C. elegans ნიმუშების ულტრაბგერითი მომზადება

C. elegans, ნემატოდა ჭიის სახეობა, ფართოდ გამოიყენება როგორც მოდელური ორგანიზმი ბიოლოგიაში. ანალიზამდე ნიმუშის მომზადება მოითხოვს ლიზის, ცილებისა და ლიპიდების ექსტრაქციას, ასევე RNA ფრაგმენტაციას, რაც შეიძლება საიმედოდ განხორციელდეს ულტრაბგერითი დამუშავების გზით. ულტრაბგერითი უჯრედების დამშლელი აპარატები არის საიმედო, თანამედროვე და მარტივად გამოსაყენებელი მოწყობილობები C. elegans ნიმუშების სწრაფი მომზადებისთვის.

C. elegans ნიმუშების ულტრაბგერითი მომზადება

Caenorhabditis elegans მრგვალი ჭიებია, რომლებიც ფართოდ გამოიყენება სამეცნიერო ლაბორატორიებში გენომიკის, განვითარების ბიოლოგიისა და დაავადებების შესასწავლად. C. elegans გენომის ბევრ გენს აქვს ფუნქციური ანალოგები ადამიანში. ამრიგად, ნემატოდა ჭია არის უკიდურესად სასარგებლო მოდელი ადამიანის დაავადებებისთვის. C. elegans-ის ფართო გამოყენების სხვა უპირატესობებია მისი მარტივი და იაფი კულტივირება ბაქტერიების შემცველ ჭურჭელზე (მაგ., E. coli), მისი გამჭვირვალობა, მოხერხებული მართვა, ასევე ჭიების გაყინვისა და უფრო ხანგრძლივი პერიოდის განმავლობაში შენახვის შესაძლებლობა.
ცილებისა და ლიპიდების ანალიზი ლაბორატორიებში რეგულარული პროცედურებია, ხოლო ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადება არის დამკვიდრებული მეთოდი C. elegans ნემატოდების ლიზისთვის განვითარების ყველა ეტაპზე (ანუ ემბრიონები, L1-L4 ლარვები, ზრდასრული ინდივიდები). რადგან C. elegans ასევე გამოიყენება როგორც ცილის ექსპრესიის სისტემა სამიზნე ცილების ჰიპერექსპრესიისთვის, საჭიროა საიმედო, რეპროდუცირებადი ლიზისა და ცილის ექსტრაქციის მეთოდი, რომელიც უზრუნველყოფს ცილების მაღალ გამოსავლიანობას. ულტრაბგერითი უჯრედების დამშლელი და ექსტრაქციის სისტემები ხელმისაწვდომია როგორც პრობის ტიპის ჰომოგენიზატორები, ისე მრავალნიმუშიანი ულტრაბგერითი აპარატები. მოხერხებული ნიმუშის მომზადებისა და ნიმუშების ყველა ტიპის ზომისა და რაოდენობისთვის, Hielscher Ultrasonics-ს აქვს იდეალური ულტრაბგერითი უჯრედების დამშლელი თქვენი ლაბორატორიული პროცედურისთვის.

ულტრაბგერითი პროტოკოლები C. Elegans-ის დაშლისა და ლიზისისთვის

C. elegans-ის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზაცია და ლიზისი, აგრეთვე შემდგომი ცილებისა და ლიპიდების ექსტრაქცია შეიძლება განხორციელდეს სხვადასხვა პროცედურით, ჰომოგენიზაციისა და ლიზისის სხვადასხვა ბუფერის გამოყენებით და ა.შ. ლიზისის ყველა პროტოკოლისთვის საერთოა ის, რომ ცილების დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად ნიმუშები მუდმივად ყინულზე უნდა ინახებოდეს. ქვემოთ გთავაზობთ რამდენიმე საიმედო და სწრაფ ულტრაბგერითი ლიზისისა და ექსტრაქციის პროტოკოლს მაღალი ხარისხის ცილების ან ლიპიდების შემცველი C. elegans ნიმუშების მომზადებისთვის.

