ულტრაბგერითი დამუშავებით სიმსივნური ქსოვილიდან ცილების ექსტრაქცია – პროტოკოლი

ეს პროტოკოლი აღწერს ულტრაბგერითი დამუშავებით სიმსივნური ქსოვილიდან ცილების ექსტრაქციის მეთოდს, რომელიც აუმჯობესებს სტანდარტულ CPTAC შარდოვანას ლიზის სამუშაო ნაკადს ქსოვილის დისრუფციის დროს კონტროლირებადი პრობ-ულტრაბგერითი დამუშავების ეტაპის დამატებით. დაფუძნებული დამკვიდრებულ ღრმა დონის CPTAC პროტეომისა და ფოსფოპროტეომის მომზადების სტრატეგიაზე, ეს მოდიფიკაცია აუმჯობესებს უჯრედული და უჯრედქვეშა სტრუქტურების დისრუფციას, ამცირებს ნიმუშის სიბლანტეს და ზრდის იმ ცილების გამოყოფას, რომელთა აღდგენაც ჩვეულებრივ უფრო რთულია მხოლოდ შარდოვანას ლიზით, განსაკუთრებით მემბრანასთან დაკავშირებული და დნმ-თან დაკავშირებული ან ბირთვთან ასოცირებული ცილებისა. საბაზისო კვლევაში, ულტრაბგერითი დამუშავებით გაუმჯობესებულმა სამუშაო ნაკადმა გაზარდა როგორც ცილების, ისე ფოსფოპეპტიდების დეტექცია და შეინარჩუნა თავსებადობა შემდგომ CPTAC-ის ტიპის ჰიდროლიზთან, TMT მარკირებასთან, ფრაქციონირებასთან, ფოსფოპეპტიდების გამდიდრებასთან და LC-MS/MS ანალიზის სამუშაო ნაკადთან.

ულტრაბგერითი დამუშავებით სიმსივნური ქსოვილიდან ცილების ექსტრაქცია ღრმა პროტეომული და ფოსფოპროტეომული ანალიზისთვის

შემდეგი პროტოკოლი ოპტიმიზებულია ცილების ექსტრაქციისთვის კრიოფაქცეული ცხიმოვანი ქსოვილიდან 8 M შარდოვანას ლიზის ბუფერში: დამატებული პრობ-ტიპის ულტრაბგერითი დამუშავების ეტაპი აუმჯობესებს რთული ცილოვანი კლასების აღდგენას, განსაკუთრებით მემბრანასთან დაკავშირებული და დნმ-/ბირთვთან ასოცირებული ცილების, ჰიდროლიზამდე და შემდგომი LC-MS/MS ანალიზამდე. საბაზისო კვლევაში Li et al. (2025), ულტრაბგერითი დამუშავების დამატება ზრდიდა მემბრანასა და ბირთვთან ასოცირებული ცილების დეტექციას და უზრუნველყოფდა ღრმა დონის დაფარვას >12 000 ცილისა და >25 000 ფოსფოპეპტიდის მათი სამუშაო ნაკადის ფარგლებში.

პროტოკოლის გამოყენების სფერო

გამოიყენეთ ეს პროცედურა შემდეგისთვის:

• ახალი გაყინული, კრიოფაქცეული სიმსივნური ქსოვილი
• უჯრედული ნალექი ან სხვა ბიოლოგიური სპეციმენები, სადაც შარდოვანაზე დაფუძნებული ექსტრაქცია უკვე დამკვიდრებულია
• გლობალური პროტეომიკისა და ფოსფოპროტეომიკის სამუშაო ნაკადები ტრიფსინული ჰიდროლიზისა და სურვილისამებრ TMT მარკირების გამოყენებით

Li et al. (2025)-ის კვლევაში ნათქვამია, რომ სამუშაო ნაკადი ასევე გამოიყენება სხვა ტიპის სპეციმენებისთვის, როგორიცაა უჯრედული ხაზები, სისხლი და შარდი, თუმცა ოპტიმიზაცია შესაძლოა საჭირო იყოს ნიმუშის ტიპის მიხედვით.

