C. Elegans-ის ნიმუშების ულტრაბგერითი მომზადება

C. elegans, ნემატოდური ჭია, არის ფართოდ გამოყენებული სამოდელო ორგანიზმი ბიოლოგიაში. ნიმუშის მომზადება ანალიზამდე მოითხოვს ლიზისს, ცილების და ლიპიდების ექსტრაქციას, ასევე რნმ-ის ფრაგმენტაციას, რაც შეიძლება საიმედოდ განხორციელდეს სონიკაციის გზით. ულტრაბგერითი უჯრედების დამრღვევები საიმედო, დახვეწილი და ადვილად გამოსაყენებელი მოწყობილობებია C. elegans-ის ნიმუშების სწრაფი მომზადებისთვის.

C. Elegans-ის ნიმუშების ულტრაბგერითი მომზადება

C. elegans არის მრგვალი ჭიები, რომლებიც ფართოდ გამოიყენება კვლევით ლაბორატორიებში გენომიკის, განვითარების ბიოლოგიისა და დაავადებების გამოსაკვლევად. C. elegans-ის გენომის ბევრ გენს აქვს ადამიანებში ფუნქციური ანალოგი. ამრიგად, ნემატოდური ჭია უაღრესად სასარგებლო მოდელია ადამიანის დაავადებებისათვის. C. elegans-ის ფართო გამოყენების სხვა უპირატესობებია მისი მარტივი და იაფი კულტივაცია ბაქტერიების შემცველ თეფშებზე (მაგ. E. coli), მისი გამჭვირვალობა, მოსახერხებელი დამუშავება, აგრეთვე ჭიების გაყინვისა და შენახვის შესაძლებლობა.
ცილების და ლიპიდების ანალიზი რეგულარული პროცედურებია ლაბორატორიებში და ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება არის დამკვიდრებული მეთოდი C. elegans ნემატოდების დასალიზატორად განვითარების ყველა ეტაპზე (ანუ ემბრიონები, ლარვები L1-L4, მოზრდილები). იმის გამო, რომ C. elegans ასევე გამოიყენება, როგორც ცილის ექსპრესიის სისტემა მიზნობრივი ცილების ზედმეტად გამოხატვის მიზნით, საჭიროა საიმედო, რეპროდუცირებადი ლიზისისა და ცილის ექსტრაქციის მეთოდი, რომელიც იძლევა ცილის მაღალ მოსავლიანობას. ულტრაბგერითი უჯრედების დაშლისა და ამოღების სისტემები ხელმისაწვდომია როგორც ზონდის ტიპის ჰომოგენიზატორები და როგორც მრავალნიმუშების ულტრაბგერითი. მოხერხებული ნიმუშის მომზადებისა და ყველა სახის ნიმუშის ზომის ნომრების გათვალისწინებით, Hielscher Ultrasonics-ს აქვს იდეალური ულტრაბგერითი უჯრედების დამრღვევი თქვენი ლაბორატორიული პროცედურისთვის.

ულტრაბგერითი პროტოკოლები C. Elegans-ის მოშლისა და ლიზისისთვის

C. elegans-ის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზაცია და ლიზისი და შემდგომი ცილების და ლიპიდების ექსტრაქცია შეიძლება განხორციელდეს სხვადასხვა პროცედურების გამოყენებით სხვადასხვა ჰომოგენიზაციისა და ლიზის ბუფერების გამოყენებით და ა.შ. ლიზისის ყველა პროტოკოლს აქვს საერთო ის, რომ ნიმუშები მუდმივად უნდა ინახებოდეს ყინულზე, რათა თავიდან იქნას აცილებული ცილის დეგრადაცია. ქვემოთ წარმოგიდგენთ რამდენიმე საიმედო და სწრაფ ულტრაბგერითი ლიზისისა და ექსტრაქციის პროტოკოლებს მაღალი ხარისხის ცილის ან ლიპიდების შემცველი C. elegans ნიმუშების მოსამზადებლად.

