Протокол MBEC теста уз употребу соникатора за плоче са 96 бунарчића UIP400MTP

MBEC тест се користи за одређивање концентрације антимикробних средстава потребне за елиминисање биофилмова формираних на поклопцима са клиновима. Да би се проценила вијабилност биофилмова, они се најпре морају одвојити од поклопаца са клиновима плоче са 96 бунарчића. Соникација је најпоузданија и најефикаснија метода за ово одвајање. Соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP посебно је пројектован за обраду плоча за тестирање уз максималну ефикасност и практичност, чиме поједностављује и убрзава MBEC тестове са великом пропусношћу.

Соникација за одвајање биофилма

Соникација је кључни корак у тестовима минималне концентрације за ерадикацију биофилма (MBEC), који омогућава ефикасно одвајање ћелија биофилма од површине за коју су причвршћене. Биофилмови су по својој природи структурисане заједнице микроорганизама обавијене екстрацелуларним матриксом, што их чини знатно отпорнијим на антимикробна средства у поређењу са планктонским ћелијама. Током MBEC тестова, соникација користи ултразвучне таласе за стварање контролисане кавитације, чиме се нарушава матрикс биофилма и ћелије уграђене у њега ослобађају у суспензију. Овај корак обезбеђује равномерно распршивање ћелија биофилма у медијуму за опоравак, што олакшава тачну процену вијабилности засејавањем на подлоге, разблаживањем или спектрофотометријским методама. Без правилног одвајања биофилма, преостале компоненте матрикса могле би да штите ћелије, што би довело до потцењивања ефикасности антимикробних средстава. Због тога је соникација неопходна за добијање поузданих и поновљивих MBEC вредности, које одражавају стварни потенцијал испитиваних средстава за ерадикацију. Соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP омогућава једноставну припрему узорака са великом пропусношћу у плочама за тестирање.

Протокол теста минималне концентрације за ерадикацију биофилма (MBEC)

Корак 1: Формирање биофилма

1. Припремите бактеријску суспензију:
   Узгајајте бактерије у одговарајућим медијумима до логаритамске фазе раста.
   Разблажите бактеријску културу до дефинисане оптичке густине (нпр. OD600 ~0,1).
2. Инокулишите плочу са 96 бунарчића:
   Додајте бактеријску суспензију (нпр. 150–200 µL) у сваки бунарчић стандардне микротитарске плоче са 96 бунарчића.
3. Поставите поклопац са клиновима:
   Поставите поклопац са клиновима на инокулисану плочу како бисте омогућили формирање биофилма на површинама клинова.
4. Инкубирајте плочу:
   Инкубирајте постављени систем на одговарајућој температури (нпр. 37°C) током 24–48 сати без протресања како бисте подстакли раст биофилма.

Корак 2: Третман антимикробним средствима

• Припремите антимикробне растворе:
  Припремите низ концентрација антимикробних средстава у свежим медијумима.
  Изложите биофилмове антимикробним средствима:
  Уклоните поклопац са клиновима из бактеријске културе и исперите га у стерилном физиолошком раствору или PBS-у да бисте уклонили планктонске ћелије.
  Поставите поклопац са клиновима у нову плочу са 96 бунарчића која садржи антимикробне растворе.
• Инкубирајте плочу:
  Инкубирајте током дефинисаног периода (нпр. 24 сата) како бисте омогућили излагање антимикробним средствима.

Корак 3: Соникација соникатором за плоче са 96 бунарчића UIP400MTP

Корак соникације је пресудан за одвајање биофилмова од поклопаца са клиновима ради процене вијабилности. За соникатор UIP400MTP пратите ове кораке:

1. Припремите систем:
   У сваки бунарчић нове плоче са 96 бунарчића додајте медијум за опоравак (нпр. неутралишући бујон или свеж медијум за раст).
2. Пренесите поклопац са клиновима:
   Уклоните поклопац са клиновима из плоче за третман антимикробним средствима.
   Исперите поклопац са клиновима у стерилном физиолошком раствору или PBS-у да бисте уклонили преостала антимикробна средства.
3. Позиционирајте плочу и соникатор:
   Поставите поклопац са клиновима на плочу са медијумом за опоравак.
   Поставите плочу са медијумом за опоравак на платформу соникатора UIP400MTP и уверите се да је плоча центрирана и стабилна.
4. Подесите параметре соникације:
   Подесите параметре соникације на уређају UIP400MTP (подешавања се могу прилагодити биофилму):
   Амплитуда: 70–100%.
   Време соникације: 1–3 минута (прилагодите према отпорности биофилма) у цикличном режиму рада.
5. Соницирајте:
   Покрените процес соникације. Ултразвучне вибрације ће одвојити биофилмове од површина клинова и пренети их у медијум за опоравак.
6. Пратите процес:
   Користите прикључни сензор температуре за праћење температуре узорака у бунарчићима. UIP400MTP се може повезати са лабораторијским расхладним уређајем ради хлађења.
7. Поступање након соникације:
   Одмах пренесите медијум за опоравак (који сада садржи одвојене биофилмове) у нову стерилну плочу ради даље анализе.

(A) Плоча која садржи TSB са 2% глукозе, коришћена за формирање биофилма, опоравак ћелија и
одређивање MIC и MBCB; (B) Поклопац са клиновима за формирање стафилококних биофилмова. одређивање MIC и MBCB; (B) Поклопац са клиновима за формирање стафилококних биофилмова.
Ћелије биофилма формиране на клиновима одвојене су соникацијом (Hielscher Ultrasound Technology) током 5 min у плочама са 96 бунарчића које су садржале свеж медијум за култивацију ради опоравка ћелија.
(Слика и студија: ©de Oliveira et al., 2016)

Корак 4: Процена вијабилности

Засејте на подлоге и култивишите одвојене биофилмове:

1. Направите серијска разблажења медијума за опоравак и засејте их на агар ради одређивања броја јединица које формирају колоније (CFU).
   Алтернативно, користите колориметријски тест вијабилности или тест заснован на флуоресценцији.
2. Забележите резултате:
   Одредите MBEC као најнижу концентрацију антимикробног средства која је елиминисала детектабилну вијабилност биофилма.

Пројектовање, производња и консалтинг – квалитет произведен у Немачкој

Hielscher ултразвучни уређаји су познати по највишим стандардима квалитета и дизајна. Робусност и једноставно руковање омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних уређаја у индустријска постројења. Hielscher соникатори лако подносе тешке услове и захтевна окружења.

Hielscher Ultrasonics је компанија са ISO сертификатом и посебан нагласак ставља на ултразвучне уређаје високих перформанси који се одликују најсавременијом технологијом и једноставношћу употребе. Наравно, Hielscher ултразвучни уређаји су усаглашени са CE захтевима и испуњавају захтеве UL, CSA и RoHs.

Прочитајте овде како се UIP400MTP користи за одвајање биофилма као корак припреме узорака у оквиру протокола ASTM E2799 за испитивање ефикасности дезинфекционих средстава против биофилма Pseudomonas aeruginosa применом MBEC теста.