Протокол култивације и одвајања биофилма стафилокока

Стандардизоване методе су неопходне за поуздане резултате истраживања. Овде можете пронаћи протокол култивације и одвајања за стафилококне биофилмове. Овај протокол се фокусира на поједностављену припрему узорака високог протока помоћу УИП400МТП соникатора плоча са више бунара за ефикасно одвајање биофилма високог протока у плочама са 96 бунарчића. Протокол такође садржи кључне кораке за култивацију биофилма, прање и визуелизацију, са фокусом на минимизирању варијабилности и обезбеђивању репродуктивности.

Биофилм стафилокока и истраживање антибиотика

Биофилми стафилокока играју кључну улогу у упорним инфекцијама због своје отпорности на антибиотике и имунолошког одговора. Формирање биофилма обезбеђује заштитно окружење за бактерије, што отежава лечење инфекција. Истраживања биофилма се често фокусирају на разумевање њиховог формирања, понашања и осетљивости на антимикробне супстанце, са нагласком на високо пропусним методама за поједностављење експерименталних токова рада.
УИП400МТП соникатор плоча са више јажица нуди значајну предност у истраживању биофилма омогућавајући брзо и ефикасно одвајање биофилма од плоча са 96 јажица. Овај уређај обезбеђује уједначену ултразвучну енергију свим бунарима, обезбеђујући конзистентне резултате уз минимизирање варијабилности.

Протокол за култивацију и одвајање биофилма стафилокока

У наставку вас водимо корак по корак кроз процес култивације и одвајања биофилма стафилокока. Као пример аналитичког корака, показујемо вам како да спектрофотометријски квантификујете култивисану биомасу бојењем кристално љубичастом.

Култивација биофилма стафилокока

Потребни материјали:

• Стерилне микротитарске плоче са 96 бунарчића са равним дном третиране културом ткива од полистирена са поклопцима
• Триптична сојина чорба (ТСБ) са 0,25% глукозе
• Биолошки сигурносни кабинет

Кораци:

1. Припремите стерилно радно окружење у биолошком безбедном кабинету да бисте свели контаминацију на минимум.
2. Додајте ТСБ који садржи 0,25% глукозе у базенчиће микротитарске плоче. ТСБ без глукозе генерално не подржава формирање биофилма и требало би да се користи као контрола само ако је потребно.
3. Инокулирајте јажице сојевима бактерија припремљеним на следећи начин:
4. Припремите бактеријске суспензије, обезбеђујући да нема већ постојећих кластера ћелија тако што ћете хомогенизовати суспензије помоћу соникације или разбијањем кластера иглом од 23 калибра и кратким вртложним мешањем.
5. Затворите плочу поклопцем и инкубирајте у условима оптималним за формирање биофилма (нпр. 37°Ц током 24 сата).
6. Изведите експеримент у три примерка за сваки бактеријски сој (три отвора по соју) да бисте обезбедили поузданост.
7. Одредите шест бунарчића по плочи за негативне контроле. Може се тестирати до 30 сојева по плочи са 96 бунарчића.

Визуелизација и прање биофилма

1. Након инкубације, пажљиво одбаците медијум да не бисте ометали биофилм.
2. Исперите сваки бунар четири пута физиолошким раствором да бисте уклонили планктонске бактерије.
3. Прегледајте дно бунара да ли постоје беле мрље које указују на присуство биофилма.

Одвајање биофилма помоћу соникатора са више бунара УИП400МТП

Подешавање уређаја и параметри:

• УИП400МТП соникатор плоча са више бунара
• Радна подешавања: 60% амплитуда, циклусни режим са 60 секунди ОН / 30 секунди ОФФ

Кораци:

1. Поставите испрану микротитарску плочу на УИП400МТП платформу.
2. Соникирајте узорке на препорученим подешавањима (60% амплитуда, 60 секунди УКЉУЧЕНО, 30 секунди ИСКЉУЧЕНО). Прилагодите подешавања соју бактерија.
3. Покрените процес соникације да бисте одвојили биофилм. Ултразвучни таласи ометају матрицу биофилма, ослобађајући приањајуће бактерије.
4. УИП400МТП обезбеђује уједначену експозицију на свим бунарима за доследне резултате одвајања.

Аналитички корак: Квантификација биомасе одвојеног стафилококусног биофилма коришћењем кристално љубичице (ЦВ)

Потребни материјали:

• 0.1% раствор кристално љубичасте (ЦВ).
• 95% етанол или 30% сирћетна киселина (за солубилизацију)
• Читач микроплоча способан да чита на 570 нм
• Стерилне микротитарске плоче за бојење

Кораци:

1. Припрема плоче за бојење: Пренесите 100 µЛ одвојене суспензије биофилма из сваког лежишта ултразвучне плоче у одговарајуће бунарчиће чисте, стерилне микротитарске плоче са 96 базенчића. Ово обезбеђује јасно и уједначено окружење за бојење.
2. Бојење одвојеног биофилма: Додајте 150 µЛ 0,1% кристално љубичастог раствора у сваки бунар који садржи суспензију одвојеног биофилма. Нежно пипетирајте да бисте обезбедили равномерно мешање суспензије биофилма и кристално љубичасте боје.
3. Инкубација: Оставите плочу да се инкубира на собној температури 15 минута како би кристално љубичаста боја ефикасно обојила биомасу.
4. Прање: Након инкубације, пажљиво баците кристално љубичасти раствор из бунара без ометања биомасе. Оперите сваки бунар три пута стерилним физиолошким раствором да бисте уклонили невезану мрљу.
5. Сушење: Пустите да се плоча осуши на собној температури или испод стерилне хаубе. Избегавајте загревање, јер то може да промени резултате.
6. Солубилизација: Додајте 200 µЛ 95% етанола (или 30% сирћетне киселине, у зависности од стандардне лабораторијске праксе) у сваки бунар да бисте растворили везани кристал љубичасти. Нежно мешајте пипетом или мућкањем плоче 10 минута на собној температури.
7. Мерење: Измерите оптичку густину (ОД) раствореног кристално љубичастог раствора на 570 нм помоћу читача микроплоче.
8. Анализа података: Одузмите средњу вредност ОД570 негативних контрола (бажирићи са ТСБ-ом, али без бактеријског инокулума) из експерименталних бунара да бисте узели у обзир позадинско бојење. Забележите и анализирајте податке.

Напомена: Изведите експеримент у три примерка за сваки услов да бисте обезбедили поновљивост. Обезбедите правилно руковање кристално љубичастим и етанолом, поштујући безбедносне протоколе и протоколе за одлагање.
 

Кључне предности УИП400МТП на први поглед:

• Висока пропусна обрада: Дизајниран посебно за плоче са више јажица, омогућавајући вам да обрађујете више узорака истовремено.
• Униформна ултразвучна дистрибуција: Обезбеђује једнак ултразвучни интензитет у свим бунарима, обезбеђујући доследне резултате за све узорке.
• Користите било коју стандардну плочу: УИП400МТП може да рукује са било којим стандардним плочама са више јажица, Петријевим посудама и носачима за епрувете. Нису потребне скупе власничке плоче!
• Интерфејс прилагођен кориснику: Једноставан за подешавање и контролу, што га чини одличним алатом за повећање продуктивности лабораторије. Програмабилна подешавања и аутоматизација олакшавају стандардизацију процеса!