ულტრაბგერითი C. elegans ლიზის უპირატესობები

• საიმედო
• რეპროდუცირებადი
• ტემპერატურის ზუსტი კონტროლით
• საიმედო პროცესის კონტროლი
• რბილი მეთოდი
• მარტივად გამოსაყენებელი
• უსაფრთხო

ცილების ულტრაბგერითი ექსტრაქცია C. elegans ნიმუშებიდან

C. elegans ჭიების ულტრაბგერითი ლიზი და ცილის ექსტრაქცია შეიძლება განხორციელდეს სხვადასხვა პროტოკოლების გამოყენებით. ქვემოთ ჩვენ გთავაზობთ რამდენიმე საიმედო და სწრაფ ლიზის პროტოკოლს რეპროდუცირებადი ცილის ექსტრაქციის შედეგებისთვის.

ციტოზოლური ექსტრაქტის სწრაფი მომზადება C. elegans ჭიებიდან ულტრაბგერითი დამუშავებით

შემდეგი პროტოკოლით შეგიძლიათ მოამზადოთ C. elegans ლიზატები 30 წუთზე ნაკლებ დროში.
C. elegans-ის შეგროვება
გადაიტანეთ სასურველი C. elegans ჭიები ფოსფატური ბუფერის მარილხსნარის (PBS) შემცველ 1,5ml სინჯარაში ან ჩამორეცხეთ ისინი ფირფიტიდან 1,5ml PBS-ით. ნალექის მისაღებად ჩაატარეთ ცენტრიფუგირება 1 წუთის განმავლობაში 2000rpm სიჩქარით. ნიმუშები მუდმივად ინახეთ ყინულზე.
შემდეგ, გადარეცხეთ ჭიები ორჯერ PBS-ით.
ამის შემდეგ, გადარეცხეთ ჭიები ორჯერ ddH₂O-თი.
ხელახლა მოამზადეთ ჭიების სუსპენზია არანაკლებ 500ul ჰომოგენიზაციის ბუფერში (HB). ჭიების ნიმუშები ახლა მზადაა ულტრაბგერითი ლიზისისთვის.
ცილის ექსტრაქტის ხარისხის გასაუმჯობესებლად შეგიძლიათ შეამციროთ ბაქტერიული კონტამინაცია ჭიების გარეცხვით PBS-ში და სტერილურ, ულტრასუფთა წყალში, თითოეულში 5 წუთის განმავლობაში (ddH₂O) ან ჩაატაროთ საქაროზით ფლოტაცია. ჭიების ნიმუშები მუდმივად ინახეთ ყინულზე.

ულტრაბგერითი C. elegans ლიზის პროტოკოლი

• დარწმუნდით, რომ წინასწარ ამზადებთ ულტრაბგერით აპარატს ისე, რომ ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი იყოს გამოსაყენებლად მზა (პრობი დამაგრებული, ულტრაბგერითი დამუშავების პროგრამა წინასწარ დაყენებული). 

თუ თქვენი ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი დგარზეა დამაგრებული, მოათავსეთ ყინულის აბაზანა ნიმუშების სინჯარებით ულტრაბგერითი ზონდის ქვეშ და ჩაუშვით ულტრაბგერითი ზონდი 1,5ml სინჯარაში.

• C. elegans-ის ლიზისთვის UP200St ან UP200Ht მოდელებით, ულტრაბგერითი დამუშავება უნდა განხორციელდეს მიკროპრობის გამოყენებით (მაგ., 2mm პრობი S26d2; იხ. სურათი მარცხნივ) 40% ამპლიტუდაზე 1წმ-ის განმავლობაში, 30წმ ინტერვალებით. 5 ულტრაბგერითი ციკლი თითოეული 1 წამისთვის, 30წმ ინტერვალებით, იდეალურია C. elegans-ის ლიზისთვის. თუ ლიზის პროცედურას პირველად ასრულებთ, შეგიძლიათ ნიმუშის მცირე ალიკვოტებში ლიზის პროგრესი შეამოწმოთ მიკროსკოპით თითოეული იმპულსის შემდეგ.
• ლიზი წარმატებით დასრულდება, როდესაც ჭიები დაინგრევა. ზედმეტი ულტრაბგერითი დამუშავება იწვევს ბირთვების დაშლას და ვლინდება, როდესაც ნიმუში ხდება სქელი ან ქაფდება. ნიმუშის დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად, საჭიროების შემთხვევაში გამოიყენეთ მეტი იმპულსი. არ გაზარდოთ თითოეული ულტრაბგერითი იმპულსის ციკლის ხანგრძლივობა მაღალი ხარისხის ცილოვანი ექსტრაქტების მისაღებად.
• გაასუფთავეთ უჯრედული ლიზატი ულტრაბგერით ლიზირებული ჭიების ცენტრიფუგირებით 14,000rpm სიჩქარით 10 წუთის განმავლობაში 4ºC-ზე.
• შემდეგ, გადაიტანეთ ზედა ფენა (სუპერნატანტი) სუფთა მილში და მოამზადეთ იმუნოპრეციპიტაციისთვის ან სხვა ანალიზებისთვის.