ულტრაბგერითი C. elegans Lysis-ის უპირატესობები

• სანდო
• გამრავლებადი
• ზუსტად ტემპერატურული კონტროლი
• საიმედო პროცესის კონტროლი
• ნაზი მეთოდი
• ადვილად გამოსაყენებელი
• Უსაფრთხო

ულტრაბგერითი პროტეინის ექსტრაქცია C. elegans ნიმუშებიდან

C. elegans ჭიების ულტრაბგერითი ლიზისი და ცილის ექსტრაქცია შესაძლებელია სხვადასხვა პროტოკოლის გამოყენებით. ქვემოთ წარმოგიდგენთ რამდენიმე საიმედო და სწრაფი ლიზის პროტოკოლს რეპროდუქციული ცილის ექსტრაქციის შედეგებისთვის.

C. elegans Worms-ის ციტოზოლური ექსტრაქტის სწრაფი მომზადება გახმოვანებით

შემდეგი პროტოკოლით შეგიძლიათ მოამზადოთ C. elegans ლიზატები 30 წუთზე ნაკლებ დროში.
C. elegans-ის კოლექცია
შეარჩიეთ სასურველი C. elegans ჭიები 1.5 მლ ფოსფატის ბუფერულ ფიზიოლოგიურ ხსნარში (PBS) ან გარეცხეთ ისინი თეფშიდან 1.5 მლ PBS-ით. ცენტრიფუგა 1 წუთის განმავლობაში 2000 rpm-ზე გრანულოზე. შეინახეთ ნიმუშები ყოველთვის ყინულზე.
შემდეგ ორჯერ გარეცხეთ ჭიები PBS-ით.
შემდეგ ორჯერ გარეცხეთ ჭიები ddH-ით₂ო.
ხელახლა გააჩერეთ ჭიები მინიმუმ 500 მლ ჰომოგენიზაციის ბუფერში (HB). ჭიის ნიმუშები ახლა მზად არის ულტრაბგერითი ლიზისისთვის.
ცილის ექსტრაქტის მაღალი ხარისხისთვის, შეიძლება დაგჭირდეთ ბაქტერიული დაბინძურების შემცირება ჭიების დაბანით 5 წუთის განმავლობაში PBS-ში და სტერილურ, ულტრა სუფთა წყალში (ddH).₂ო) ან შეასრულოს საქაროზას ფლოატაცია. შეინახეთ ჭიის ნიმუშები მუდმივად ყინულზე.

ულტრაბგერითი C. elegans Lysis პროტოკოლი

• დარწმუნდით, რომ მოამზადეთ ულტრაბგერითი აპარატი წინასწარ ისე, რომ ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი მზად იყოს გამოსაყენებლად (დამონტაჟებული ზონდი, წინასწარ დაყენებული ბგერითი პროგრამა).

თუ თქვენი ულტრაბგერითი მოწყობილობა სადგამზეა დამონტაჟებული, მოათავსეთ ყინულის აბაზანა თქვენი სინჯის მილებით ულტრაბგერითი ზონდის ქვეშ და ჩადეთ ულტრაბგერითი ზონდი 1.5 მლ მილში.

