ФФПЕ припрема узорака високе пропусности: екстракција протеина и сечење нуклеинске киселине
Са ултрасоникатором високе пропусности УИП400МТП, Хиелсцхер Ултрасоницс решава изазове фиксације формалина и припреме ткива уметнутом у парафин (ФФПЕ). Научите како ултразвук обрађује ФФПЕ узорак у великом броју за ФФПЕ депарафинизацију, лизу ткива, хомогенизацију, екстракцију протеина и сечење ДНК/РНА! Искористите ултразвучну припрему ткива ФФПЕ – обрада великог броја узорака у плочама са више јажица! Набавите висококвалитетне узорке и добијте велики број узорака на за поуздане резултате истраживања! И на крају, али не и најмање важно, уштедите време и новац!
ФФПЕ припрема узорака олакшана ултразвучном обрадом високог протока
Фиксација формалином и уградња парафина (ФФПЕ) је најчешћи метод за очување и архивирање чврстих ткива. Екстракција биомолекула из ФФПЕ узорака ткива често представља значајне изазове због квалитета ускладиштених узорака. Ови узорци, који су непроцењиво богатство у молекуларној биологији и клиничким истраживањима, пружају богат извор биолошких информација за ретроспективне студије и валидацију дијагностичких биомаркера. Међутим, процес фиксације формалина и уградње парафина, уз очување архитектуре и морфологије ткива, компликује екстракцију висококвалитетних нуклеинских киселина и протеина. Формалин индукује унакрсно повезивање нуклеинских киселина и протеина, што доводи до молекуларне фрагментације и хемијских модификација. Научите како ултразвучни апарат високе пропусности УИП400МТП превазилази изазове припреме узорака ФФПЕ!
Ултрасоникатор за ефикасну припрему узорака ФФПЕ
- Ток посла који се лако користи: Поједностављени процеси који су лаки за корисника.
- Депарафинизација, екстракција протеина, смицање ДНК / РНК
- Брза обрада високог протока: Ефикасно руковање плочама са више јажица.
- Ефикасна депарафинизација: Побољшана солубилизација протеина.
- Нетоксични растварачи: Избегава употребу штетних органских растварача као што је ксилен.
УИП400МТП соникатор високог протока за обраду узорака ФФПЕ високе пропусности у плочама са више јажица
Напредак у техникама екстракције протеина из ФФПЕ ткива
Хиелсцхер Ултрасоницс решава изазове у припреми узорака ФФПЕ високе пропусности. Соникација користи ултразвучне таласе за генерисање механичких вибрација и фокусиране кавитације, ефикасно нарушавајући ћелијске структуре и побољшавајући солубилизацију биомолекула. Ова техника је стекла популарност због своје способности да повећа ефикасност и принос екстракције нуклеинске киселине и протеина из ФФПЕ ткива, као и ДНК и РНК смицања за припрему библиотеке. Веома је важно нагласити да ултразвучна обрада помоћу УИП400МТП соникатора плоча са више бунара одржава интегритет ових биомолекула за низводне апликације.
Скидање нуклеинске киселине коришћењем ултразвука високог протока
Ултрасоникатор са више бунара УИП400МТП за употребу у поставкама високе пропусности доводи припрему ФФПЕ узорака на нови ниво. Ова метода ултразвучне обраде са више јажица пружа ефикасно и поуздано решење за истовремену обраду више узорака. Омогућава брзу и поновљиву екстракцију ДНК, РНК и протеина, који су критични за различите аналитичке технике, укључујући секвенционирање следеће генерације (НГС), квантитативни ПЦР и протеомске анализе. Оптимизација параметара соникације, као што су амплитуда, трајање и температура, додатно побољшава квалитет и квантитет екстрахованих биомолекула.
УИП400МТП соникатор за плоче са више јажица нуди значајне предности за фрагментацију и смицање ДНК и РНК из ФФПЕ ткива. Једна од истакнутих карактеристика овог система је његова способност да постигне уске величине фрагмената ДНК и РНК, пружајући прецизну могућност подешавања интензитета соникације за добијање кратких фрагмената од 150-200 парова база (бп) или дужих фрагмената од 15-20 парова килобаза ( кбп). Ова свестраност чини УИП400МТП незаменљивим и за апликације секвенцирања кратког и дугог читања, обезбеђујући висококвалитетне резултате за секвенцирање следеће генерације (НГС) и секвенцирање целог генома (ВГС). Његова прецизна контрола величине фрагмената је кључна за истраживаче у свим областима геномике, јер омогућава припрему узорака према спецификацијама.