ოპტიმიზებული ნიმუშის მომზადების სამუშაო ნაკადი დამატებული ულტრაბგერითი დამუშავების ეტაპით. ოპტიმიზებული სამუშაო ნაკადი და ექსპერიმენტული დიზაინი ეფუძნება CPTAC ნიმუშის მომზადების პროტოკოლს გლობალური პროტეომული და ფოსფოპროტეომული ანალიზისთვის.
კვლევა და სქემა: ©Li et al., 2025

მუშაობის პრინციპი

ორიგინალურ კვლევაში ულტრაბგერითი დამუშავება დაემატა სტანდარტულ CPTAC შარდოვანას ლიზის სამუშაო ნაკადს და აღინიშნა მემბრანებთან და ბირთვებთან ასოცირებული ცილების დეტექციის გაუმჯობესება. ავტორები ამბობენ, რომ ულტრაბგერითი დამუშავების პარამეტრები უნდა იყოს დახვეწილი ნიმუშის ზომის/კონცენტრაციის შესაბამისად – სონოტროდის ზომის, ენერგიის შეყვანისა და პულსის დროის შერჩევით.

მაგალითად, Hielscher UP200Ht და UP200St-ისთვის ეს ნიშნავს:

• გამოიყენეთ ამპლიტუდა და პულსის რეჟიმი როგორც მთავარი კონტროლის ცვლადები
• შეინარჩუნეთ ნიმუშები მთელი დროის განმავლობაში ცივად (ანუ ყინულზე)
• დაიწყეთ კონსერვატიული პარამეტრებით
• ოპტიმიზაცია ჩატარდეს ნიმუშის გამჭვირვალობის, ტემპერატურის, ცილოვანი გამოსავლიანობისა და შემდგომი პეპტიდური ხარისხის მიხედვით

ორივე Hielscher 200 ვატიანი ულტრაბგერითი მოდელი UP200Ht და UP200St განკუთვნილია მცირე და საშუალო ნიმუშის მოცულობებისთვის, რეგულირებადი ამპლიტუდისა და პულსის პარამეტრებით; ორივე ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი უზრუნველყოფს ციფრულ სენსორულ ეკრანზე მართვას პარამეტრების ზუსტი კორექციისთვის, ავტომატურ მონაცემთა ჩაწერას, ჩასართავ ტემპერატურულ სენსორს, დისტანციურ მართვას და ნიმუშის განათებას.

რეაგენტები ულტრაბგერითი დამუშავებით ცილების ექსტრაქციისთვის

შარდოვანას ლიზის ბუფერი

მოამზადეთ ახალი გამოყენებამდე პირდაპირ:

• 8 M შარდოვანა
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL აპროტინინი
• 10 µg/mL ლეუპეპტინი
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• ფოსფატაზის ინჰიბიტორების კოქტეილი 2, 1:100 (v/v)
• ფოსფატაზის ინჰიბიტორების კოქტეილი 3, 1:100 (v/v)

შარდოვანა უნდა იყოს სრულად გახსნილი დამატებების შეყვანამდე; ინჰიბიტორები უნდა დაემატოს გამოყენებამდე პირდაპირ; ბუფერი უნდა ინახებოდეს ყინულზე; და დამატებების შეყვანის შემდეგ რეკომენდებულია მსუბუქი შერევა მძიმე ვორტექსირების ნაცვლად.
 

დამატებითი რეაგენტები:

• BCA ცილოვანი ანალიზის რეაგენტები
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• იოდაცეტამიდი
• LysC
• ტრიფსინი
• ჭიანჭველმჟავა
• TMT რეაგენტები, თუ გამოიყენება მულტიპლექსური რაოდენობრივი პროტეომიკა
• IMAC რეაგენტები, თუ ხორციელდება ფოსფოპეპტიდების გამდიდრება

ულტრაბგერითი დამუშავებით ცილების ექსტრაქციისთვის საჭირო აღჭურვილობა

საჭირო

რეკომენდებული ზონდის შერჩევა

დაახლოებით 200–1000 µL მოცულობის ნიმუშებისთვის, გამოიყენეთ მცირე დიამეტრის სონოტროდი, რომელიც შესაფერისია მცირე მოცულობების პირდაპირი ინტენსიური დამუშავებისთვის. Hielscher გთავაზობთ სონოტროდების მრავალ დიამეტრს, და წვერის მცირე დიამეტრები უზრუნველყოფენ უფრო მაღალ ინტენსივობას წვერზე.

პრაქტიკული შენიშვნა: გამოიყენეთ უმცირესი ზონდი, რომელიც უზრუნველყოფს ეფექტურ შერევას ზედმეტი ქაფის ან ჭურჭლის კედელთან კონტაქტის გარეშე.

თუ თქვენ მუშაობთ მრავალ ნიმუშთან ერთდროულად, შეგიძლიათ განიხილოთ მრავალჭურჭლიანი ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი VialTweeter ან მიკროპლატის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი UIP400MTP!