• C. elegans ლიზისისთვის UP200St ან UP200Ht-ით, ულტრაბგერითი დამუშავება უნდა ჩატარდეს მიკროწვერის გამოყენებით (მაგ., 2მმ ზონდი S26d2; იხილეთ სურათი მარცხნივ) 40% ამპლიტუდაზე 1 წამის განმავლობაში 30წმ პაუზებით. 5 ბგერითი ციკლი ყოველ 1 წამში 30 წამიანი პაუზებით იდეალურია C. elegans ლიზისისთვის. თუ პირველად შეასრულებთ ლიზისს, შეგიძლიათ შეამოწმოთ ლიზის პროგრესირება ნიმუშის მცირე ნაწილებში ყოველი პულსის შემდეგ მიკროსკოპის გამოყენებით.
• ლიზისი წარმატებით სრულდება, როდესაც ჭიები იშლება. ზედმეტად გახმოვანება იწვევს ბირთვების მსხვრევას და ხილული ხდება, როდესაც ნიმუში ბლანტი ხდება ან ქაფდება. ნიმუშის დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად, საჭიროების შემთხვევაში გამოიყენეთ მეტი პულსი. არ გაზარდოთ ყოველი ულტრაბგერითი პულსის ციკლის დრო მაღალი ხარისხის ცილის ექსტრაქტების მისაღებად.
• გაასუფთავეთ უჯრედული ლიზატი ულტრაბგერითი ლიზირებული ჭიების ცენტრიფუგით 14000 rpm-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4ºC ტემპერატურაზე.
• შემდეგ გადაიტანეთ სუპერნატანტი ახალ მილში და მოემზადეთ იმუნოპრეციპიტაციისთვის ან სხვა ანალიზისთვის.

შენიშვნა ჰომოგენიზაციის ბუფერთან დაკავშირებით: მოამზადეთ ჰომოგენიზაციის ბუფერი ზემოთ მოყვანილი ულტრაბგერითი ლიზისის პროტოკოლისთვის შემდეგნაირად:

C. elegans-ის მაღალი გამტარუნარიანობის ლიზისი 96 ჭაბურღილის ფირფიტებში UIP400MTP ფირფიტის სონიკატორის გამოყენებით

C. elegans Lysis (ზრდასრული ნემატოდები)
UIP400MTP 80% ამპლიტუდა, 20 ციკლი (თითო ხმოვანი ციკლი: 30 წმ ჩართვა, 30 წამი გამორთვა)
ლიზის ბუფერი:

• ვარიანტი 1) 4% SDS, 0.1 M Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA
• ვარიანტი 2) ერთობლივი იმუნოპრეციპიტაციისთვის (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.5 % NP-40 (სრული პროტეინაზას ინჰიბიტორი კოქტეილი)

მაღალი გამტარუნარიანობის დნმ ფრაგმენტაცია
C. elegans (ზრდასრული ნემატოდები) დნმ 200-300bp: UIP400MTP ფირფიტის სონიკატორი – დააყენეთ 80% ამპლიტუდა, 30 პულსი – ყოველი 30 წამი ჩართულია, 30 წამი გამორთულია

UIP400MTP Plate Sonicator მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მოსამზადებლად ერთგვაროვნად ახდენს ნიმუშების გაჟღერებას მრავალ ჭაბურღილში, მიკროტიტრულ ფირფიტებში და 96 ჭაბურღილების ფირფიტებში

