Протокол испитивања минималне инхибиторне концентрације (MIC)

Испитивање минималне инхибиторне концентрације (MIC) засновано на биофилму представља неопходну методу за процену ефикасности антимикробних средстава против микроорганизама повезаних са биофилмом, који показују повећану отпорност због свог заштитног ванћелијског матрикса. Кључни корак у овом испитивању је одвајање структура биофилма ради ослобађања ћелија уграђених у њега и тачне процене вијабилности. Соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP олакшава овај процес применом фокусираног ултразвука за стварање контролисане кавитације, ефикасно одвајајући ћелије биофилма и диспергујући их у уједначену суспензију. Овако прецизно и поновљиво разарање биофилма повећава поузданост и капацитет обраде узорака у MIC испитивањима, што UIP400MTP чини неопходним алатом за унапређење истраживања биофилма.

Зашто треба да користим соникацију током MIC испитивања?

• Тачни, поновљиви подаци: Добијте уједначене ћелијске суспензије које елиминишу заштитно дејство матрикса, чиме се обезбеђује да број колонија и очитавања оптичке густине заиста одражавају ефикасност антимикробног средства.
• Ефикасност обраде великог броја узорака: Обрадите целу плочу са 96 бунарчића истовремено за само 1–3 минута, замењујући споро ручно стругање са неуједначеним резултатима поједностављеним током рада.
• Очувана вијабилност ћелија: Нежно одвојите ћелије уграђене у биофилм без физичких оштећења изазваних стругањем, одржавајући више стопе преживљавања ради поузданог израчунавања MIC/MBEC.
• Нулти ризик од унакрсне контаминације: Искористите предности бесконтактне конструкције са чашастом сонотродом која равномерно третира све бунарчиће, без додиривања појединачних узорака или бунарчића сондама.
• Усклађеност са захтевима стандарда: Ускладите своју методологију са валидираним индустријским протоколима као што је ASTM E2799-22, чиме ваши подаци добијају већу веродостојност за регулаторне потребе или објављивање.
• Поуздан скрининг лекова и третмана: Ослоните се на резултате испитивања осетљивости да бисте доносили боље одлуке о антимикробној ефикасности, одређивању профила резистенције или развоју терапија.

Соникација за одвајање биофилма

MIC испитивање засновано на биофилму обично мери вијабилност бактерија или инхибицију раста применом метода као што су засејавање на подлоге, бројање колонија или мерење оптичке густине. Соникација је кључни корак у MIC испитивањима заснованим на биофилму када се процењује осетљивост микроорганизама повезаних са биофилмом на антимикробна средства. Њена примарна функција је одвајање ћелија уграђених у матрикс биофилма и њихово дисперговање у уједначену суспензију ради тачне анализе.
Биофилмови су знатно отпорнији на антимикробна средства од планктонских ћелија, због чега је правилно одвајање кључно за тачну анализу. Током овог процеса, ултразвучни таласи стварају контролисану кавитацију, разарајући матрикс биофилма и ослобађајући ћелије уграђене у њега у уједначену суспензију у медијуму за опоравак. Овај корак омогућава прецизну процену вијабилности ћелија диспергованих из биофилма применом метода као што су засејавање на подлоге, разблаживање и бројање колонија. Правилно разарање биофилма соникацијом спречава да заостале компоненте матрикса штите ћелије, што би иначе могло довести до потцењивања антимикробне активности. Соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP посебно је погодан за ову намену јер пружа прецизне и поновљиве услове соникације који обезбеђују поуздану припрему плоча за испитивање уз велики капацитет обраде узорака.

Зашто је соникација неопходна у испитивањима минималне инхибиторне концентрације заснованим на биофилму

За мерење вијабилности и бројање ћелија неопходно је потпуно и поуздано одвајање и дисперговање појединачних ћелија. UIP400MTP поспешује уједначено одвајање биофилма и дисперговање ћелија без оштећења, ради добијања поузданих резултата испитивања.

• Сложеност биофилма: Биофилмови су структурисане микробне заједнице обавијене матриксом од екстрацелуларних полимерних супстанци (EPS), који штити микроорганизме и чини их отпорнијим на антимикробне агенсе.
• Равномерно дисперговање: Да би се прецизно измерила вијабилност ћелија уграђених у биофилм или њихова осетљивост на антимикробне агенсе, биофилм се најпре мора одвојити и разбити у хомогену суспензију.

Протокол за одређивање минималне инхибиторне концентрације на биофилму

Тест минималне инхибиторне концентрације (MIC) одређује најнижу концентрацију антимикробног агенса потребну за инхибицију видљивог раста микроорганизама. Овај протокол је намењен микроорганизмима повезаним са биофилмом и користи соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP за разарање биофилма.

Корак 1: Припрема бактеријског инокулума

1. Припремите бактеријску суспензију:
   Узгајајте бактерије у одговарајућим подлогама до средине логаритамске фазе раста.
   Разблажите културу да бисте постигли стандардизовану густину ћелија (нпр. стандард 0,5 по Макфарланду или OD600 ~0,1).
2. Припремите растворе антимикробних агенаса:
   Разблажите антимикробни агенс у одговарајућој подлози да бисте добили низ концентрација (нпр. серијска двострука разблажења).
3. Расподелите у плочу са 96 бунарчића:
   Додајте растворе антимикробних агенаса у бунарчиће стандардне плоче са 96 бунарчића, тако да коначна запремина у сваком бунарчићу буде ~150–200 µL.
   Укључите контроле раста (без антимикробног агенса) и контроле стерилности (без бактеријског инокулума).

Корак 2: Формирање биофилма на поклопцу са клиновима

• Поставите поклопац са клиновима:
  Поставите специјализовани поклопац са клиновима на инокулисане бунарчиће, водећи рачуна да клинови буду потпуно уроњени у бактеријску суспензију.
• Инкубирајте плочу:
  Инкубирајте на одговарајућој температури (нпр. 37°C) током одређеног времена (нпр. 24 сата) у статичким условима како бисте омогућили формирање биофилма на клиновима.

Корак 3: Излагање антимикробним агенсима

• Исперите клинове:
  Извадите поклопац са клиновима из бактеријске суспензије и нежно га исперите стерилним физиолошким раствором или PBS-ом како бисте уклонили слабо причвршћене планктонске ћелије.
• Изложите антимикробним агенсима:
  Пренесите поклопац са клиновима у нову плочу са 96 бунарчића која садржи претходно припремљена разблажења антимикробног агенса.
  Инкубирајте током дефинисаног периода (нпр. 24 сата) у статичким условима како бисте омогућили деловање антимикробног агенса на биофилмове.

Корак 4: Соникација соникатором за микроплоче UIP400MTP

Корак соникације је кључан за одвајање биофилмова са поклопаца са клиновима ради процене вијабилности. Пратите ове кораке за соникатор UIP400MTP:

1. Припремите поставку:
   У сваки бунарчић нове плоче са 96 бунарчића сипајте подлогу за опоравак (нпр. неутралишући бујон или стерилну подлогу за раст).
2. Пренесите поклопац са клиновима:
   Уклоните поклопац са клиновима са плоче за третман антимикробним агенсом.
   Исперите поклопац са клиновима стерилним физиолошким раствором или PBS-ом како бисте уклонили преостале антимикробне агенсе.
3. Поставите плочу у соникатор:
   Поставите поклопац са клиновима на плочу са подлогом за опоравак.
   Поставите плочу са подлогом за опоравак у соникатор UIP400MTP, водећи рачуна да плоча буде центрирана и стабилна, како је описано у упутству.
4. Подесите параметре соникације:
   Подесите параметре соникације на уређају UIP400MTP (подешавања се могу прилагодити биофилму):
   Амплитуда: 70–100%.
   Време соникације: 1–3 минута (прилагодите структури биофилма) у цикличном режиму.
5. Извршите соникацију:
   Покрените процес соникације. Ултразвучни таласи ће разорити матрикс биофилма и одвојити ћелије у подлогу за опоравак.
6. Пратите процес:
   Користите прикључиви температурни сензор за праћење температуре узорака у бунарчићима. UIP400MTP се може повезати са лабораторијским расхладним уређајем ради хлађења.
7. Поступање након соникације:
   Одмах пренесите подлогу за опоравак која садржи одвојене биофилмове у нову стерилну плочу ради накнадне анализе.

(A) Плоча која садржи TSB са 2% глукозе, коришћена за формирање биофилма, опоравак ћелија и одређивање MIC и MBEC; (B) Поклопац са клиновима за формирање стафилококних биофилмова.
Ћелије биофилма формираног на клиновима одвојене су соникацијом (Hielscher Ultrasound Technology) током 5 min у плочама са 96 бунарчића које су садржале свежу хранљиву подлогу за опоравак ћелија.
(Слика и студија: ©de Oliveira et al., 2016)

Корак 4: Процена вијабилности

Засејте и култивишите одвојене биофилмове:

1. Припремите серијска разблажења подлоге за опоравак и засејте их на агар ради пребројавања јединица које формирају колоније (CFU).
2. Одредите MIC:
   Одредите MIC као најнижу концентрацију антимикробног средства која потпуно инхибира видљив раст микроорганизама у подлози за опоравак.

MIC – минимална инхибиторна концентрација: Пример микротитарске плоче и тумачење резултата микроразблажења.
(Студија и слика: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Коме користи соникација током MIC тестова?

• Произвођачима медицинских средстава: За испитивање ефикасности површинских премаза и валидацију протокола чишћења средстава склоних формирању биофилма.
• Клиничким микробиолозима: За прецизну дијагностику инфекција повезаних са имплантатима (као што је PJI) издвајањем бактерија са медицинских имплантата и других уграђених средстава.
• Стручњацима за развој фармацеутских производа: За процену делотворности нових антимикробних средстава против отпорних патогена уграђених у биофилм.
• Академским истраживачима: За спровођење репродуктивних истраживања биологије биофилма и механизама антимикробне резистенције уз велики капацитет обраде узорака.
• Тимовима за контролу квалитета у индустрији: За процену биолошког обрастања и ефикасности дезинфекционих средстава у индустријским условима (нпр. применом стандарда ASTM E2799-22).

Пројектовање, производња и консалтинг – квалитет произведен у Немачкој

Ултразвучни уређаји Hielscher познати су по највишим стандардима квалитета и пројектовања. Робусност и једноставно руковање омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних уређаја у индустријска постројења. Соникатори Hielscher лако подносе тешке услове и захтевна окружења.

Hielscher Ultrasonics је компанија са ISO сертификатом и посебан нагласак ставља на ултразвучне уређаје високих перформанси који се одликују најсавременијом технологијом и једноставном употребом. Наравно, ултразвучни уређаји Hielscher усаглашени су са CE захтевима и испуњавају захтеве UL, CSA и RoHs.

Прочитајте овде како се UIP400MTP користи за одвајање биофилма у протоколу ASTM E2799 – испитивање ефикасности дезинфекционих средстава против биофилма Pseudomonas aeruginosa применом MBEC теста.