SP3), представља протеомски поступак заснован на куглицама. Користи парамагнетне куглице за везивање протеина, што омогућава ефикасно пречишћавање, концентровање и ензимску дигестију на куглицама у денатуришућим условима. SP3 своди губитак узорка на најмању могућу меру и веома је компатибилан са узорцима мале почетне количине и FFPE узорцима.

Ултразвук високих перформанси! Асортиман производа Hielscher обухвата цео спектар од компактног лабораторијског ултразвучног уређаја, преко стоних јединица, до потпуно индустријских ултразвучних система.

Hielscher Ultrasonics производи ултразвучне хомогенизаторе високих перформанси од лабораторијских до индустријских размера.