შენიშვნა ჰომოგენიზაციის ბუფერის შესახებ: მოამზადეთ ჰომოგენიზაციის ბუფერი ზემოთ მოცემული ულტრაბგერითი ლიზის პროტოკოლისთვის შემდეგნაირად:

C. elegans-ის მაღალი გამტარუნარიანობის ლიზისი 96-ფოსოიან ფირფიტებში UIP400MTP ფირფიტების ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორის გამოყენებით

C. elegans-ის ლიზი (ზრდასრული ნემატოდები)
UIP400MTP 80% ამპლიტუდა, 20 ციკლი (თითოეული ულტრაბგერითი ციკლი: 30 წმ ჩართული, 30 წმ გამორთული)
ლიზის ბუფერი:

• ვარიანტი 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• ვარიანტი 2) კო-იმუნოპრეციპიტაციისთვის (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (Complete პროტეინაზის ინჰიბიტორების კოქტეილი)

მაღალი გამტარუნარიანობის დნმ-ის ფრაგმენტაცია
C. elegans (ზრდასრული ნემატოდები) დნმ 200-300bp: UIP400MTP ფირფიტების ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი – დააყენეთ 80% ამპლიტუდა, 30 იმპულსი – თითოეული 30წმ ჩართული, 30წმ გამორთული

UIP400MTP ფირფიტების ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშების მომზადებისთვის თანაბრად ამუშავებს ულტრაბგერით ნიმუშებს მრავალფოსოიან, მიკროტიტრაციისა და 96-ფოსოიან ფირფიტებში

C. elegans-ის ულტრაბგერითი ლიზი რაოდენობრივი აფინური გასუფთავების ანალიზებისთვის

C. elegans-ის ემბრიონები (∼2 მილიონი თითო რეპლიკატში) ახლად შეაგროვეს სამ ბიოლოგიურ რეპლიკატში, კვერცხების მატარებელი ახალგაზრდა ჰერმაფროდიტების მათეთრებელი ხსნარით დამუშავების გზით, და ულტრაბგერით დაამუშავეს ყინულზე (ციკლი: 0,5 წმ, ამპლიტუდა: 40–45%, 5 იმპულსი/სესია, 5 სესია, ინტერვალი სესიებს შორის: 30 წმ; UP200S ულტრაბგერითი პროცესორი მიკროწვერით S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) ლიზისის ბუფერში (მთლიანი მოცულობა: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% გლიცერინი, პროტეაზის ინჰიბიტორების ნარევი, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ Nonidet P-40 Substitute დაემატა 1%-მდე და ლიზატები ინკუბირდებოდა სინჯარის ერთი ბოლოდან მეორისკენ გადაბრუნებით ბრუნვის პირობებში 4°C-ზე 30 წუთის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა ცენტრიფუგირება 20,000 × g-ზე 20 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე. შემდეგ გასუფთავებული ლიზატი ასპირაციით ამოიღეს ზედა ლიპიდური ფენის დაურღვევლად და ორ თანაბარ ნაწილად გაანაწილეს: ერთი ნაწილი დაამატეს ანტი-GFP აგაროზის მარცვლებს, მეორე კი – ბლოკირებულ საკონტროლო მარცვლებს (40–50 μl). სინჯარის ერთი ბოლოდან მეორისკენ გადაბრუნებით ბრუნვის შემდეგ, 4°C-ზე 60–90 წუთის განმავლობაში, მარცვლები ერთხელ გარეცხეს ლიზისის ბუფერით, რომელიც შეიცავდა 0,1% Nonidet P-40 Substitute-ს, შემდეგ კი ორჯერ გარეცხეს ბუფერ I-ში (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2), ბუფერ II-ში (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ან ორივეში. GFP:MBK-2 პულ-დაუნებისთვის ჩატარდა ორი ცალკეული ექსპერიმენტი გარეცხვის სხვადასხვა პირობებში. ცილები ელუირდებოდა ორბიტალური შენჯღრევით 50 μl 6 m შარდოვანას/2 M თიოშარდოვანას ხსნარში ოთახის ტემპერატურაზე. MBK-1::GFP პულ-დაუნის ექსპერიმენტებისთვის ცილები ორჯერ ელუირდებოდა შენჯღრევით 50μl 8 m გუანიდინიუმის ქლორიდში 90°C-ზე, რასაც მოჰყვა ეთანოლით დალექვა. შემდეგ ელუირებული ცილოვანი ნიმუშები ხსნარში მონელებას დაექვემდებარა.
(იხ. Chen et al., 2016)

