სიმსივნური ქსოვილიდან სონიკაციით დახმარებული ცილის ექსტრაქცია – ოქმი

ეს პროტოკოლი აღწერს სიმსივნური ქსოვილისთვის ულტრაბგერითი მეთოდით ცილის ექსტრაქციის მეთოდს, რომელიც აუმჯობესებს CPTAC შარდოვანას ლიზისის სტანდარტულ სამუშაო პროცესს ქსოვილის დაშლის დროს კონტროლირებადი ზონდით-ულტრაბგერითი ეტაპის დამატებით. CPTAC პროტეომისა და ფოსფოპროტეომის მომზადების დამკვიდრებულ ღრმა მასშტაბის სტრატეგიაზე დაყრდნობით, ეს მოდიფიკაცია აუმჯობესებს უჯრედულ და უჯრედქვეშა სტრუქტურის დარღვევას, ამცირებს ნიმუშის სიბლანტეს და აძლიერებს იმ ცილების გამოთავისუფლებას, რომელთა აღდგენა, როგორც წესი, უფრო რთულია მხოლოდ შარდოვანას ლიზისით, განსაკუთრებით მემბრანასთან დაკავშირებული და დნმ-შემაკავშირებელი ან ბირთვთან ასოცირებული ცილების. ძირითად კვლევაში, ულტრაბგერითი მეთოდით ჩატარებულმა სამუშაო პროცესმა გაზარდა როგორც ცილების, ასევე ფოსფოპეპტიდების აღმოჩენა, ამავდროულად ინარჩუნებდა თავსებადობას CPTAC სტილის დაშლის, TMT მარკირების, ფრაქციონირების, ფოსფოპეპტიდების გამდიდრების და LC-MS/MS ანალიზის მილსადენთან.

სონიკაციით დახმარებული ცილის ექსტრაქცია სიმსივნური ქსოვილიდან ღრმა პროტეომიკური და ფოსფოპროტეომიკური ანალიზისთვის

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

პროტოკოლის გამოყენების სფერო

გამოიყენეთ ეს პროცედურა შემდეგი მიზნებისთვის:

• ახლად გაყინული, კრიოპულვერიზებული სიმსივნური ქსოვილი
• უჯრედის გრანულები ან სხვა ბიოლოგიური ნიმუშები, სადაც შარდოვანაზე დაფუძნებული ექსტრაქცია უკვე დადგენილია
• გლობალური პროტეომიკისა და ფოსფოპროტეომიკის სამუშაო პროცესები ტრიპსული მონელების და სურვილისამებრ TMT მარკირების გამოყენებით

ლი და სხვების (2025) კვლევაში ნათქვამია, რომ სამუშაო პროცესი ასევე გამოიყენება სხვა ტიპის ნიმუშებისთვის, როგორიცაა უჯრედული ხაზები, სისხლი და შარდი, თუმცა, შესაძლოა, ოპტიმიზაცია საჭირო გახდეს ნიმუშის ტიპის მიხედვით.

ოპტიმიზებული ნიმუშის მომზადების სამუშაო პროცესი დანერგილი ულტრაბგერითი მეთოდით. ოპტიმიზებული სამუშაო პროცესი და ექსპერიმენტული დიზაინი ეფუძნება CPTAC ნიმუშის მომზადების პროტოკოლს გლობალური პროტეომიკური და ფოსფოპროტეომიკური ანალიზისთვის.
კვლევა და სქემა: ©ლი და სხვ., 2025

მუშაობის პრინციპი

თავდაპირველმა კვლევამ CPTAC შარდოვანას ლიზისის სტანდარტულ სამუშაო პროცესს დაამატა ულტრაბგერითი გამოსხივება და აჩვენა მემბრანებთან და ბირთვებთან დაკავშირებული ცილების გაუმჯობესებული აღმოჩენა. ავტორები აცხადებენ, რომ ულტრაბგერითი გამოსხივების პარამეტრები უნდა იყოს დაზუსტებული ნიმუშის ზომის/კონცენტრაციის მიხედვით. – სონოტროდის ზომის, ენერგიის შეყვანისა და პულსის დროის არჩევით.