Контактирајте нас за напредна решења у ФФПЕ ткиву
Откријте УИП400МТП соникатор плоча са више јажица за ефикасан опоравак биомолекула из ФФПЕ узорака, одржавајући интегритет екстрахованих нуклеинских киселина и протеина и обезбеђујући поновљивост резултата. Ова технологија се неприметно интегрише са другим припремним и аналитичким радним токовима, поједностављујући и побољшавајући молекуларна истраживања користећи ФФПЕ архиве ткива.
Фиксативи и њихови ефекти
Фиксација је кључни корак у припреми узорка који чува ћелијске структуре, зауставља биохемијске реакције и спречава деградацију. Користе се различити фиксативи у зависности од специфичних експерименталних захтева. Два најчешћа фиксатора су формалдехид и параформалдехид, који укрштају протеине и нуклеинске киселине, чувајући морфологију и антигеност ћелија и ткива. Други фиксативи, као што су етанол, метанол и глутаралдехид, користе се за специфичне примене.
Фиксативи формалдехида и параформалдехида формирају метиленске мостове између амино група, што доводи до умрежавања протеина. Овај процес ефикасно имобилише ћелијске компоненте, чувајући њихов интегритет током наредних корака анализе. На ефекте ових фиксатива могу утицати фактори као што су концентрација, пХ и температура, а оптимизација ових параметара је кључна да би се обезбедило оптимално очување ћелијских структура.
Предности ултразвучне ФФПЕ припреме
Ултразвук је моћна техника за ометање фиксираних ћелија и ткива која надмашује конвенционалне технике. Нуди неколико значајних предности у односу на традиционалне методе лизе:
- Брзина и ефикасност: Ултразвучна лиза обезбеђује брзо ометање ћелија и ткива, значајно скраћујући време обраде у поређењу са механичким или хемијским методама лизе. Звучни таласи високе фреквенције које генерише ултразвучна сонда стварају механичке силе смицања, узрокујући поремећај фиксираних ћелијских структура. Овај брз и ефикасан прекид омогућава истраживачима да обраде велике количине узорака у кратком временском року.
- Нежно и подесиво: Ултразвучна лиза нуди нежан механизам ометања који минимизира оштећење осетљивих биомолекула као што су протеини, нуклеинске киселине и ензими. За разлику од механичких метода које стварају прекомерну топлоту или силе смицања, ултразвучна лиза користи контролисану кавитацију да поремети ћелије уз очување интегритета и функционалности интрацелуларних компоненти.
- Свестраност: Ултразвучна лиза се може применити на различите фиксаторе, омогућавајући истраживачима да раде са широким спектром фиксираних узорака. Без обзира да ли се користи формалдехид, параформалдехид или алтернативна средства за фиксирање, ултразвучна лиза доследно доноси ефикасно ометање, обезбеђујући оптималан опоравак ћелијских компоненти.
- Висок принос и квалитет: Ултразвучна лиза омогућава високе приносе нетакнутих ћелијских компоненти због своје способности да равномерно поремети фиксиране ћелије и ткива. Ово омогућава низводне апликације као што су анализа протеина, екстракција нуклеинске киселине и ензимски тестови да дају поуздане и поновљиве резултате.
- Компатибилност аутоматизације: Ултразвучна лиза се може лако интегрисати у аутоматизоване системе, омогућавајући обраду узорака високог протока. Ова компатибилност омогућава истраживачима да поједноставе свој радни ток и повећају продуктивност, посебно у студијама великих размера.