ნაბიჯ-ნაბიჯ ინსტრუქციები: ულტრაბგერითი დამუშავებით ცილების ექსტრაქციის პროცედურა

A. წინასწარი გაციება და მომზადება

1. გააცივეთ ცენტრიფუგა 4°C-მდე.
2. მოამზადეთ ახალი შარდოვანას ლიზის ბუფერი და შეინახეთ ყინულზე.
3. დააყენეთ UP200Ht ან UP200St სტენდზე ხმის იზოლაციის კაბინაში.
4. მოამზადეთ ყინულის აბაზანა, რომელიც საკმარისად დიდია ნიმუშების ჭურჭლის ვერტიკალურად და მდგრადად შესანახად.

ახალი ბუფერის მომზადება და გაციებული დამუშავება კრიტიკულია.

B. საწყისი შარდოვანას ექსტრაქცია

1. შეინახეთ კრიოფაქცეული ქსოვილი ყინულზე.
2. დაუმატეთ 200 µL გაციებული შარდოვანას ლიზის ბუფერი თითო 50 mg სველ ქსოვილზე.
3. ვორტექსური შერევა 5–10 წმ მაღალ სიჩქარეზე.
4. ინკუბაცია 15 წთ 4°C-ზე.
5. გაიმეორეთ ვორტექსური შერევა-ინკუბაციის ნაბიჯი კიდევ ერთხელ.
6. ცენტრიფუგირება 20 000g-ზე 10 წთ 4°C-ზე.
7. გადაიტანეთ ლიზატი/ზედნაფენი სუფთა დაბალი შეკავების ჭურჭელში.

C. ულტრაბგერითი დამუშავება UP200Ht ან UP200St-ის გამოყენებით

ულტრაბგერითი დამუშავების საწყისი პირობები

• ამპლიტუდა: დაიწყეთ 20–30%-ზე
• იმპულსის სიგრძე: 5 წმ ჩართული
• გაციება: 2 წთ ყინულზე იმპულსებს შორის
• ციკლების რაოდენობა: 4 ციკლი
• ულტრაბგერითი დამუშავების აქტიური დრო სულ: 20 წმ
• პროცესის დრო სულ, გაციების ჩათვლით: დაახლოებით 8–10 წთ

ულტრაბგერითი დამუშავების ნაბიჯები

1. გადაიტანეთ ლიზატი ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის შესაფერის ჭურჭელში. გამოიყენეთ ვიწრო, თხელკედლიანი ჭურჭელი, რომელიც საშუალებას აძლევს კარგ სითბოგაცვლას და ზონდის უსაფრთხო ჩაძირვას.
2. მოათავსეთ ჭურჭელი ყინულის აბაზანაში. სტატიაში მითითებულია, რომ გაციება ულტრაბგერითი დამუშავების დროს კრიტიკულია სითბური დაზიანების თავიდან ასაცილებლად.
3. ჩააძირეთ ზონდის წვერი ნიმუშში. შეინარჩუნეთ წვერი საკმარისად ჩაძირული სტაბილური კავიტაციისთვის, მაგრამ არ დაუშვათ მისი კონტაქტი ჭურჭლის კედელთან ან ფსკერთან.
4. გაუშვით ერთი 5 წმ იმპულსი საწყის ამპლიტუდაზე.
5. მყისვე დააბრუნეთ ნიმუში სრულად ყინულზე 2 წთ-ის განმავლობაში.
6. გაიმეორეთ სანამ არ დასრულდება 4 ციკლი.
7. შეამოწმეთ ლიზატი ციკლის შემდეგ.
8. გააგრძელეთ მხოლოდ საჭიროების შემთხვევაში, გამოიყენეთ ერთი დამატებითი 5 წმ იმპულსი ერთდროულად, ყოველთვის სრული გაციებით.
9. შეწყვიტეთ, როდესაც ლიზატი გახდება უფრო ერთგვაროვანი და ნაკლებად წებოვანი/სქელი.
   საბოლოო წერტილი არის უფრო გამჭვირვალე ლიზატი, რომელიც წარმოქმნის წვეთებს უწყვეტი სქელი ნაკადის ნაცვლად.
10. ცენტრიფუგირება დაახლოებით 16 000g-ზე 15 წთ 4°C-ზე.
11. გადაიტანეთ გასუფთავებული ზედნაფენი ახალ ჭურჭელში და გაზომეთ ცილის კონცენტრაცია.