C. elegans-ის ულტრაბგერითი ლიზისი რაოდენობრივი აფინურობის გამწმენდისთვის

C. elegans-ის ემბრიონები (~2 მილიონი თითო რეპლიკაზე) ახლად აღებული იქნა ბიოლოგიურ სამჯერ, ახალგაზრდა ორსული ჰერმაფროდიტების გაუფერულებით და ყინულზე გაჟღენთილი (ციკლი: 0,5 წმ, ამპლიტუდა: 40-45%, 5 ინსულტი/სესია, 5 სეანსი, ინტერვალი სესიებს შორის. : 30 წ; UP200S ულტრაბგერითი პროცესორი მიკრო წვერით S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) ლიზის ბუფერში (საერთო მოცულობა: ~600 μl; 50 მმ Tris-HCl, pH 7.4, 100 მმ KCl, 1 მმ MgCl2, 1 მმ EGTA, 1 მმ DTT, 10% გლიცერი პროტეაზას ინჰიბიტორის ნარევი, 0.1% ნონიდეტი P-40 შემცვლელი). გაჟონვის შემდეგ, Nonidet P-40 Substitute დაემატა 1%-მდე და ლიზატები ინკუბირებული იყო კუდის თავზე როტაციით 4°C-ზე 30 წუთის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა ცენტრიფუგაცია 20,000 × გ 20 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე. შემდეგ გაწმენდილი ლიზატი ასპირირებულ იქნა ზედა ლიპიდური შრის დარღვევის გარეშე და გაიყო ნახევრად ან ანტი-GFP აგაროზის მარცვლებად ან დაბლოკილ საკონტროლო მარცვლებად (40-50 μl). კუდის თავზე როტაციის შემდეგ 4°C ტემპერატურაზე 60-90 წუთის განმავლობაში, მარცვლები გაირეცხა ერთხელ ლიზის ბუფერით, რომელიც შეიცავდა 0,1% Nonidet P-40 შემცვლელს, რასაც მოჰყვა ორჯერ გარეცხვა ორივე ბუფერში I (25 მმ Tris-HCl, pH). 7.4, 300 მმ NaCl, 1 მმ MgCl2) ან ბუფერი II (1 მმ Tris-HCl, pH 7.4, 150 მმ NaCl, 1 მმ MgCl2) ან ორივე. GFP:MBK-2 ამოსაღებად ჩატარდა ორი ცალკეული ექსპერიმენტი სხვადასხვა სარეცხი პირობების გამოყენებით. ცილები გამოირეცხებოდა ორბიტალური შერყევის გზით 50 μl 6 მ შარდოვანაში/2 M თიოურაში ოთახის ტემპერატურაზე. MBK-1::GFP ჩამოსაშლელი ექსპერიმენტებისთვის, ცილები ორჯერ გამოირეცხა 50 μl 8 მ გუანიდინის ქლორიდში 90°C-ზე შერყევის გზით, რასაც მოჰყვა ეთანოლის ნალექი. გარეცხილი ცილის ნიმუშები შემდეგ დაიჯესტირდება ხსნარში.
(შდრ. Chen et al., 2016)

ულტრაბგერითი ჭიის ჰომოგენიზაცია და ლიზისი

C.elegans ლიზისისა და ცილის ექსტრაქციის პროცედურისთვის, თითო ნიმუშზე შეგროვდა შესაბამისი სტადიის 30000 ნემოტოდი და გარეცხილი ყინულივით ცივ S-ბაზალში, კონცენტრირებულია ცენტრიფუგირებით 1500 rpm-ზე 2 წუთის განმავლობაში, გარეცხილი ექვსჯერ ყინულით ცივი S-ით. ბაზალური ნარჩენი ბაქტერიების მოსაშორებლად და შემდეგ ინახება ყინულზე გამოსაყენებლად მზადებამდე. ცილის ექსტრაქციისთვის, მოზრდილ ჭიებს მიეცათ საშუალება შექმნან კომპაქტური მარცვლები ბოლო S-ბაზალური რეცხვის შემდეგ. შემდეგ ჭიის მარცვლები ხელახლა შეჩერდა 1 მლ ყინულის ექსტრაქციის ბუფერში [20 მმ კალიუმის ფოსფატი, pH 7.4, 2 მმ EDTA, 1% Triton-X-100, პროტეაზას ინჰიბიტორები (Sigma P2714)] და დაუყონებლივ დამუშავდა.
~30,000 მოზრდილი ჭია (შეესაბამება ~ 100 მგ სველ წონას), გაჟღენთილი იქნა ყინულზე aa ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატის გამოყენებით (მაგ. UP50H მიკროწვერით MS2) 40% ამპლიტუდაზე 10 ციკლის განმავლობაში 3 წამის განმავლობაში, 30 წამში. 1 მლ ყინულით ცივი ექსტრაქციის ბუფერი. (შდრ. ბასხარანი და სხვ. 2012 წ.)