Соникатор плоча са 96 јажица УИП400МТП за соникацију микротитарских и плоча са више јажица
Ултразвучна лиза је револуционирала разбијање фиксираних ћелија и ткива, нудећи бројне предности у односу на традиционалне методе лизе. Његова брзина, ефикасност, селективност, свестраност, висок принос и компатибилност аутоматизације чине га незаменљивим алатом у молекуларној биологији и истраживању биотехнологије. Нудећи соникаторе без контакта, као и соникаторе типа сонде, Хиелсцхер Ултрасоницс нуди најприкладнији ултразвучни хомогенизатор за вашу науку о животу. Без обзира да ли желите да истовремено обрађујете појединачне узорке, више узорака или веома велики број узорака, ми ћемо вам понудити најбољи соникатор који одговара вашим захтевима истраживања и дијагностике.
Прочитајте више о Хиелсцхер бесконтактним соникаторима за припрему узорака са више узорака и високу пропусност!
- једнократна инвестиција
- користите сопствени потрошни материјал
- нема сталних трошкова за власнички прибор и потрошни материјал
- високе пропусности
- прецизна контрола
- најсавременија технологија
- поузданост & робусност
- подесива, прецизна контрола процеса
- индустријска класа: може континуирано радити 24/7
- једноставан и сигуран за рад
- минимално одржавање
Соникатор плоча УИП400МТП за све плоче са 96 јажица, микротитарске плоче и плоче са више јажица.
Дизајн, производња и консалтинг – Квалитет Маде ин Германи
Хиелсцхер ултрасоникатори су познати по свом највишем квалитету и стандардима дизајна. Робусност и једноставан рад омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних апарата у индустријске објекте. Хиелсцхер ултрасоникатори се лако носе са тешким условима и захтевним окружењима.
Хиелсцхер Ултрасоницс је ИСО сертификована компанија и ставља посебан нагласак на ултрасоникаторе високих перформанси са најсавременијом технологијом и једноставношћу за коришћење. Наравно, Хиелсцхер ултрасоникатори су усаглашени са ЦЕ и испуњавају захтеве УЛ, ЦСА и РоХ.
Контактирајте нас! / Питајте нас!
УИП400МТП ултрасоникатор: Припрема узорка ФФПЕ високе пропусности у плочи са више бунара
ФАК
У наставку одговарамо на често постављана питања, која су релевантна за припрему ФФПЕ ткива и ултразвучну обраду ФФПЕ узорака.
Како се припрема ФФПЕ ткиво?
Кораци за припрему ФФПЕ ткива: Педантно руковање и обрада свежег ткива су критични за добијање висококвалитетних ФФПЕ узорака. Обезбеђивање очувања ћелијске архитектуре, нуклеинских киселина и протеина је од суштинског значаја за тачну анализу низводно. Сваки корак — од сакупљања до уграђивања — захтева прецизност да би се одржао интегритет узорка за различите анализе, укључујући хистолошки преглед, имунохистохемију и молекуларне студије. Правилно изведен, овај процес фиксације и уградње осигурава да очувано ткиво тачно одражава стање ин виво, омогућавајући поуздане дијагностичке и истраживачке резултате.
Водимо вас кроз 6 главних корака процеса уградње узорака ФФПЕ ткива.
- Збирка ткива
Биопсије живих сисара и културе ткива су одрживи извори за добијање свежег ткива за припрему узорака ФФПЕ.
Важно је користити асептичну технику: Користите стерилне инструменте и рукавице да бисте избегли контаминацију. У идеалном случају, сакупљајте ткива у стерилном окружењу, као што је хируршки апартман или капуља за ламинарни проток.
Пошто је узорак веома крхак, његово осетљиво руковање је од суштинског значаја: Смањите кашњења у обради и одмах започните обраду ткива након ексцизије. Ово је кључно за спречавање аутолизе и деградације. Држите ткиво на собној температури; избегавајте смрзавање јер може изазвати стварање кристала леда и оштећење ткива. - Фиксација ткива
Прво, ткиво се третира раствором за фиксирање: Користите 10% неутрално пуферованог формалина (НБФ), што је еквивалентно 4% формалдехида у води, пуферовано до неутралног пХ.
Потпуно потопите ткиво у формалин. Обезбедите однос запремине фиксатора и ткива од најмање 10:1. Време фиксације се обично креће од 6 до 24 сата, у зависности од врсте и величине ткива. Важно је да фиксатор може темељно да продре у ткиво. Међутим, прекомерна фиксација може довести до унакрсног повезивања које компликује проналажење антигена, док недовољна фиксација може довести до лошег очувања ткива. - Обрезивање ткива
Друго, одрежите ткиво на дебљину од око 3-5 мм да бисте омогућили адекватан продор средства за фиксирање. Обезбедите правилну оријентацију ткива да бисте ухватили релевантне хистолошке структуре. Ово олакшава процес екстракције када се ткиво касније користи за анализу. - Обрада фиксног узорка
Сада, фиксирано ткиво мора бити дехидрирано: након фиксације, ткиво треба дехидрирати како би се осигурало темељно продирање парафинског воска. Провуците ткиво кроз серију етанола (70%, 80%, 90% и 100%) да бисте уклонили воду.
Чишћење ксиленом: Парафински восак је нерастворљив у води, али растворљив у ксилену. Због тога се вода у ткиву мора заменити ксиленом. Међутим, сам ксилен је нерастворљив у води, али растворљив у алкохолу, што захтева средњи корак где се вода прво замењује алкохолом. Потопите ткиво у ксилен или замену за ксилен да бисте уклонили етанол и припремили ткиво за парафинску инфилтрацију.
Инфилтрација помоћу парафина: Уградите ткиво у растопљени парафински восак, обезбеђујући потпуну инфилтрацију. Овај корак обично укључује неколико промена парафина да би се обезбедила темељна импрегнација. - Уградња ткива
У овом кораку, ткиво се обликује у блок ткива: Поставите ткиво у калуп жељене оријентације и прелијте га растопљеним парафином. Оставите парафин да се стврдне хлађењем на собној температури или на хладној плочи. - Секција и монтажа
Микротомија: Да бисте исечили уграђено ткиво, користите микротом да исечете танке делове (обично 4-5 микрометара) од парафинског блока. Затим се узорак монтира, постављајући секције на стаклене плочице за накнадно бојење и микроскопску анализу.
На крају, проверите квалитет хистологије: Процените прве пресеке под микроскопом да бисте обезбедили правилну фиксацију и обраду. По потреби прилагодите протоколе на основу типа ткива и уоченог квалитета.
ФФПЕ ткива се могу користити за опоравак РНК, ДНК и протеина, као и за откривање знакова рака или других болести. Могу се чувати годинама и суштински су део начина на који истраживачи и лекари користе узорке ткива за дијагнозу и истраживање.
Који су уобичајени проблеми и изазови са ФФПЕ ткивом?
Узорци ткива фиксирани формалином, уметнути у парафин (ФФПЕ) се широко користе у истраживању и дијагностици, али представљају неколико изазова и уобичајених проблема:
- Деградација биомолекула: Продужена фиксација може довести до деградације ДНК, РНК и протеина, што отежава екстракцију висококвалитетних нуклеинских киселина или протеина за низводне примене. Исправна фиксација (избегавање недовољне и прекомерне фиксације) је неопходна за очување ткива.
- Маскирање антигена: Процес фиксације може да маскира антигена места, смањујући ефикасност везивања антитела у имунохистохемији и другим имунолошким тестовима. Ово често захтева проналажење антигена, процедуру којом се маскирање епитопа преокрене и везивање епитоп-антитело се обнавља. Међутим, пуна антигеност се не може увек обновити.
- Променљив квалитет фиксације: Разлике у времену и условима фиксације могу довести до недоследног квалитета узорка, што утиче на поновљивост и упоредивост резултата. Користите поуздане протоколе за фиксирање и избегавајте недовољно и прекомерно фиксирање.
- Оштећење и фрагментација ДНК: Формалинска фиксација ФФПЕ узорака може изазвати различите врсте оштећења ДНК, укључујући деаминацију цитозина (Ц до Т мутације), оксидативно оштећење (нпр. 8-оксо-гуанин који доводи до Г до Т мутација), као и физичке поремећаје као што су урезивања, празнине и абазична места која ометају активност ДНК полимеразе. Процес фиксације формалина може изазвати фрагментацију ДНК, што компликује генетске и геномске анализе као што су ПЦР и секвенцирање.
