Протокол МБЕЦ теста користећи Соницатор за плоче са 96 јажица УИП400МТП

МБЕЦ тест се користи за одређивање концентрације антимикробних агенаса потребних за елиминацију биофилма формираних на поклопцима. Да би се проценила одрживост биофилма, биофилмови се прво морају одвојити од поклопца на плочи са 96 бунарчића. Соникација је најпоузданији и најефикаснији метод за овај одред. Соникатор плоча са више бунара УИП400МТП је посебно дизајниран за обраду плоча за анализу са максималном ефикасношћу и практичношћу, поједностављујући и убрзавајући МБЕЦ тестове високог протока.

Соницатион фор Биофилм Детацхмент

Соникација је кључни корак у тестовима минималне концентрације искорењивања биофилма (МБЕЦ), омогућавајући ефикасно уклањање ћелија биофилма са њиховог површинског причвршћења. Биофилми су инхерентно структурисане заједнице микроорганизама затворених у екстрацелуларни матрикс, што их чини знатно отпорнијим на антимикробне агенсе у поређењу са планктонским ћелијама. Током МБЕЦ тестова, соникација користи ултразвучне таласе за генерисање контролисане кавитације, ометајући матрикс биофилма и ослобађајући уграђене ћелије у суспензију. Овај корак осигурава да су ћелије биофилма равномерно дисперговане у медијуму за опоравак, олакшавајући тачне процене одрживости путем наношења плоча, разблаживања или спектрофотометријских метода. Без одговарајућег одвајања биофилма, резидуалне компоненте матрикса би могле да штите ћелије, што доводи до потцењивања антимикробне ефикасности. Због тога је соникација неопходна за добијање поузданих и поновљивих МБЕЦ вредности, одражавајући истински потенцијал за искорењивање тестираних агенаса. Соникатор плоча са више бунара УИП400МТП омогућава лаку припрему узорака високог протока у плочама за анализу.

Протокол за анализу минималне концентрације биофилма (МБЕЦ).

Корак 1: Формирање биофилма

1. Припремите бактеријску суспензију:
   Узгајајте бактерије у одговарајућим медијумима до раста у лог фази.
   Разблажите бактеријску културу до дефинисане оптичке густине (нпр. ОД600 ~0,1).
2. Инокулирајте плочу са 96 јажица:
   Додати бактеријску суспензију (нпр. 150-200 µЛ) у сваки бунар стандардне микротитарске плоче са 96 базенчића.
3. Причврстите поклопац за клин:
   Поставите поклопац за клин на инокулисану плочу да бисте омогућили формирање биофилма на површинама клинова.
4. Инкубирајте плочу:
   Инкубирајте поставку на одговарајућој температури (нпр. 37°Ц) 24–48 сати без мућкања да бисте подстакли раст биофилма.

Корак 2: Третман антимикробним агенсима

• Припремите антимикробна раствора:
  Припремите низ антимикробних концентрација у свежим медијима.
  Изложите биофилмове антимикробним агенсима:
  Уклоните поклопац са бактеријске културе и исперите га стерилним физиолошким раствором или ПБС да бисте уклонили планктонске ћелије.
  Поставите поклопац са клином у нову плочу са 96 јажица која садржи антимикробне растворе.
• Инкубирајте плочу:
  Инкубирајте одређени период (нпр. 24 сата) да бисте омогућили излагање антимикробним средствима.

Корак 3: Обрада ултразвуком помоћу соникатора за плоче са 96 бунара УИП400МТП

Корак соникације је критичан за одвајање биофилма са поклопца за клинове да би се проценила одрживост. Следите ове кораке за соникатор УИП400МТП:

1. Припремите подешавање:
   Напуните свежу плочу са 96 бунарчића медијумом за опоравак (нпр. неутрализујућим бујоном или свежим медијумом за раст) у сваки бунар.
2. Пренесите поклопац клина:
   Уклоните поклопац од клина са плоче за антимикробни третман.
   Исперите поклопац у стерилном физиолошком раствору или ПБС-у да бисте уклонили заостале антимикробне агенсе.
3. Поставите плочу и соникатор:
   Причврстите поклопац за клин на плочу са медијумом за опоравак.
   Поставите плочу са медијумом за опоравак на платформу соникатора УИП400МТП, обезбеђујући да је плоча центрирана и стабилна.
4. Подесите параметре соникације:
   Подесите параметре соникације на УИП400МТП (Подешавања се могу прилагодити биофилму):
   Амплитуда: 70–100%.
   Време соникације: 1–3 минута (подесите на основу робусности биофилма) у режиму циклуса.
5. Соницате:
   Започните процес соникације. Ултразвучна вибрација ће померити биофилмове са површина клинова у медијум за опоравак.
6. Пратите процес:
   Користите сензор температуре који се може прикључити да надгледате температуру узорка у бунарима. УИП400МТП се може повезати на лабораторијски расхладни уређај за хлађење.
7. Руковање након ултразвука:
   Одмах пребаците медијум за опоравак (који сада садржи одвојене биофилмове) у свежу стерилну плочу за анализу низводно.

(А) Плоча која садржи ТСБ са 2% глукозе која се користи за формирање биофилма, опоравак ћелија и
одређивање МИЦ и МБЦБ; (Б) Поклопац са иглама за формирање стафилококних биофилма. одређивање МИЦ и МБЦБ; (Б) Поклопац са иглама за формирање стафилококних биофилма.
Ћелије биофилма формиране на иглицама су уклоњене ултразвучном обрадом (Хиелсцхер Ултрасоунд Тецхнологи) током 5 минута у плочама са 96 јажица које садрже свеж медијум за културу за опоравак ћелија.
(Слика и студија: ©де Оливеира ет ал., 2016)

Корак 4: Процена одрживости

Биофилмови одвојени од плоче и културе:

1. Извршите серијска разблажења медијума за опоравак и плоче на агар да бисте набројали јединице које формирају колоније (ЦФУ).
   Алтернативно, користите колориметријски или флуоресцентни тест одрживости.
2. Сними резултате:
   Одредите МБЕЦ као најнижу концентрацију антимикробног средства која је искоријенила одрживост биофилма који се може открити.

Дизајн, производња и консалтинг – Квалитет Маде ин Германи

Хиелсцхер ултрасоникатори су познати по свом највишем квалитету и стандардима дизајна. Робусност и једноставан рад омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних апарата у индустријске објекте. Хиелсцхер соникатори се лако носе са тешким условима и захтевним окружењем.

Хиелсцхер Ултрасоницс је ИСО сертификована компанија и ставља посебан нагласак на ултрасоникаторе високих перформанси са најсавременијом технологијом и једноставношћу за коришћење. Наравно, Хиелсцхер ултрасоникатори су усаглашени са ЦЕ и испуњавају захтеве УЛ, ЦСА и РоХ.

Прочитајте овде како се УИП400МТП користи за одвајање биофилма као корак припреме узорка током АСТМ Е2799 протокола за тестирање ефикасности дезинфекционог средства против биофилма Псеудомонас аеругиноса помоћу МБЕЦ теста.