ულტრაბგერითი ლიპიდების ექსტრაქცია C. elegans-დან

ლიპიდომიკაში, მეტაბოლომიკის ფილიალში, ხასიათდება და ანალიზდება ბიოლოგიური სისტემების ლიპიდური კომპლემენტი. C. elegans ფართოდ გამოიყენება ლიპიდომიკაში, რათა გამოიკვლიოს მეტაბოლური ლიპიდების ურთიერთქმედება და მათი გავლენა ჯანმრთელობასა და სიცოცხლის ხანგრძლივობაზე.
ულტრაბგერითი ლიზისი და ექსტრაქცია გამოიყენება ლიპიდების გასათავისუფლებლად, როგორიცაა სფინგოლიპიდები C. elegans ემბრიონებიდან, ლარვებიდან და ზრდასრული ჭიებიდან. ულტრაბგერითი დამუშავება გამოიყენება ჭიების ჰომოგენატების მოსამზადებლად და შემდგომში ნიმუშიდან ლიპიდების ამოსაღებად.
პროტოკოლი ულტრაბგერითი ლიპიდების ექსტრაქციისთვის C. elegans-დან
გაალღვეთ C. elegans მარცვლები ყინულზე და კვლავ შეაჩერეთ 0,5 მლ ულტრაწყალი. C. elegans-ის ნიმუშების გაჟონვა 1,5 მლ სინჯებში, ხოლო ნიმუშები მუდმივად ყინულზე ინახება.
Sonication შეიძლება შესრულდეს გამოყენებით probe-ულტრაბგერითი, როგორიცაა UP200Ht, ულტრაბგერითი ნიმუშის მოსამზადებელი განყოფილება VialTweeter (10 ნიმუშის ერთდროული ზონირება) ან UIP400MTP (მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტების გახმოვანებისთვის, როგორიცაა 96 ჭაბურღილის ფირფიტები). ულტრაბგერითი ლიზისისთვის UP200Ht-ით გამოიყენეთ მიკრო წვერი S26d2. წინასწარ დააყენეთ ულტრაბგერითი ციკლის რეჟიმი ციფრულ მენიუში. დააყენეთ ამპლიტუდა 10%-ზე და ბგერითი ციკლის რეჟიმი 2 წამიანი პულსი 20 ციკლით 30 წამის პაუზით. თითოეულ ულტრაბგერითი პულსაციის აფეთქებას შორის.
გადაიტანეთ სუპერნატანტები მინის მილებში ხრახნიანი თავსახურით. შეასრულეთ ფოლჩის ექსტრაქცია თითოეულ მინის მილში 1 მლ ულტრაწყლის დამატებით, რასაც მოჰყვება 6 მლ ქლოროფორმის/მეთანოლის (შეფარდება = 2:1) ნარევი თითოეულ მინის მილში.
ატრიალეთ თითოეული მინის მილი 30 წამის განმავლობაში 4-ჯერ. ცენტრიფუგა მილები 1,258 xg-ზე 15 წუთის განმავლობაში (Eppendorf, 5810 R) ფაზის გამოყოფის შემდგომი გასაძლიერებლად. ქვედა ჰიდროფობიური ფრაქცია სუფთა მინის მილში გადაიტანეთ მინის პასტერის პიპეტით. გააშრეთ ქვედა ჰიდროფობიური ფრაქცია აზოტის ნაკადის ქვეშ აზოტის აორთქლებაში. გამხმარი მარცვლები შეინახეთ -80 °C საყინულეში გამოყენებამდე.

