Протокол за анализу минималне инхибиторне концентрације (МИЦ).

Тест минималне инхибиторне концентрације заснован на биофилму (МИЦ) је суштински метод за процену ефикасности антимикробних агенаса против микроорганизама повезаних са биофилмом, који показују повећану отпорност због свог заштитног екстрацелуларног матрикса. Кључни корак у овом тесту је нарушавање структура биофилма да би се ослободиле уграђене ћелије за тачну процену одрживости. УИП400МТП соникатор плоча са више бунара олакшава овај процес употребом фокусираног ултразвука за генерисање контролисане кавитације, ефикасно одвајајући ћелије биофилма и распршујући их у униформну суспензију. Овај прецизан и поновљив поремећај биофилма повећава поузданост и пропусност МИЦ тестова, чинећи УИП400МТП основним алатом у унапређењу истраживања биофилма.

Соницатион фор Биофилм Детацхмент

МИЦ тест заснован на биофилму обично мери виталност бактерија или инхибицију раста коришћењем метода као што су постављање плоча, бројање колонија или мерење оптичке густине. Соникација је критичан корак у МИЦ тестовима заснованим на биофилму када се процењује антимикробна осетљивост микроорганизама повезаних са биофилмом. Његова примарна функција је да одвоји и распрши ћелије уграђене у матрицу биофилма у униформну суспензију ради тачне анализе.
Биофилмови су знатно отпорнији на антимикробне агенсе у поређењу са планктонским ћелијама, што чини правилно одвајање критичним за тачну анализу. Током овог процеса, ултразвучни таласи стварају контролисану кавитацију, разбијајући матрикс биофилма и ослобађајући уграђене ћелије у униформну суспензију унутар медијума за опоравак. Овај корак омогућава прецизне процене одрживости ћелија диспергованих у биофилму путем метода као што су постављање на плоче, разблаживање и бројање колонија. Правилно прекидање биофилма путем ултразвука спречава заостале компоненте матрикса да штите ћелије, што би иначе могло довести до потцењивања антимикробне активности. Соникатор плоча са више бунара УИП400МТП је посебно погодан за ову сврху, нудећи прецизне и поновљиве услове соникације како би се осигурала поуздана и високо пропусна припрема плоча за анализу.

Зашто је соникација неопходна у тестовима минималне инхибитролне концентрације засноване на биофилму

За мерења виталности и бројање ћелија, потребно је потпуно и поуздано одвајање и дисперзија појединачних ћелија. УИП400МТП промовише униформно, неоштећујуће одвајање биофилма и дисперзију ћелија за робусне резултате теста.

• Сложеност биофилма: Биофилми су структуиране микробне заједнице затворене у матрицу екстрацелуларне полимерне супстанце (ЕПС), која штити микроорганизме и чини их отпорнијим на антимикробне агенсе.
• Уједначена дисперзија: Да би се прецизно измерила одрживост ћелија уграђених у биофилм или њихова осетљивост на антимикробне супстанце, биофилм се прво мора уклонити и разбити у хомогену суспензију.

Протокол теста минималне инхибиторне концентрације заснован на биофилму

Тест минималне инхибиторне концентрације (МИЦ) одређује најнижу концентрацију антимикробног агенса потребну да инхибира видљиви раст микроорганизама. Овај протокол је дизајниран за микроорганизме повезане са биофилмом, користећи УИП400МТП соникатор плоча са више бунара за разбијање биофилма.

Корак 1: Припрема бактеријског инокулума

1. Припремите бактеријску суспензију:
   Узгајати бактерије у одговарајућим медијима до средње логаритамске фазе.
   Разблажите културу да бисте постигли стандардизовану густину ћелија (нпр. 0,5 МцФарланд стандард или ОД600 ~0,1).
2. Припремите антимикробна раствора:
   Разблажите антимикробни агенс у одговарајућем медијуму да бисте створили опсег концентрација (нпр. двострука серијска разблажења).
3. Дозирајте у плочу са 96 бунарчића:
   Додајте антимикробне растворе у бунарчиће стандардне плоче са 96 јажица, са коначном запремином бунара од ~150–200 µЛ.
   Укључити контроле раста (без антимикробних) и контроле стерилитета (без бактеријског инокулума).

Корак 2: Формирање биофилма на поклопцу

• Причврстите поклопац за клин:
  Поставите специјализовани поклопац за клинове на инокулисане јажице, обезбеђујући да су клинови потпуно потопљени у бактеријску суспензију.
• Инкубирајте плочу:
  Инкубирајте на одговарајућој температури (нпр. 37°Ц) у одређеном трајању (нпр. 24 сата) у статичким условима да би се омогућило формирање биофилма на клиновима.

Корак 3: Излагање антимикробним средствима

• Исперите клинове:
  Уклоните поклопац са бактеријске суспензије и нежно исперите стерилним физиолошким раствором или ПБС да бисте уклонили лабаво причвршћене планктонске ћелије.
• Изложите антимикробним средствима:
  Пребаците поклопац са клином у нову плочу са 96 јажица која садржи претходно припремљена антимикробна разблажења.
  Инкубирајте дефинисани период (нпр. 24 сата) у статичким условима да би се омогућило да антимикробни агенс делује на биофилмове.

Корак 4: Соникација са Мицроплате Соницатор УИП400МТП

Корак соникације је критичан за одвајање биофилма са поклопца за клинове да би се проценила одрживост. Следите ове кораке за соникатор УИП400МТП:

1. Припремите подешавање:
   Напуните свежу плочу са 96 бунарчића медијумом за опоравак (нпр. неутрализујућим бујоном или стерилним медијумом за раст) у сваки бунар.
2. Пренесите поклопац клина:
   Уклоните поклопац од клина са плоче за антимикробни третман.
   Исперите поклопац у стерилном физиолошком раствору или ПБС-у да бисте уклонили заостале антимикробне агенсе.
3. Поставите плочу у соникатор:
   Причврстите поклопац за клин на плочу са медијумом за опоравак.
   Поставите плочу са медијумом за опоравак у соникатор УИП400МТП, обезбеђујући да плоча буде центрирана и стабилна као у описаном приручнику.
4. Подесите параметре соникације:
   Подесите параметре соникације на УИП400МТП (поставке се могу прилагодити биофилму):
   Амплитуда: 70–100%.
   Време соникације: 1–3 минута (подесите на основу структуре биофилма) у режиму циклуса.
5. Соницате:
   Започните процес соникације. Ултразвучни таласи ће пореметити матрицу биофилма и избацити ћелије у медијум за опоравак.
6. Пратите процес:
   Користите сензор температуре који се може прикључити да надгледате температуру узорка у бунарима. УИП400МТП се може повезати на лабораторијски расхладни уређај за хлађење.
7. Руковање након ултразвука:
   Одмах пребаците медијум за опоравак који садржи одвојене биофилмове у свежу стерилну плочу за накнадну анализу.

(А) Плоча која садржи ТСБ са 2% глукозе која се користи за формирање биофилма, опоравак ћелија и одређивање МИЦ и МБЕЦ; (Б) Поклопац са иглама за формирање стафилококних биофилма.
Ћелије биофилма формиране на иглицама су уклоњене ултразвучном обрадом (Хиелсцхер Ултрасоунд Тецхнологи) током 5 минута у плочама са 96 јажица које садрже свеж медијум за културу за опоравак ћелија.
(Слика и студија: ©де Оливеира ет ал., 2016)

Корак 4: Процена одрживости

Биофилмови одвојени од плоче и културе:

1. Извршите серијска разблажења медијума за опоравак и плоче на агар да бисте набројали јединице које формирају колоније (ЦФУ).
2. Оцените МИЦ:
   Одредите МИЦ као најнижу антимикробну концентрацију која потпуно инхибира видљиви раст микроба у медијуму за опоравак.

Минимална инхибициона концентрација МИЦ: Пример микротитарске плоче и интерпретација резултата микроразблаживања.
(Студија и слика: ©Јаскиевицз ет ал. 2019)

Дизајн, производња и консалтинг – Квалитет Маде ин Германи

Хиелсцхер ултрасоникатори су познати по свом највишем квалитету и стандардима дизајна. Робусност и једноставан рад омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних апарата у индустријске објекте. Хиелсцхер соникатори се лако носе са тешким условима и захтевним окружењем.

Хиелсцхер Ултрасоницс је ИСО сертификована компанија и ставља посебан нагласак на ултрасоникаторе високих перформанси са најсавременијом технологијом и једноставношћу за коришћење. Наравно, Хиелсцхер ултрасоникатори су усаглашени са ЦЕ и испуњавају захтеве УЛ, ЦСА и РоХ.

Прочитајте овде како се УИП400МТП користи за одвајање биофилма у АСТМ Е2799 протоколу – Тестирање ефикасности дезинфекционог средства против биофилма Псеудомонас аеругиноса помоћу МБЕЦ теста.