მაგალითად, Hielscher UP200Ht და UP200St-ისთვის, ეს ნიშნავს:

• გამოიყენეთ ამპლიტუდა და პულსის რეჟიმი, როგორც ძირითადი საკონტროლო ცვლადები
• შეინახეთ ნიმუშები ცივად მთელი პროცესის განმავლობაში (მაგ., ყინულზე)
• დაიწყეთ კონსერვატიული პარამეტრებით
• ოპტიმიზაცია ნიმუშის გამჭვირვალობის, ტემპერატურის, ცილის მოსავლიანობისა და შემდგომი პეპტიდის ხარისხის მიხედვით

 
Hielscher-ის 200 ვატიანი სონიკატორის ორივე მოდელი UP200Ht და UP200St განკუთვნილია მცირე და საშუალო ნიმუშის მოცულობებისთვის, რეგულირებადი ამპლიტუდისა და პულსის პარამეტრებით; ორივე ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი უზრუნველყოფს ციფრულ სენსორულ ეკრანის კონტროლს ზუსტი პარამეტრის რეგულირებისთვის, მონაცემთა ავტომატური ჩაწერისთვის, შესაერთებელი ტემპერატურის სენსორისთვის, დისტანციური მართვისთვის, ნიმუშის განათებისთვის.
 

სონიკაციით დახმარებული ცილის ექსტრაქციის რეაგენტები

შარდოვანას ლიზისის ბუფერი

გამოყენებამდე დაუყოვნებლივ მოამზადეთ ახალი:

• 8 M შარდოვანა
• 75 მმ NaCl
• 50 მმ ტრისი, pH 8.0
• 1 მმ EDTA
• 2 მკგ/მლ აპროტინინი
• 10 მკგ/მლ ლეიპეპტინი
• 1 მმ PMSF
• 10 მმ NaF
• 20 µM PUGNAc
• ფოსფატაზას ინჰიბიტორის კოქტეილი 2, 1:100 (v/v)
• ფოსფატაზას ინჰიბიტორის კოქტეილი 3, 1:100 (v/v)

შარდოვანა მთლიანად უნდა გაიხსნას დანამატების დამატებამდე; ინჰიბიტორები უნდა დაემატოს გამოყენებამდე დაუყოვნებლივ; ბუფერი უნდა შეინახოს ყინულზე; დანამატების დამატების შემდეგ რეკომენდებულია მორევა ენერგიული მორევის ნაცვლად.
 

დამატებითი რეაგენტები:

• BCA ცილის ანალიზის რეაგენტები
• 50 მმ ტრის-HCl, pH 8.0
• ციფრული ტელევიზია
• იოდოაცეტამიდი
• LysC
• ტრიპსინი
• ჭიანჭველმჟავა
• TMT რეაგენტები, თუ გამოიყენება მულტიპლექსირებული რაოდენობრივი პროტეომიკა
• IMAC რეაგენტები, თუ ფოსფოპეპტიდების გამდიდრებას ახორციელებენ

სონიკაციით დახმარებული ცილის ექსტრაქციის აღჭურვილობა

სავალდებულო

რეკომენდებული ზონდის შერჩევა

დაახლოებით 200–1000 µL ნიმუშებისთვის გამოიყენეთ მცირე დიამეტრის სონოტროდი, რომელიც შესაფერისია მცირე მოცულობის პირდაპირი მაღალი ინტენსივობის დამუშავებისთვის. Hielscher გთავაზობთ სონოტროდის მრავალ დიამეტრს, ხოლო მცირე წვერის დიამეტრი უზრუნველყოფს უფრო მაღალ ინტენსივობას წვერის არეში.

პრაქტიკული შენიშვნა: გამოიყენეთ ყველაზე პატარა ზონდი, რომელიც უზრუნველყოფს ეფექტურ შერევას ზედმეტი ქაფის წარმოქმნის ან ჭურჭლის კედელთან შეხების გარეშე.

თუ ერთდროულად რამდენიმე ნიმუშთან მუშაობთ, შეგიძლიათ განიხილოთ მრავალმილის სონიკატორის ფლაკონი ტვიტერი ან მიკროპლატე სონიკატორი UIP400MTP!

ეტაპობრივი ინსტრუქციები: სონიკაციით დახმარებული ცილის ექსტრაქციის პროცედურა

ა. წინასწარ გაგრილება და მომზადება

1. ცენტრიფუგა გააგრილეთ 4°C-მდე.
2. მოამზადეთ ახალი შარდოვანას ლიზისის ბუფერი და შეინახეთ ყინულზე.
3. დააყენეთ UP200ःt ან UP200St სადგამზე ხმის კორპუსის შიგნით.
4. მოამზადეთ ყინულის აბაზანა, რომელიც საკმარისად დიდია ნიმუშის მილების ვერტიკალურად და სტაბილურად დასაფიქსირებლად.