ჭიის ლიზატების ულტრაბგერითი მომზადება

ჭიის ლიზატი: L4 სტადიის ჭიები შეკრიბეს და სამჯერ გარეცხეს M9 ბუფერით (42,26 მმ Na₂HPO₄, 22,04 მმ KH₂PO₄, 85,56 მმ NaCl, და 0,87 მმ MgSO₄) ყველა ბაქტერიის მოსაშორებლად. M9 ბუფერის მაქსიმალურად ამოღების შემდეგ, ჭიები ხელახლა შეჩერდა ლიზის ბუფერში: 50 მმ HEPES, 50 მმ KCl, 1 მმ EDTA, 1 მმ EGTA, 5 მმ ფოსფატი β-გლიცეროლი, 0.1% (ვ/ვ) Triton X-100, 50 მმ ნატრიუმის ფტორიდი, 1 მმ ნატრიუმის ორთოვანადატი, 5 მმ ნატრიუმის პიროფოსფატი, 0,2 მმ ფენილმეთანესულფონილფტორიდი და პროტეაზას ინჰიბიტორი. ჭიები გაყინეს თხევად აზოტში და გალღობდნენ 37°C-ზე სამჯერ, შემდეგ ჭიები გაჟღენთილი იქნა მშრალ ყინულზე ულტრაბგერითი VialTweeter-ის ერთეულით 10 ნიმუშის მილის ერთდროულად მოსამზადებლად. გაჟღერება ჩატარდა 50% ამპლიტუდაზე 2 წამის 10 ციკლში. 30 წამიანი პაუზით გაჟონვას შორის. ამის შემდეგ, ნიმუშები ცენტრიფუგირებულ იქნა 12000 rpm-ზე 4°C-ზე 15 წუთის განმავლობაში. სუპერნატანი შეგროვდა და ინახება -70°C-ზე. ბრედფორდის ანალიზით ცილების რაოდენობრივი დასადგენად გამოყენებული იქნა ალიქვოტი.
მთლიანი გლუტათიონის, GSH და GSSG-ის განსაზღვრა: გლუტათიონის რაოდენობრივი დასადგენად, ლიზატები და განსაზღვრა გაკეთდა იმავე დღეს. გლუკოზით კვება და საკონტროლო L4 ლარვები შეკრიბეს და გარეცხეს M9 ბუფერით სამჯერ. M9 ბუფერის რაც შეიძლება მეტი ამოღების შემდეგ, ჭიები ხელახლა შეჩერდა ყინულივით ცივ მეტაფოსფორულ მჟავაში (5% w/v), შემდეგ ჭიები აჟღერდა ყინულში ულტრაბგერითი VialTweeter-ით 50% ამპლიტუდაზე ათი სონიკაციის ციკლში 2 წმ. 30 წამით. პაუზა თითოეულ ციკლს შორის. ამის შემდეგ, ცენტრიფუგია 12000 rpm-ზე 4 ̊C 15 წუთის განმავლობაში.
(შდრ. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans ნიმუშის მომზადება იმუნოპრეციპტაციამდე და Western Blotting-მდე

