Протокол који користи соникаторе са више узорака Хиелсцхер у биофилмској и протеомској анализи

Употреба соникатора са више узорака, као што су ВиалТвеетер Мулти-Тубе Соницатор и УИП400МТП Мицроплате Соницатор, поједностављује лабораторијске токове рада за апликације високе пропусности. Оба уређаја омогућавају прецизну и уједначену ултразвучну обраду на више узорака, минимизирајући варијабилност и побољшавајући репродуктивност. Ово је посебно корисно у експериментима који захтевају доследну лизу узорка, одвајање биофилма, екстракцију протеина или протеолитичку дигестију, где су ручне методе или методе са једним узорком мање ефикасне и склоне недоследности.

Поједноставите радни ток помоћу соникатора са више узорака

УИП400МТП, на пример, омогућава истовремену ултразвучну обраду микроплоча, обезбеђујући равномерно одвајање биофилма или ћелијског материјала. У међувремену, ВиалТвеетер нуди прецизну лизу и хомогенизацију више узорака епрувета без унакрсне контаминације. Ови соникатори значајно смањују време обраде, побољшавају експерименталну поновљивост и одржавају висок интегритет узорка, што их чини незаменљивим алатима у микробиологији, протеомици и истраживању молекуларне биологије.
Испод је детаљан протокол који илуструје употребу модела соникатора са више узорака Хиелсцхер, ВиалТвеетер Мулти-Тубе Соницатор и Мицроплате Соницатор УИП400МТП, у студији која укључује формирање биофилма Е. цоли и накнадну протеомску анализу.

Протокол: Формирање, одвајање и протеомска анализа биофилма помоћу соникатора са више узорака Хиелсцхер

1. Припрема бактеријске културе

• Култура бактерије Е. цоли (сој В3110) на 30°Ц, температура повољна за формирање биофилма Е. цоли, у медијуму триптонског бујона (ТБ) који садржи:
  – 10 г/Л триптона
  – 5 г/Л НаЦл
• Додатак антибиотицима по потреби да би се осигурало задржавање плазмида.
• За микроскопију и студије активности промотера, користите сој В3110 Е. цоли са геномски побољшаним ГФП (еГФП) репортером под контролом рплЛ промотера.
• Користите ГФП репортер плазмиде за различите промотере (нпр. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) за мерење активности промотера.

2. Узгој и одвајање биофилма

• Засејте 1,5 мЛ разблажене бактеријске културе по бунарчићу у плочу са 12 јажица (ЦеллСтар плоче са 12 јажица, Греинер Био-Оне).
• Инкубирајте да бисте омогућили формирање биофилма.
• Пажљиво уклоните планктонску (невезану) културу.

– Исперите сваки бунар са 500 µЛ ПБС.
– Одвојите причвршћене ћелије соникацијом плоче са 12 јажица у соникатору за микроплоче УИП400МТП. УИП400МТП обезбеђује униформно одвајање тако што испоручује доследну ултразвучну енергију кроз све бушотине.
– Подешавања соникације: 60% амплитуда, циклусни режим: 60 секунди УКЉУЧЕНО / 30 секунди ИСКЉУЧЕНО.

3. Сакупљање ћелија и лиза

• Центрифугирајте одвојене ћелије биофилма на 4500 г током 5 минута.
• Оперите пелетиране ћелије са ПБС.
• Ресуспендујте ћелије у 100 µЛ 2% натријум лауроил саркозината (СЛС) и инкубирајте на 95°Ц 15 минута.
• Соницате користећи ВиалТвеетер Мулти-Тубе Соницатор да бисте осигурали потпуну лизу ћелија.
  – Подешавања соникације: 100% амплитуда, 50 с УКЉУЧЕНО / 10 с ИСКЉУЧЕНО за укупно 10 минута рада; држати узорке на леду.

4. Редукција и алкилација

• Додајте 5 мМ трис(2-карбоксиетил)фосфина (ТЦЕП) да бисте смањили дисулфидне везе и инкубирајте на 95°Ц 15 минута.
• Алкилирајте протеине са 10 мМ јодоацетамида 30 минута на 25°Ц.

5. Квантификација и варење протеина

• Центрифугирајте лизате да бисте очистили остатке.
• Квантификујте укупан садржај протеина користећи Пиерце БЦА Протеин Ассаи Кит.
• Проварити 50 µг укупног протеина са 1 µг трипсина у раствору који садржи 2% СЛС и 100 мМ амонијум бикарбоната.
• Инкубирајте реакцију варења преко ноћи на 30°Ц.

6. Пречишћавање пептида

• Преципитирати СЛС додавањем 1,5% трифлуоросирћетне киселине (ТФА), затим центрифугирати.
• Пречистити пептиде користећи Ц18 микроспин колоне.
• Осушити пречишћене пептиде и ресуспендовати у 0,1% ТФА.

7. Течна хроматографија-масена спектрометрија (ЛЦ-МС/МС)

• Анализирајте пептиде на К-Екацтиве Плус масеном спектрометру у комбинацији са Ултимате 3000 РСЛЦ нано системом.
• Одвојите пептиде користећи ХПЛЦ колону реверзне фазе (75 µм × 42 цм) напуњену Ц18 смолом (2,4 µм).
• Нанети градијент од 2% до 35% растварача Б (ацетонитрил са 0,15% мравље киселине) током 140 минута.
• Прибавите податке користећи МС скенирање високе резолуције праћено тандемским МС/МС скенирањем 10 најинтензивнијих јона.

8. Анализа података

• Обрадите сирове ЛЦ-МС податке користећи софтвер Прогенесис.
• Извезите .мгф датотеке и анализирајте их помоћу МАСЦОТ-а.
• Извршите квантификацију пептида користећи СафеКуант за контролу квалитета и подешавање лажног открића.
• Спроведите све експерименте у дупликатима или три примерка да бисте обезбедили поновљивост.

Соникатори за више узорака за припрему узорака високе пропусности

Модели соникатора са више узорака ВиалТвеетер и УИП400МТП значајно побољшавају прецизност и ефикасност експерименталних токова рада, посебно у истраживању биофилма и протеомици. Њихова способност да обрађују више узорака уједначено обезбеђује капацитет високе пропусности без угрожавања квалитета података. Ове предности, у комбинацији са напредним радним процесима наведеним изнад, чине Хиелсцхер соникаторе са више узорака основним алатима за савремена биолошка истраживања.

Дизајн, производња и консалтинг – Квалитет Маде ин Германи

Хиелсцхер ултрасоникатори су познати по свом највишем квалитету и стандардима дизајна. Робусност и једноставан рад омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних апарата у индустријске објекте. Хиелсцхер ултрасоникатори се лако носе са тешким условима и захтевним окружењима.

Хиелсцхер Ултрасоницс је ИСО сертификована компанија и ставља посебан нагласак на ултрасоникаторе високих перформанси са најсавременијом технологијом и једноставношћу за коришћење. Наравно, Хиелсцхер ултрасоникатори су усаглашени са ЦЕ и испуњавају захтеве УЛ, ЦСА и РоХ.