გლობალური პროტეომიკისა და ფოსფოპროტეომიკის შედარება ულტრაბგერითი დამუშავებულ და არადამუშავებულ ნიმუშებს შორის.
ა. იდენტიფიცირებული ცილების რაოდენობა (გლობალური პროტეომიკა) ყველა PDX სიმსივნის ქსოვილში ულტრაბგერითი დამუშავებით ან მის გარეშე. ბ. იდენტიფიცირებული ფოსფოპეპტიდების რაოდენობა (IMAC გამდიდრება) ყველა PDX სიმსივნის ქსოვილში ულტრაბგერითი დამუშავებით ან მის გარეშე. დათვლილი იქნა მხოლოდ ის ცილები და ფოსფოპეპტიდები, რომელთა სიუხვის შეფარდება მეტი ან ტოლია 25-ე პროცენტილისა. სიუხვის შეფარდება გამოთვლილი იქნა იმავე ტიპის ნიმუშებს შორის.
კვლევა და გრაფიკები: ©Li et al., 2025

შემდგომი ჰიდროლიზი და ანალიზი

ულტრაბგერითი დამუშავებისა და გასუფთავების შემდეგ, გააგრძელეთ ორიგინალური CPTAC-ის ტიპის სამუშაო ნაკადის შესაბამისად:

1. გაათხელეთ ლიზატი 1:3 (v/v) 50 mM Tris-HCl pH 8,0-ით შარდოვანას <2 M-მდე შესამცირებლად.
2. დაუმატეთ LysC 1 mAU თითო 50 µg ცილაზე და ინკუბაცია 2 სთ 25°C-ზე.
3. დაუმატეთ ტრიფსინი 1:49 ფერმენტი:სუბსტრატი (w/w) და ჰიდროლიზი ღამით 25°C-ზე.
4. შეაჩერეთ ჭიანჭველმჟავით 1% საბოლოო კონცენტრაციამდე.
5. გააგრძელეთ მარილმოცილება, TMT მარკირება, ფრაქციონირება, ფოსფოპეპტიდების გამდიდრება და LC-MS/MS ანალიზი საჭიროებისამებრ.

ფოსფოპეპტიდების დიფერენციალური ექსპრესია TMT-მარკირებული MS-დან.
a. ბაზალური ქვეტიპი, რომელიც გამოყოფს ზოგიერთ ადამიანის ფოსფოპეპტიდს (ცილის_სეკვენციის დასაწყისი და დასასრული), რომელიც ულტრაბგერითი დამუშავების მქონე ნიმუშებში ზემოდან რეგულირდება ულტრაბგერითი დამუშავების გარეშე მქონე ნიმუშებთან შედარებით. b. ლუმინალური ქვეტიპი, რომელიც გამოყოფს ზოგიერთ ადამიანის ფოსფოპეპტიდს (ცილის_სეკვენციის დასაწყისი და დასასრული), რომელიც ულტრაბგერითი დამუშავების მქონე ნიმუშებში ზემოდან რეგულირდება ულტრაბგერითი დამუშავების გარეშე მქონე ნიმუშებთან შედარებით. c. გამდიდრებული KEGG გზები, რომლებიც დაფუძნებულია ულტრაბგერითი დამუშავების მქონე სიმსივნეების ბაზალური ქვეტიპში ზემოდან რეგულირებული ფოსფოპეპტიდების ცილებზე. d. გამდიდრებული KEGG გზები, რომლებიც დაფუძნებულია ულტრაბგერითი დამუშავების მქონე სიმსივნეების ლუმინალური ქვეტიპში ზემოდან რეგულირებული ფოსფოპეპტიდების ცილებზე.
კვლევა და გრაფიკები: ©Li et al., 2025

პროექტირება, წარმოება და კონსულტირება – გერმანიაში შექმნილი ხარისხი

Hielscher-ის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები ცნობილია უმაღლესი ხარისხითა და დიზაინის სტანდარტებით. გამძლეობა და მარტივი ექსპლუატაცია უზრუნველყოფს ჩვენი ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების შეუფერხებელ ინტეგრაციას სამრეწველო ობიექტებში. Hielscher-ის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები ადვილად უმკლავდება მკაცრ პირობებსა და რთულ სამუშაო გარემოს.

Hielscher Ultrasonics არის ISO სერტიფიცირებული კომპანია, რომელიც განსაკუთრებულ მნიშვნელობას ანიჭებს მაღალეფექტურ ულტრაბგერით ჰომოგენიზატორებს, რომლებიც აღჭურვილია თანამედროვე ტექნოლოგიებით და მომხმარებლისთვის მოსახერხებელია. რა თქმა უნდა, Hielscher ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები შეესაბამება CE სტანდარტებს და აკმაყოფილებენ UL, CSA და RoHs მოთხოვნებს.

ლიტერატურა / რეფერენსები

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.