ახალი ბუფერის მომზადება და ცივი დამუშავება კრიტიკულად მნიშვნელოვანია.

B. შარდოვანას საწყისი ექსტრაქცია

1. კრიოპულვერიზებული ქსოვილი ყინულზე შეინახეთ.
2. დაამატეთ 200 µლ გაცივებული შარდოვანას ლიზისის ბუფერი ყოველ 50 მგ სველ ქსოვილზე.
3. მაღალი სიჩქარით 5–10 წამის განმავლობაში მორევი.
4. ინკუბაცია 15 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე.
5. კიდევ ერთხელ გაიმეორეთ ვორტექს-პლუს-ინკუბაციის ნაბიჯი.
6. ცენტრიფუგირება 20,000 გ-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე.
7. ლიზატი/სუპერნატანტი გადაიტანეთ სუფთა, დაბალი შეკავშირების მქონე მილში.

C. ულტრაბგერითი გამოსხივება UP200Ht ან UP200St გამოყენებით

სონიკაციის საწყისი პირობები

• ამპლიტუდა: იწყება 20–30%-დან
• პულსის ხანგრძლივობა: 5 წმ ჩართულია
• გაგრილება: 2 წუთი ყინულზე იმპულსებს შორის
• ციკლების რაოდენობა: 4 ციკლი
• სულ აქტიური sonication დრო: 20 წმ
• პროცესის საერთო დრო გაგრილების ჩათვლით: დაახლოებით 8-10 წუთი

სონიკაციის საფეხურები

1. ლიზატი გადაიტანეთ ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის შესაფერის მილში. გამოიყენეთ ვიწრო, თხელკედლიანი მილი, რომელიც უზრუნველყოფს კარგ სითბოს გაცვლას და ზონდში უსაფრთხო ჩაძირვას.
2. მოათავსეთ მილი ყინულის აბაზანაში. ნაშრომში ულტრაბგერითი ზემოქმედების თავიდან ასაცილებლად კრიტიკულად მნიშვნელოვანია გაგრილება ულტრაბგერითი ზემოქმედების დროს.
3. ჩაუშვით ზონდის წვერი ნიმუშში. სტაბილური კავიტაციისთვის წვერი საკმარისად ჩაძირული გქონდეთ, მაგრამ არ დაუშვათ, რომ ის მილის კედელს ან ძირს შეეხოს.
4. გაუშვით ერთი 5 წამიანი იმპულსი საწყის ამპლიტუდაზე.
5. დაუყოვნებლივ დააბრუნეთ ნიმუში სრულად ყინულში 2 წუთის განმავლობაში.
6. გაიმეორეთ 4 ციკლის დასრულებამდე.
7. ციკლის შემდეგ შეამოწმეთ ლიზატი.
8. გააგრძელეთ მხოლოდ საჭიროების შემთხვევაში, ერთდროულად ერთი დამატებითი 5-წამიანი იმპულსის გამოყენებით, რასაც ყოველთვის მოჰყვება სრული გაგრილება.
9. შეწყვიტეთ ლიზატის უფრო ერთგვაროვანი და ნაკლებად ბოჭკოვანი/ბლანტიანი ფორმის მიღების შემდეგ.
   ბოლო წერტილი უფრო გამჭვირვალე ლიზატია, რომელიც უწყვეტი ბლანტი ნაკადის ნაცვლად წვეთებს წარმოქმნის.
10. ცენტრიფუგირება მოახდინეთ დაახლოებით 16,000 გ-ზე 15 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე.
11. გასუფთავებული ზედაპირი გადაიტანეთ ახალ მილში და გაზომეთ ცილის კონცენტრაცია.