ულტრაბგერითი ჭიის ჰომოგენიზაცია და ლიზისი

C. elegans-ის ლიზისისა და ცილის ექსტრაქციის პროცედურისთვის თითოეული ნიმუშისთვის შეგროვდა შესაბამის სტადიაზე მყოფი 30 000 ნემატოდა, გაირეცხა ყინულივით ცივ S-basal-ში, კონცენტრირდა ცენტრიფუგირებით 1500 rpm-ზე 2 წთ-ის განმავლობაში, ექვსჯერ გაირეცხა ყინულივით ცივი S-basal-ით ნარჩენი ბაქტერიების მოსაშორებლად და გამოყენებამდე ინახებოდა ყინულზე. ცილის ექსტრაქციისთვის კვერცხების მატარებელ ზრდასრულ ჭიებს ბოლო S-basal-ით გარეცხვის შემდეგ აცადეს მკვრივი ნალექის წარმოქმნა. შემდეგ ჭიების ნალექი ხელახლა შეასუსპენზირეს 1 ml ყინულივით ცივ ექსტრაქციის ბუფერში [20 mM კალიუმის ფოსფატი, pH 7,4, 2 mM EDTA, 1% Triton-X-100, პროტეაზის ინჰიბიტორები (Sigma P2714)] და დაუყოვნებლივ დამუშავდა.
∼30 000 კვერცხების მატარებელი ზრდასრული ჭია (რაც შეესაბამება ∼100 mg სველ წონას) ულტრაბგერითად დამუშავდა ყინულზე ზონდური ტიპის ულტრაბგერითი აპარატის გამოყენებით (მაგ. UP50H მიკროწვერით MS2), 40% ამპლიტუდაზე, 10 ციკლის განმავლობაში, თითოეულ ციკლში 3 sec ჩართვითა და 30 sec გამორთვით, 1 ml ყინულივით ცივ ექსტრაქციის ბუფერში. (იხ. Baskharan et al. 2012)

