Протокол за употребу Hielscher соникатора за више узорака у анализи биофилма и протеомској анализи

Употреба соникатора за више узорака, као што су VialTweeter Multi-Tube Sonicator и UIP400MTP Microplate Sonicator, поједностављује лабораторијске радне токове за примене са великим протоком узорака. Оба уређаја омогућавају прецизну и равномерну ултразвучну обраду више узорака, сводећи варијабилност на минимум и побољшавајући репродуктивност. То је нарочито корисно у експериментима који захтевају уједначену лизу узорака, одвајање биофилма, екстракцију протеина или протеолитичку дигестију, у којима су ручне методе или методе обраде појединачних узорака мање ефикасне и подложне недоследностима.

Поједноставите радне токове помоћу соникатора за више узорака

UIP400MTP, на пример, омогућава истовремену ултразвучну обраду бунарчића микроплоче, обезбеђујући равномерно одвајање биофилма или ћелијског материјала. Истовремено, VialTweeter омогућава прецизну лизу и хомогенизацију више узорака у епруветама без унакрсне контаминације. Ови соникатори знатно скраћују време обраде, побољшавају репродуктивност експеримената и одржавају висок интегритет узорака, што их чини незаменљивим алатима у истраживањима у микробиологији, протеомици и молекуларној биологији.
У наставку је дат детаљан протокол који илуструје употребу Hielscher модела соникатора за више узорака, VialTweeter Multi-Tube Sonicator и Microplate Sonicator UIP400MTP, у истраживању формирања биофилма E. coli и накнадној протеомској анализи.

Протокол: формирање и одвајање биофилма и протеомска анализа помоћу Hielscher соникатора за више узорака

1. Припрема бактеријске културе

• Узгајајте бактерије E. coli (сој W3110) на 30°C, температури погодној за формирање биофилма E. coli, у подлози са триптонским бујоном (TB) која садржи:
  – 10 g/L триптона
  – 5 g/L NaCl
• По потреби додајте антибиотике како бисте обезбедили задржавање плазмида.
• За микроскопију и испитивања активности промотора користите сој E. coli W3110 са геномским репортером побољшаног GFP (eGFP) под контролом промотора rplL.
• Користите GFP репортерске плазмиде за различите промоторе (нпр., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) за мерење активности промотора.

2. Узгој и одвајање биофилма

• Засејте по 1,5 mL разблажене бактеријске културе у сваки бунарчић плоче са 12 бунарчића (плоче CellStar са 12 бунарчића, Greiner Bio-One).
• Инкубирајте како бисте омогућили формирање биофилма.
• Пажљиво уклоните планктонску (неадхерентну) културу.

– Исперите сваки бунарчић са 500 µL PBS.
– Одвојте причвршћене ћелије соникацијом плоче са 12 бунарчића у соникатору за микроплоче UIP400MTP. UIP400MTP обезбеђује равномерно одвајање довођењем уједначене ултразвучне енергије у све бунарчиће.
– Подешавања соникације: амплитуда 60%, циклични режим: 60 sec УКЉУЧЕНО / 30 sec ИСКЉУЧЕНО.

3. Сакупљање и лиза ћелија

• Центрифугирајте одвојене ћелије биофилма при 4.500 g током 5 минута.
• Исперите исталожене ћелије PBS-ом.
• Ресуспендујте ћелије у 100 µL 2% натријум-лауроилсаркозината (SLS) и инкубирајте на 95°C током 15 минута.
• Соницирајте помоћу уређаја VialTweeter Multi-Tube Sonicator како бисте обезбедили потпуну лизу ћелија.
  – Подешавања соникације: амплитуда 100%, 50 s УКЉУЧЕНО / 10 s ИСКЉУЧЕНО, уз укупно време рада од 10 min; држите узорке на леду.

4. Редукција и алкилација

• Додајте 5 mM трис(2-карбоксиетил)фосфина (TCEP) да бисте редуковали дисулфидне везе и инкубирајте на 95°C током 15 минута.
• Алкилујте протеине са 10 mM јодоацетамида током 30 минута на 25°C.

5. Квантификација и дигестија протеина

• Центрифугирајте лизате да бисте уклонили ћелијске остатке.
• Квантификујте укупан садржај протеина помоћу комплета Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Дигестирајте 50 µg укупних протеина помоћу 1 µg трипсина у раствору који садржи 2% SLS и 100 mM амонијум-бикарбоната.
• Инкубирајте реакциону смешу за дигестију преко ноћи на 30°C.

6. Пречишћавање пептида

• Исталожите SLS додавањем 1,5% трифлуоросирћетне киселине (TFA), а затим центрифугирајте.
• Пречистите пептиде помоћу C18 микроцентрифугалних колона.
• Осушите пречишћене пептиде и ресуспендујте их у 0,1% TFA.

7. Течна хроматографија – масена спектрометрија (LC-MS/MS)

• Анализирајте пептиде на масеном спектрометру Q-Exactive Plus повезаном са системом Ultimate 3000 RSLC nano.
• Раздвојте пептиде помоћу HPLC колоне са реверзном фазом (75 µm × 42 cm) напуњене C18 смолом (2,4 µm).
• Примените градијент од 2% до 35% растварача B (ацетонитрил са 0,15% мравље киселине) током 140 минута.
• Прикупите податке помоћу MS скенирања високе резолуције, након којих следе тандемска MS/MS скенирања 10 јона са највећим интензитетом.

8. Анализа података

• Обрадите сирове LC-MS податке помоћу софтвера Progenesis.
• Извезите .mgf датотеке и анализирајте их помоћу софтвера MASCOT.
• Извршите квантификацију пептида помоћу софтвера SafeQuant ради контроле квалитета и корекције за лажна открића.
• Спроведите све експерименте у дупликату или трипликату како бисте обезбедили репродуктивност.

Соникатори за више узорака за припрему узорака са великим протоком

Модели соникатора за више узорака VialTweeter и UIP400MTP знатно побољшавају прецизност и ефикасност експерименталних радних токова, нарочито у истраживањима биофилма и протеомици. Њихова способност равномерне обраде више узорака обезбеђује велики капацитет обраде узорака без нарушавања квалитета података. Ове предности, заједно са претходно описаним поједностављеним радним токовима, чине Hielscher соникаторе за више узорака неопходним алатима за савремена биолошка истраживања.

Пројектовање, производња и саветовање – квалитет произведен у Немачкој

Hielscher ултразвучни уређаји познати су по највишим стандардима квалитета и дизајна. Робусност и једноставно руковање омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних уређаја у индустријска постројења. Hielscher ултразвучни уређаји лако се носе са тешким условима и захтевним окружењима.

Hielscher Ultrasonics је компанија са ISO сертификатом и посебан нагласак ставља на ултразвучне уређаје високих перформанси који се одликују најсавременијом технологијом и једноставном употребом. Наравно, Hielscher ултразвучни уређаји су усаглашени са CE захтевима и испуњавају захтеве UL, CSA и RoHs.