გლობალური პროტეომიკისა და ფოსფოპროტეომიკის შედარება ულტრაბგერით და არაულტრაბგერით ნიმუშებს შორის.
ა. იდენტიფიცირებული ცილების რაოდენობა (გლობალური პროტეომიკა) ყველა PDX სიმსივნურ ქსოვილში ულტრაბგერითი დამუშავებით ან მის გარეშე. ბ. იდენტიფიცირებული ფოსფოპეპტიდების რაოდენობა (IMAC გამდიდრება) ყველა PDX სიმსივნურ ქსოვილში ულტრაბგერითი დამუშავებით ან მის გარეშე. დაითვალა მხოლოდ ის ცილები და ფოსფოპეპტიდები, რომელთა სიმრავლის კოეფიციენტი მეტია ან ტოლია 25-ე პროცენტილისა. სიმრავლის კოეფიციენტი გამოითვალა ერთი და იგივე ტიპის ნიმუშებს შორის.
კვლევა და გრაფიკები: ©ლი და სხვ., 2025

ქვედა დინების მონელება და ანალიზი

ულტრაბგერითი დამუშავებისა და გასუფთავების შემდეგ, გააგრძელეთ ისე, როგორც აღწერილია CPTAC-ის სტილის ორიგინალურ სამუშაო პროცესში:

1. ლიზატი 1:3 (v/v) გააზავეთ 50 mM Tris-HCl-ით pH 8.0-მდე შარდოვანას აღსადგენად. <2 M.
2. დაამატეთ LysC 1 mAU 50 მკგ ცილაზე და ინკუბაცია გააგრძელეთ 2 საათის განმავლობაში 25°C ტემპერატურაზე.
3. დაამატეთ ტრიფსინი 1:49 ფერმენტი:სუბსტრატი (w/w) პროპორციით და დაიჯესტეთ მთელი ღამით 25°C ტემპერატურაზე.
4. ჭიანჭველმჟავით დააქრეთ საბოლოო კონცენტრაციამდე 1%-მდე.
5. საჭიროებისამებრ, გააგრძელეთ მარილის გამოყოფა, TMT მარკირება, ფრაქციონიზაცია, ფოსფოპეპტიდებით გამდიდრება და LC-MS/MS.

ფოსფოპეპტიდების დიფერენციალური ექსპრესია TMT-მონიშნული MS-დან.
ა. ბაზალური ქვეტიპი, რომელიც გამოყოფს ადამიანის ზოგიერთ ფოსფოპეპტიდს (ცილის თანმიმდევრობის დასაწყისი და დასასრული), რომლებიც ულტრა-რეგულირებულ ნიმუშებში არასონიფიცირებულ ნიმუშებთან შედარებით მაღლა არის აწეული. ბ. სანათურის ქვეტიპი, რომელიც გამოყოფს ადამიანის ზოგიერთ ფოსფოპეპტიდს (ცილის თანმიმდევრობის დასაწყისი და დასასრული), რომლებიც ულტრა-რეგულირებულ ნიმუშებში არასონიფიცირებულ ნიმუშებთან შედარებით მაღლა არის აწეული. გ. გამდიდრებული KEGG გზები, რომლებიც დაფუძნებულია სიმსივნეების ულტრა-რეგულირებულ ბაზალურ ქვეტიპში ულტრა-რეგულირებული ფოსფოპეპტიდების ცილებზე. დ. გამდიდრებული KEGG გზები, რომლებიც დაფუძნებულია სიმსივნეების ულტრა-რეგულირებულ ქვეტიპში ულტრა-რეგულირებული ფოსფოპეპტიდების ცილებზე.
კვლევა და გრაფიკები: ©ლი და სხვ., 2025

დიზაინი, წარმოება და კონსულტაცია – ხარისხი დამზადებულია გერმანიაში

Hielscher ულტრაბგერითები ცნობილია მათი უმაღლესი ხარისხისა და დიზაინის სტანდარტებით. გამძლეობა და მარტივი მუშაობა საშუალებას იძლევა ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების გლუვი ინტეგრაცია სამრეწველო ობიექტებში. უხეში პირობები და მომთხოვნი გარემო ადვილად უმკლავდება Hielscher ულტრაბგერითებს.

Hielscher Ultrasonics არის ISO სერთიფიცირებული კომპანია და განსაკუთრებული აქცენტი კეთდება მაღალი ხარისხის ულტრაბგერაზე, რომელიც აღჭურვილია უახლესი ტექნოლოგიით და მომხმარებლის კეთილგანწყობით. რა თქმა უნდა, Hielscher ულტრაბგერითები შეესაბამება CE და აკმაყოფილებს UL, CSA და RoHs მოთხოვნებს.

ლიტერატურა / ლიტერატურა