მოკლედ, ემბრიონის ექსტრაქტებისთვის, C. elegans L1 ლარვები გაიზარდა ფართომასშტაბიანი თხევადი S-საშუალო კულტურებში ზრდასრულ ასაკში. ემბრიონები შეგროვდა სტანდარტული გაუფერულების მეთოდით და შეჩერებული იყო ლიზის ბუფერში (50 მმ ტრისი, pH 7.5, 100 მმ KCl, 1 მმ EDTA, 1 მმ MgCl2, 8.7% გლიცეროლი, 0.05% NP-40, 1 ინჰიბიტორაზა. 1 * ფოსფატაზას ინჰიბიტორი კოქტეილი I და II), სწრაფად გაყინული თხევადი აზოტში და ლიზდება ულტრაბგერითი უჯრედების დარღვევით ულტრაბგერითი აპარატის გამოყენებით მიკროწვერით, როგორიცაა UP200Ht S26d2-ით 10 იმპულსისთვის 10 წმ-ზე 30% ამპლიტუდაზე. თუ ნიმუშების დიდი რაოდენობა უნდა მომზადდეს ულტრაბგერითი VialTweeter ან MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP ჭაბურღილის ფირფიტებისთვის რეკომენდებულია. სონიკაციის შემდეგ, ექსტრაქტები წინასწარ გაიწმინდა ცენტრიფუგირებით 30,000 გ-ზე 20 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე. წინასწარ გასუფთავებული ექსტრაქტი (300 მკგ მთლიანი ცილა) ინკუბირებული იყო 40 μ5.1 ანტი-CDC-25.1 აფინურობით გაწმენდილი ანტისხეულით (ეს კვლევა), რომელიც ჯვარედინად იყო დაკავშირებული ცილა A-აგაროზასთან, ან როგორც კონტროლი, კურდღლის იმუნოგლობულინის მსგავსი რაოდენობით. (Ig)G, რომელიც ჯვარედინად იყო დაკავშირებული ცილა A-აგაროზასთან, გამოიყენებოდა 200µl ლიზის ბუფერის საერთო მოცულობაში, რომელიც შეიცავს 1% NP-40-ს, რომლის ჩართვამ შეამცირა პროტეინების არასპეციფიკური კავშირი მატრიქსთან. ნიმუშები შეტრიალდა 1 საათის განმავლობაში 4°C-ზე, მარცვლები გარეცხილი იქნა სამჯერ ლიზის ბუფერით და გამოირეცხა 30 μl გლიცინით/HCl და 200 მმ NaCl, pH 2.2. იმუნოპრეციპიტაციის შემდეგ, ელუატები განზავებული იყო 30 μ³ ლ SDS ნიმუშის ბუფერში, გაცხელდა 95°C-მდე 4 წუთის განმავლობაში და, როგორც წესი, 3% შეყვანისთვის და 30% ელუატებისთვის გამოყენებული იყო SDS-PAGE-ზე, რასაც მოჰყვა Western blotting ანტი. -CDC-25.1 (1:400), ანტი-LIN-23 (1:750), ანტი-უბიკვიტინი (1:1000), ანტი-GSK3 * (1:500) ან ანტი-**β-აქტინი (1: 2000) ანტისხეულები. სადაც ექსტრაქტები არ ექვემდებარებოდა იმუნოპრეციპიტაციას, ამ ექსტრაქტებისგან მიღებული მთლიანი პროტეინის იგივე რაოდენობა ხელახლა შეჩერდა SDS ნიმუშის ბუფერში, გაცხელდა 95°C-მდე და შემდეგ პირდაპირ მიმართა SDS-PAGE-ზე და გაანალიზდა Western blotting-ით. (შდრ. Segref et al. 2020)

ულტრაბგერითი ლიზისი ზუსტი ტემპერატურის კონტროლის ქვეშ

ტემპერატურის ზუსტი და საიმედო კონტროლი გადამწყვეტია ბიოლოგიური ნიმუშების დამუშავებისას. მაღალი ტემპერატურა იწვევს ნიმუშებში თერმულად გამოწვეულ ცილების დეგრადაციას.
როგორც ყველა მექანიკური ნიმუშის მომზადების ტექნიკა, sonication ქმნის სითბოს. თუმცა, ნიმუშების ტემპერატურა კარგად შეიძლება კონტროლდებოდეს VialTweeter-ის გამოყენებისას. ჩვენ წარმოგიდგენთ სხვადასხვა ვარიანტს თქვენი ნიმუშების ტემპერატურის მონიტორინგისა და კონტროლისთვის, სანამ ამზადებთ მათ VialTweeter-ით და VialPress-ით ანალიზისთვის.

1. ნიმუშის ტემპერატურის მონიტორინგი: ულტრაბგერითი პროცესორი UP200St, რომელიც მართავს VialTweeter-ს, აღჭურვილია ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფით და ჩართვის ტემპერატურის სენსორით. შეაერთეთ ტემპერატურის სენსორი UP200St-ში და ჩადეთ ტემპერატურის სენსორის წვერი ნიმუშის ერთ-ერთ მილში. ციფრული ფერადი სენსორული დისპლეის საშუალებით შეგიძლიათ დააყენოთ UP200St-ის მენიუში სპეციფიკური ტემპერატურის დიაპაზონი თქვენი ნიმუშის გაჟონვისთვის. მაქსიმალური ტემპერატურის მიღწევისას ულტრაბგერითი ავტომატურად გაჩერდება და შეჩერდება მანამ, სანამ ნიმუშის ტემპერატურა არ დაიწევს დაყენებული ტემპერატურის Δ დაბალ მნიშვნელობამდე. შემდეგ ხმოვანი გამოსხივება ისევ ავტომატურად იწყება. ეს ჭკვიანი ფუნქცია ხელს უშლის სითბოს გამოწვეულ დეგრადაციას.
2. VialTweeter-ის ბლოკი შეიძლება წინასწარ გაცივდეს. ჩადეთ VialTweeter-ის ბლოკი (მხოლოდ სონოტროდი გადამყვანის გარეშე!) მაცივარში ან საყინულეში, რათა წინასწარ გაცივდეს ტიტანის ბლოკი, რაც ხელს უწყობს ნიმუშის ტემპერატურის აწევის გადადებას. თუ შესაძლებელია, თავად ნიმუშიც შეიძლება წინასწარ გაცივდეს.
3. გამოიყენეთ მშრალი ყინული გაციებისას სონიკაციის დროს. გამოიყენეთ არაღრმა უჯრა, სავსე მშრალი ყინულით და მოათავსეთ VialTweeter მშრალ ყინულზე, რათა სითბო სწრაფად გაიფანტოს.

