Високопропусна припрема FFPE узорака: екстракција протеина и смицање нуклеинских киселина

Често постављана питања
У наставку одговарамо на често постављана питања која се односе на припрему FFPE ткива и ултразвучну обраду FFPE узорака.

Како се припрема FFPE ткиво?

Кораци припреме FFPE ткива: Пажљиво руковање свежим ткивом и његова обрада од пресудног су значаја за добијање висококвалитетних FFPE узорака. Очување ћелијске архитектуре, нуклеинских киселина и протеина неопходно је за тачну анализу у наредним фазама. Сваки корак – од прикупљања до укалупљивања – захтева прецизност како би се очувао интегритет узорка за различите анализе, укључујући хистолошки преглед, имунохистохемију и молекуларна испитивања. Правилно спроведен поступак фиксације и укалупљивања осигурава да очувано ткиво верно одражава стање in vivo, омогућавајући поуздане дијагностичке и истраживачке резултате.
Водимо вас кроз 6 главних корака поступка укалупљивања FFPE узорака ткива.

• Прикупљање ткива
  Биопсије живих сисара и културе ткива представљају погодне изворе свежег ткива за припрему FFPE узорака.
  Важно је применити асептичну технику: Користите стерилне инструменте и рукавице како бисте избегли контаминацију. Идеално је да ткива прикупљате у стерилном окружењу, као што је операциона сала или комора са ламинарним струјањем ваздуха.
  Пошто је узорак веома осетљив, неопходно је пажљиво руковање: Сведите одлагања обраде на минимум и започните даљу обраду ткива одмах након ексцизије. То је од пресудног значаја за спречавање аутолизе и разградње. Држите ткиво на собној температури; избегавајте замрзавање јер оно може изазвати стварање кристала леда и оштећење ткива.
• Фиксација ткива
  Прво се ткиво третира раствором фиксатива: Користите 10% неутрално пуферисани формалин (NBF), што одговара 4% формалдехиду у води, пуферисаном до неутралне pH вредности.
  Потпуно потопите ткиво у формалин. Обезбедите запремински однос фиксатива према ткиву од најмање 10:1. Време фиксације обично износи од 6 до 24 сата, у зависности од врсте и величине ткива. Важно је да фиксатив може потпуно да продре у ткиво. Међутим, прекомерна фиксација може довести до унакрсног повезивања које отежава демаскирање антигена, док недовољна фиксација може довести до лошег очувања ткива.
• Обрезивање ткива
  Затим обрежите ткиво на дебљину од око 3–5 mm како бисте омогућили одговарајуће продирање фиксатива. Обезбедите правилну оријентацију ткива како би релевантне хистолошке структуре биле обухваћене. То олакшава поступак екстракције када се ткиво касније користи за анализу.
• Обрада фиксираног узорка
  Сада се фиксирано ткиво мора дехидрирати: Након фиксације, ткиво треба дехидрирати како би се обезбедило потпуно продирање парафинског воска. Проведите ткиво кроз низ раствора етанола растућих концентрација (70%, 80%, 90% и 100%) да бисте уклонили воду.
  Просветљавање ксиленом: Парафински восак је нерастворљив у води, али је растворљив у ксилену. Зато се вода у ткиву мора заменити ксиленом. Међутим, сам ксилен је нерастворљив у води, али је растворљив у алкохолу, па је неопходан међукорак у којем се вода најпре замењује алкохолом. Потопите ткиво у ксилен или замену за ксилен како бисте уклонили етанол и припремили ткиво за инфилтрацију парафином.
  Инфилтрација парафином: Уклопите ткиво у растопљени парафински восак, обезбеђујући потпуну инфилтрацију. Овај корак обично подразумева неколико замена парафина како би се обезбедила потпуна импрегнација.
• Укалупљивање ткива
  У овом кораку ткиво се укалупљује у ткивни блок: Поставите ткиво у калуп у жељеној оријентацији и прелијте га растопљеним парафином. Оставите парафин да очврсне хлађењем на собној температури или на хладној плочи.
• Израда пресека и постављање на предметна стакла
  Микротомија: Да бисте исекли укалупљено ткиво, користите микротом за сечење танких пресека (обично 4–5 микрометара) из парафинског блока. Затим поставите пресеке узорка на предметна стакла за накнадно бојење и микроскопску анализу.
  На крају проверите квалитет хистолошког препарата: Прегледајте прве пресеке под микроскопом како бисте се уверили да су фиксација и обрада правилно спроведене. По потреби прилагодите протоколе на основу врсте ткива и уоченог квалитета.

 
FFPE ткива могу се користити за издвајање РНК, ДНК и протеина, као и за откривање знакова рака или других болести. Могу се чувати годинама и представљају суштински део начина на који истраживачи и лекари користе узорке ткива за дијагностику и истраживање.

Који су уобичајени проблеми и изазови при раду са FFPE ткивом?

Узорци ткива фиксираног формалином и уклопљеног у парафин (FFPE) широко се користе у истраживању и дијагностици, али су повезани са неколико изазова и уобичајених проблема:

• Разградња биомолекула: Продужена фиксација може довести до разградње ДНК, РНК и протеина, што отежава екстракцију висококвалитетних нуклеинских киселина или протеина за даље примене. Правилна фиксација (уз избегавање недовољне и прекомерне фиксације) неопходна је за очување ткива.