- Квалитет РНК: РНК екстрахована из ФФПЕ ткива је често фрагментисана и хемијски модификована, што чини изазовом извођење висококвалитетних транскриптомских анализа.
- Модификације протеина: Формалин може да изазове хемијске модификације у протеинима, утичући на њихову структуру и функцију, што може ометати протеомске анализе.
- Артефакти обраде узорака: Током процеса уградње и сечења, механички стрес и топлота могу унети артефакте и изазвати даље оштећење ткива.
- Варијабилност серије до серије: Варијације у протоколима фиксирања и уграђивања између различитих серија могу довести до значајне варијабилности у резултатима, што компликује поређења између студија.
- Проблеми са складиштењем: Дуготрајно складиштење ФФПЕ блокова може довести до додатне деградације и губитка интегритета нуклеинске киселине током времена, утичући на одрживост архивских узорака за ретроспективне студије.
Унакрсно повезивање: Фиксација формалина изазива унакрсно повезивање протеина и нуклеинских киселина, што може ометати молекуларну анализу и утицати на тачност имунохистохемијских и других тестова.
Коришћење оптимизованих протокола, пажљиво руковање узорцима и примена напредних техника помажу да се побољша квалитет и поузданост података добијених из ФФПЕ ткива.
Која је разлика између ФФПЕ и замрзнутог ткива?
ФФПЕ (Формалин-Фикед, Параффин-Ембеддед) ткиво се чува коришћењем формалина за фиксирање ткива, а затим се уграђује у парафински восак, омогућавајући дуготрајно складиштење на собној температури уз одржавање морфологије ткива. Насупрот томе, замрзнуто ткиво се брзо чува замрзавањем, што боље одржава интегритет нуклеинских киселина и протеина, али захтева складиштење на веома ниским температурама.
Које хемикалије се користе за уградњу ФФПЕ?
Хемикалије које се користе за уградњу ФФПЕ обично укључују формалин за фиксирање и парафински восак за уградњу. За уградњу ФФПЕ, ткива се обично фиксирају коришћењем или 10% (в/в) неутралног пуферованог формалина (ФА) или свеже припремљеног 4% (в/в) раствора формалдехида (ПФА) направљеног од параформалдехидног праха. Формалин, који је раствор формалдехида у води, пуферује се до неутралног пХ да би се очувала морфологија ткива и спречило прекомерно умрежавање. Раствор на бази параформалдехида такође обезбеђује ефикасну фиксацију умрежавањем протеина, чиме се стабилизује структура ткива за накнадно уградњу у парафински восак. Ове хемикалије су неопходне за одржавање интегритета и морфологије ткива током процеса фиксације и уградње.
Како се парафин уклања из ФФПЕ узорака?
Да би се уклонио парафин из ФФПЕ узорака, делови ткива се обично подвргавају серији испирања ксиленом након чега следи рехидратација кроз низ степенованих алкохола и на крају воде. Пошто је ксилен веома токсичан, представља ризик по здравље као што су респираторни проблеми, иритација коже и потенцијални дугорочни ефекти са поновљеним излагањем, ултразвучно уклањање парафина се појављује као обећавајућа алтернатива у многим лабораторијама. Ова метода користи интензивне ултразвучне таласе за ефикасно и безбедно уклањање парафина без потребе за токсичним растварачима као што је ксилен, чиме се смањује ризик за лабораторијско особље и ствара безбедније радно окружење.
Колико дуго треба да фиксирам своје марамице за добар квалитет узорка ФФПЕ?
Опште препоруке за трајање фиксације обично предлажу фиксирање узорака ткива у формалину у трајању од 24 до 48 сати. Ово трајање је генерално довољно да се очувају морфологија ткива и ћелијске структуре уз минимизирање прекомерне фиксације, што може довести до прекомерног умрежавања и деградације нуклеинских киселина и протеина. Међутим, оптимално време фиксације може да варира у зависности од величине и типа ткива, при чему мањи или деликатнији узорци захтевају краће време фиксације. Кључно је уравнотежити адекватну фиксацију како би се спречила аутолиза и деградација ткива уз избегавање продужене фиксације која би могла да закомпликује низводне молекуларне анализе.