Протокол за узгој и одвајање биофилма бактерија рода Staphylococcus

Стандардизоване методе су неопходне за поуздане резултате истраживања. Овде можете пронаћи протокол за узгој и одвајање стафилококних биофилмова. Овај протокол је усмерен на поједностављену припрему великог броја узорака помоћу соникатора за плоче са више бунарчића UIP400MTP, ради ефикасног одвајања биофилма уз високу пропусност у плочама са 96 бунарчића. Протокол садржи и кључне кораке за узгој, испирање и визуелизацију биофилма, са нагласком на смањење варијабилности и обезбеђивање поновљивости.

Истраживање биофилмова бактерија рода Staphylococcus и антибиотика

Биофилмови бактерија рода Staphylococcus имају кључну улогу у упорним инфекцијама због своје отпорности на антибиотике и имуне одговоре. Формирање биофилма обезбеђује заштитно окружење за бактерије, што отежава лечење инфекција. Истраживања биофилмова често су усмерена на разумевање њиховог формирања, понашања и осетљивости на антимикробна средства, са нагласком на методе високе пропусности ради поједностављивања експерименталних поступака.
Соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP пружа значајну предност у истраживању биофилмова јер омогућава њихово брзо и ефикасно одвајање са плоча са 96 бунарчића. Овај уређај равномерно доводи ултразвучну енергију у све бунарчиће, обезбеђујући уједначене резултате уз смањење варијабилности.

Протокол за узгој и одвајање биофилма бактерија рода Staphylococcus

У наставку вас водимо корак по корак кроз поступак узгоја и одвајања стафилококног биофилма. Као пример аналитичког корака, показујемо како се узгојена биомаса може спектрофотометријски квантификовати бојењем кристал виолетом.

Узгој биофилма бактерија рода Staphylococcus

Потребан материјал:

• Стерилне полистиренске микротитарске плоче са 96 бунарчића са равним дном, површински обрађене за културу ткива, са поклопцима
• Триптиказа соја бујон (TSB) са 0,25% глукозе
• Кабинет за биолошку безбедност

Кораци:

1. Припремите стерилно радно окружење у кабинету за биолошку безбедност како бисте свели контаминацију на најмању меру.
2. Додајте TSB који садржи 0,25% глукозе у бунарчиће микротитарске плоче. TSB без глукозе углавном не подржава формирање биофилма и треба га користити само као контролу ако је потребно.
3. Инокулишите бунарчиће бактеријским сојевима припремљеним како је описано у наставку:
4. Припремите бактеријске суспензије, водећи рачуна да не садрже већ постојеће ћелијске агрегате, тако што ћете суспензије хомогенизовати соникацијом или разбити агрегате иглом калибра 23 уз кратко мешање на вортекс мешалици.
5. Затворите плочу њеним поклопцем и инкубирајте у условима оптималним за формирање биофилма (нпр. на 37°C током 24 сата).
6. Изведите експеримент у три понављања за сваки бактеријски сој (три бунарчића по соју) како бисте обезбедили поузданост.
7. Одвојите шест бунарчића по плочи за негативне контроле. На једној плочи са 96 бунарчића може се испитати до 30 сојева.

Визуелизација и испирање биофилма

1. Након инкубације пажљиво одбаците хранљиву подлогу како не бисте нарушили биофилм.
2. Исперите сваки бунарчић четири пута физиолошким раствором како бисте уклонили планктонске бактерије.
3. Прегледајте дно бунарчића да бисте уочили беле мрље које указују на присуство биофилма.

Одвајање биофилма помоћу соникатора за плоче са више бунарчића UIP400MTP

Подешавање уређаја и параметри:

• Соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP
• Радна подешавања: амплитуда 60%, циклични режим са 60 секунди рада / 30 секунди паузе

Кораци:

1. Поставите испрану микротитарску плочу на платформу уређаја UIP400MTP.
2. Соникујте узорке при препорученим подешавањима (амплитуда 60%, 60 секунди рада, 30 секунди паузе). Прилагодите подешавања бактеријском соју.
3. Покрените поступак соникације да бисте одвојили биофилм. Ултразвучни таласи нарушавају матрикс биофилма и ослобађају приањајуће бактерије.
4. UIP400MTP обезбеђује равномерно излагање у свим бунарчићима ради уједначених резултата одвајања.

Аналитички корак: квантификација биомасе одвојеног биофилма бактерија рода Staphylococcus помоћу кристал виолета (CV)

Потребан материјал:

• 0,1% раствор кристал виолета (CV)
• 95% етанол или 30% сирћетна киселина (за солубилизацију)
• Читач микроплоча који омогућава мерење на 570 nm
• Стерилне микротитарске плоче за бојење

Кораци:

1. Припрема плоче за бојење: Пренесите 100 µL суспензије одвојеног биофилма из сваког бунарчића сониковане плоче у одговарајуће бунарчиће чисте, стерилне микротитарске плоче са 96 бунарчића. Тиме се обезбеђује чиста и уједначена средина за бојење.
2. Бојење одвојеног биофилма: Додајте 150 µL 0,1% раствора кристал виолета у сваки бунарчић који садржи суспензију одвојеног биофилма. Нежно пипетирајте да бисте обезбедили равномерно мешање суспензије биофилма и кристал виолета.
3. Инкубација: Оставите плочу да се инкубира на собној температури 15 минута како би кристал виолет ефикасно обојио биомасу.
4. Испирање: Након инкубације пажљиво одбаците раствор кристал виолета из бунарчића, не нарушавајући биомасу. Исперите сваки бунарчић три пута стерилним физиолошким раствором да бисте уклонили невезану боју.
5. Сушење: Оставите плочу да се осуши на ваздуху на собној температури или у комори са стерилним протоком ваздуха. Избегавајте загревање јер оно може променити резултате.
6. Солубилизација: Додајте 200 µL 95% етанола (или 30% сирћетне киселине, у зависности од стандардне лабораторијске праксе) у сваки бунарчић да бисте растворили везани кристал виолет. Нежно мешајте пипетирањем или протресањем плоче 10 минута на собној температури.
7. Мерење: Измерите оптичку густину (OD) раствора солубилизованог кристал виолета на 570 nm помоћу читача микроплоча.
8. Анализа података: Одузмите средњу вредност OD570 негативних контрола (бунарчића са TSB, али без бактеријског инокулума) од вредности измерених у експерименталним бунарчићима да бисте кориговали позадинско бојење. Забележите и анализирајте податке.

Напомена: Изведите експеримент у три понављања за сваки услов да бисте обезбедили поновљивост. Обезбедите правилно руковање кристал виолетом и етанолом, придржавајући се протокола за безбедност и одлагање отпада.
 

Кратак преглед кључних предности уређаја UIP400MTP:

• Обрада великог броја узорака: Пројектован посебно за плоче са више бунарчића, што вам омогућава истовремену обраду више узорака.
• Равномерна расподела ултразвука: Обезбеђује једнак интензитет ултразвука у свим бунарчићима, пружајући доследне резултате за све узорке.
• Користите било коју стандардну плочу: UIP400MTP може да обрађује било које стандардне плоче са више бунарчића, Петријеве шоље и сталке са епруветама. Нису потребне скупе плоче специфичне за произвођача!
• Интерфејс једноставан за употребу: Једноставно подешавање и управљање чине га одличним алатом за повећање продуктивности лабораторије. Програмабилна подешавања и аутоматизација олакшавају стандардизацију процеса!