Умрежавање: Фиксација формалином изазива умрежавање протеина и нуклеинских киселина, што може отежати молекуларну анализу и утицати на тачност имунохистохемијских и других испитивања.

• Маскирање антигена: Процес фиксације може маскирати антигенска места, смањујући ефикасност везивања антитела у имунохистохемији и другим имунолошким испитивањима. То често захтева демаскирање антигена, поступак којим се уклања маскирање епитопа и обнавља везивање између епитопа и антитела. Међутим, потпуна антигеност се можда неће увек обновити.
• Променљив квалитет фиксације: Разлике у трајању и условима фиксације могу довести до неуједначеног квалитета узорака, што утиче на поновљивост и упоредивост резултата. Користите поуздане протоколе фиксације и избегавајте недовољну и прекомерну фиксацију.
• Оштећење и фрагментација ДНК: Фиксација FFPE узорака формалином може изазвати различите врсте оштећења ДНК, укључујући деаминацију цитозина (мутације C у T), оксидативна оштећења (нпр. 8-оксогуанин који доводи до мутација G у T), као и физичка оштећења попут једноланчаних прекида, празнина и абазних места која ометају активност ДНК полимеразе. Процес фиксације формалином може изазвати фрагментацију ДНК, што отежава генетичке и геномске анализе као што су PCR и секвенцирање.
• Квалитет РНК: РНК екстрахована из FFPE ткива често је фрагментисана и хемијски модификована, што отежава спровођење висококвалитетних транскриптомских анализа.
• Модификације протеина: Формалин може изазвати хемијске модификације протеина које утичу на њихову структуру и функцију, што може ометати протеомске анализе.
• Артефакти настали током обраде узорака: Током уклапања и сечења, механичко напрезање и топлота могу довести до појаве артефаката и изазвати додатно оштећење ткива.
• Варијабилност између серија: Разлике у протоколима фиксације и уклапања између различитих серија могу довести до значајне варијабилности резултата, што отежава поређења између студија.
• Проблеми са чувањем: Дуготрајно чување FFPE блокова може временом довести до додатне разградње и губитка интегритета нуклеинских киселина, што утиче на употребљивост архивских узорака за ретроспективне студије.

Коришћење оптимизованих протокола, пажљиво руковање узорцима и примена напредних техника помажу у побољшању квалитета и поузданости података добијених из FFPE ткива.

Која је разлика између FFPE и замрзнутог ткива?

FFPE ткиво (фиксирано формалином и уклопљено у парафин) чува се тако што се фиксира формалином, а затим уклапа у парафински восак, што омогућава дуготрајно чување на собној температури уз очување морфологије ткива. Насупрот томе, замрзнуто ткиво брзо се конзервира замрзавањем, чиме се боље очувава интегритет нуклеинских киселина и протеина, али је потребно чување на веома ниским температурама.

Које хемикалије се користе за FFPE уклапање?

Хемикалије које се користе за уклапање у парафин у поступку FFPE обично обухватају формалин за фиксацију и парафински восак за уклапање. За уклапање у поступку FFPE, ткива се обично фиксирају или 10% (v/v) неутрално пуферованим формалином (FA) или свеже припремљеним 4% (w/v) раствором формалдехида (PFA) направљеним од праха параформалдехида. Формалин, који је раствор формалдехида у води, пуферује се до неутралне pH вредности како би се очувала морфологија ткива и спречило прекомерно унакрсно повезивање. Раствор на бази параформалдехида такође обезбеђује ефикасну фиксацију унакрсним повезивањем протеина, чиме стабилизује структуру ткива за накнадно уклапање у парафински восак. Ове хемикалије су неопходне за очување интегритета и морфологије ткива током поступка фиксације и уклапања.

Како се парафин уклања из FFPE узорака?

За уклањање парафина из FFPE узорака, пресеци ткива се обично подвргавају низу испирања ксиленом, након чега следи рехидратација кроз низ раствора алкохола постепено опадајуће концентрације и, на крају, водом. Пошто је ксилен веома токсичан и представља ризик по здравље, укључујући респираторне проблеме, иритацију коже и могуће дугорочне последице при поновљеном излагању, ултразвучно уклањање парафина постаје обећавајућа алтернатива у многим лабораторијама. Ова метода користи интензивне ултразвучне таласе за ефикасно и безбедно уклањање парафина без потребе за токсичним растварачима попут ксилена, чиме се смањује ризик за лабораторијско особље и ствара безбедније радно окружење.

Колико дуго треба да фиксирам ткива да бих добио FFPE узорке доброг квалитета?

Опште препоруке за трајање фиксације обично предлажу фиксирање узорака ткива у формалину током 24 до 48 сати. Ово трајање је углавном довољно за очување морфологије ткива и ћелијских структура, уз свођење прекомерне фиксације на најмању могућу меру, јер она може довести до прекомерног унакрсног повезивања и разградње нуклеинских киселина и протеина. Међутим, оптимално време фиксације може да варира у зависности од величине и врсте ткива, при чему мањи или осетљивији узорци захтевају краће време фиксације. Од пресудне је важности обезбедити одговарајућу фиксацију ради спречавања аутолизе и разградње ткива, а истовремено избегавати продужену фиксацију која би могла да отежа накнадне молекуларне анализе.