იპოვეთ ოპტიმალური ულტრაბგერითი უჯრედების დამრღვევი თქვენი Lysis აპლიკაციისთვის

Hielscher Ultrasonics არის დიდი ხნის გამოცდილი მწარმოებელი მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი უჯრედების დამრღვევებისა და ჰომოგენიზატორების ლაბორატორიებისთვის, სკამების და სამრეწველო მასშტაბის სისტემებისთვის. თქვენი ბაქტერიული უჯრედების კულტურის ზომა, თქვენი კვლევის ან წარმოების მიზანი და უჯრედის მოცულობა საათში ან დღეში დასამუშავებლად არის აუცილებელი ფაქტორები თქვენი განაცხადისთვის ულტრაბგერითი უჯრედების სწორი დამრღვევის მოსაძებნად.
Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ სხვადასხვა გადაწყვეტილებებს მრავალ ნიმუშის (10 ფლაკონამდე) და მასობრივი ნიმუშების (ანუ მიკროტიტრული ფირფიტები / 96 ჭაბურღილების ფირფიტების) ერთდროული გაჟღერებისთვის, კლასიკური ზონდის ტიპის ლაბორატორიული ულტრაბგერითი სიმძლავრის სხვადასხვა დონით 50-დან 400 ვატი სრულად სამრეწველო ულტრაბგერითი პროცესორებისთვის 16000 ვატამდე ერთეულზე კომერციული უჯრედების დაშლისა და ცილის მოპოვებისთვის დიდ წარმოებაში. ყველა Hielscher ულტრაბგერითი აგებულია 24/7/365 ოპერაციისთვის სრული დატვირთვით. გამძლეობა და საიმედოობა ჩვენი ულტრაბგერითი მოწყობილობების ძირითადი მახასიათებლებია.
ყველა ციფრული ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი აღჭურვილია ჭკვიანი პროგრამული უზრუნველყოფით, ფერადი სენსორული დისპლეით და მონაცემთა ავტომატური პროტოკოლით, რაც ულტრაბგერითი მოწყობილობა ხელსაყრელ სამუშაო ინსტრუმენტად აქცევს ლაბორატორიულ და საწარმოო ობიექტებში.
შეგვატყობინეთ, რა ტიპის უჯრედები, რა მოცულობის, რა სიხშირით და რა სამიზნით გაქვთ თქვენი ბიოლოგიური ნიმუშების დამუშავება. ჩვენ გირჩევთ ყველაზე შესაფერისი ულტრაბგერითი უჯრედების დამრღვევს თქვენი პროცესის მოთხოვნებისთვის.

ქვემოთ მოყვანილი ცხრილი გვაწვდის მითითებას ჩვენი ულტრაბგერითი სისტემების დამუშავების სავარაუდო სიმძლავრის შესახებ კომპაქტური ხელის ჰომოგენიზატორებიდან და MultiSample Ultrasonicators-დან სამრეწველო ულტრაბგერითი პროცესორებით კომერციული გამოყენებისთვის: