Протокол ASTM E2799-22 за процену антимикробне ефикасности

Hielscher UIP400MTP је снажан и ефикасан соникатор за плоче са више бунарчића, осмишљен да поједностави корак соникације у протоколу ASTM E2799-22. Равномерним преносом ултразвучне енергије на целу микротитарску плочу, UIP400MTP обезбеђује доследно и поуздано одвајање биофилмова са поклопаца са клиновима, без оштећивања ћелија или нарушавања интегритета узорака. Његова могућност обраде великог броја узорака и једноставно руковање значајно скраћују време обраде уз истовремено побољшање репродуктивности, што га чини идеалним решењем за лабораторије које спроводе тестове вијабилности биофилмова и испитивања антимикробне ефикасности.

ASTM E2799

ASTM E2799 је стандардизована метода испитивања осмишљена за процену ефикасности антимикробних средстава против биофилмова, са посебним фокусом на Pseudomonas aeruginosa. Биофилмови су сложене микробне заједнице које приањају уз површине и показују повећану отпорност на антимикробне третмане, што их чини значајним изазовом у здравству, индустрији и заштити животне средине. Ова метода користи тест минималне концентрације за ерадикацију биофилма (MBEC) како би обезбедила поуздан и репродуктиван оквир за испитивање дезинфекционих средстава у реалним условима биофилма.

Како соникација доприноси примени стандарда ASTM E2799?

Соникација има кључну улогу у протоколу ASTM E2799 јер олакшава одвајање биофилмова са испитних површина, чиме обезбеђује тачну процену вијабилности микроорганизама након третмана. Коришћењем контролисане ултразвучне енергије, протокол омогућава ефикасно и доследно разарање биофилма без оштећивања ћелија, што даје прецизне и репродуктивне резултате. То чини ASTM E2799 суштинским алатом за унапређење истраживања биофилмова и развој ефикасних антимикробних стратегија.

Како спровести MBEC тест у складу са стандардом ASTM E2799-22

Протокол ASTM E2799-22 описује кораке за процену ефикасности антимикробних средстава против биофилмова. При коришћењу соникатора за микротитарске плоче Hielscher UIP400MTP, протокол се може прилагодити тако да укључи ову напредну методу соникације за одвајање биофилмова. У наставку су описани кораци прилагођени употреби соникатора за микроплоче UIP400MTP:

1. Припрема биофилмова
   Припремите стерилну микротитарску плочу са 96 бунарчића и одвојивим поклопцима са клиновима.
   Инокулишите бунарчиће стандардизованом бактеријском суспензијом у одговарајућој хранљивој подлози.
   Поставите поклопац са клиновима на плочу, водећи рачуна да клинови буду потпуно уроњени у бактеријску суспензију.
   Инкубирајте плочу у контролисаним условима (нпр. температуре и времена) како бисте омогућили формирање биофилма на клиновима.
2. Третман антимикробним средствима
   Након формирања биофилма, замените подлогу свежом подлогом која садржи испитивана антимикробна средства у различитим концентрацијама.
   Поново поставите поклопац са клиновима и инкубирајте у условима наведеним у плану испитивања.
3. Припрема за одвајање биофилма
   Након третмана, исперите поклопац са клиновима урањањем у стерилан раствор за испирање како бисте уклонили преостала антимикробна средства и слабо приањајуће планктонске ћелије.
4. Одвајање биофилма помоћу соникатора UIP400MTP
   Припремите нову микротитарску плочу са 96 бунарчића која садржи подлогу за опоравак (нпр. неутрализујући бујон).
   Одвојите биофилмове постављањем поклопца са клиновима у бунарчиће плоче са подлогом за опоравак.
   Уметните плочу у соникатор UIP400MTP, водећи рачуна да поклопац и плоча буду правилно поравнати.
   Подесите соникатор на амплитуду од 70%–80% и соницирајте 3–4 минута у цикличном режиму рада како бисте обезбедили доследно одвајање биофилма без лизе ћелија.
5. Процена вијабилности биофилма
   Након соникације, обрадите подлогу за опоравак која садржи одвојене ћелије биофилма стандардним микробиолошким или аналитичким техникама, као што су:
   • Бројање јединица које формирају колоније (CFU): Направите серијска разблажења и засејте их на агар ради одређивања броја вијабилних ћелија.
   • Мерења оптичке густине (OD): Користите спектрофотометријску анализу за процену густине ћелија.
   • Тестови вијабилности засновани на флуоресценцији: Квантификујте живе и мртве ћелије помоћу флуоресцентних боја.
6. Анализа података
   Упоредите податке о вијабилности третираних и нетретираних биофилмова како бисте утврдили ефикасност антимикробних средстава.
   Израчунајте минималну концентрацију за ерадикацију биофилма (MBEC) на основу концентрације потребне за елиминацију вијабилних ћелија биофилма.
7. Контрола квалитета
   Обезбедите доследне услове соникације редовним калибрисањем уређаја UIP400MTP и провером да процес одвајања биофилма не доводи до значајне лизе или уништавања ћелија.
   Укључите одговарајуће контроле, као што су нетретирани биофилмови и слепе пробе које садрже само подлогу, како бисте потврдили валидност резултата.

Ћелије биофилма формиране на клиновима одвојене су соникацијом (Hielscher Ultrasound Technology, Телтов, Немачка, UIP250MTP) током 5 min у плочама са 96 бунарчића које су садржале свежу хранљиву подлогу за опоравак ћелија.
(Слика и студија: ©de Oliveira et al., 2016)

Интегрисањем уређаја UIP400MTP у радни ток протокола ASTM E2799-22 оптимизује се процес одвајања биофилма у погледу доследности, ефикасности и примене за обраду великог броја узорака.