ულტრაბგერითი ლიპიდების ამოღება C. elegans-დან

ლიპიდომიკაში, მეტაბოლომიკის ერთ-ერთ მიმართულებაში, ხდება ბიოლოგიური სისტემების ლიპიდური შემადგენლობის დახასიათება და ანალიზი. C. elegans ფართოდ გამოიყენება ლიპიდომიკაში მეტაბოლური ლიპიდების ურთიერთქმედებისა და მათი გავლენის შესასწავლად ჯანმრთელობასა და სიცოცხლის ხანგრძლივობაზე.
ულტრაბგერითი ლიზისი და ამოღება გამოიყენება ლიპიდების, როგორიცაა სფინგოლიპიდები, გამოყოფისთვის C. elegans-ის ემბრიონებიდან, ლარვებიდან და ზრდასრული ჭიებიდან. ულტრაბგერითი დამუშავება გამოიყენება ჭიების ჰომოგენატების მოსამზადებლად და შემდეგ ლიპიდების ნიმუშიდან ამოსაღებად.
ულტრაბგერითი ლიპიდების ამოღების პროტოკოლი C. elegans-დან
გაალღვეთ C. elegans-ის ნალექი ყინულზე და ხელახლა შეასუსპენზირეთ 0,5 ml ულტრაწმინდა წყალში. ულტრაბგერითად დაამუშავეთ C. elegans-ის ნიმუშები 1,5 mL სინჯარებში ისე, რომ ნიმუშები მუდმივად ყინულზე იყოს.
ულტრაბგერითი დამუშავება შესაძლებელია პრობის ტიპის ულტრაბგერითი დამუშავების აპარატის გამოყენებით, როგორიცაა UP200Ht, ნიმუშების ულტრაბგერითი მომზადების მოწყობილობის VialTweeter (10 ნიმუშის ერთდროული ულტრაბგერითი დამუშავება) ან UIP400MTP (მრავალფოსოიანი პლანშეტების, როგორიცაა 96-ფოსოიანი პლანშეტები, ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის). UP200Ht-ით ულტრაბგერითი ლიზისისთვის გამოიყენეთ მიკროწვერი S26d2. წინასწარ დააყენეთ ულტრაბგერითი ციკლის რეჟიმი ციფრულ მენიუში. დააყენეთ ამპლიტუდა 10%-ზე და ულტრაბგერითი დამუშავების რეჟიმი 20 ციკლზე, 2 sec იმპულსებითა და თითოეულ ულტრაბგერით იმპულსთა სერიას შორის 30 sec პაუზით.
გადაიტანეთ ზედა ფენა (სუპერნატანტი) მინის სინჯარებში ხრახნიანი თავსახურით. ჩაატარეთ Folch-ის ამოღება თითოეულ მინის სინჯარაში 1 ml ულტრაწმინდა წყლის დამატებით, შემდეგ თითოეულ მინის სინჯარაში 6 ml ქლოროფორმის/მეთანოლის (შეფარდება = 2:1) ნარევის დამატებით.
თითოეული მინის სინჯარა ვორტექს-მიქსერით აურიეთ 4-ჯერ, ყოველ ჯერზე 30 sec-ის განმავლობაში. ცენტრიფუგირეთ სინჯარები 1 258 x g-ზე 15 min-ის განმავლობაში (Eppendorf, 5810 R) ფაზების განცალკევების გასაუმჯობესებლად. გადაიტანეთ ქვედა ჰიდროფობული ფრაქცია სუფთა მინის სინჯარაში მინის პასტერის პიპეტით. გააშრეთ ქვედა ჰიდროფობული ფრაქცია აზოტის ნაკადში, აზოტით აორთქლების მოწყობილობაში. შეინახეთ გამშრალი ნალექი -80 °C-ზე საყინულეში გამოყენებამდე. 


ჭიების ლიზატების ულტრაბგერითი მომზადება

ჭიის ლიზატი: L4 სტადიის ჭიები შეგროვდა და სამჯერ გაირეცხა M9 ბუფერით (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 მმ KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl და 0,87 mM MgSO₄) ყველა ბაქტერიის მოსაშორებლად. M9 ბუფერის შეძლებისდაგვარად სრულად მოცილების შემდეგ ჭიები ხელახლა შეასუსპენზირეს ლიზისის ბუფერში: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM β-გლიცეროფოსფატი, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM ნატრიუმის ფლუორიდი, 1 mM ნატრიუმის ორთოვანადატი, 5 mM ნატრიუმის პიროფოსფატი, 0,2 mM ფენილმეთანსულფონილფლუორიდი და პროტეაზის ინჰიბიტორი. ჭიები სამჯერ გაყინეს თხევად აზოტში და გაალღვეს 37°C-ზე, შემდეგ ულტრაბგერითად დაამუშავეს მშრალ ყინულზე VialTweeter ულტრაბგერითი მოწყობილობით, რომელიც 10 სინჯარის ერთდროული მომზადებისთვის გამოიყენება. ულტრაბგერითი დამუშავება ჩატარდა 50% ამპლიტუდაზე, 2 sec-ის ხანგრძლივობის 10 ციკლად, ულტრაბგერით იმპულსთა სერიებს შორის 30 sec პაუზით. შემდეგ ნიმუშები ცენტრიფუგირდა 12 000 rpm-ზე, 4°C-ზე, 15 min-ის განმავლობაში. სუპერნატანტი შეგროვდა და შეინახა -70°C-ზე. ალიქვოტა გამოიყენეს ცილის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის ბრედფორდის მეთოდით.
საერთო გლუტათიონის, GSH-ისა და GSSG-ის განსაზღვრა: გლუტათიონის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის ლიზატების მომზადება და განსაზღვრა ერთსა და იმავე დღეს ჩატარდა. გლუკოზით ნაკვები და საკონტროლო L4 ლარვები შეგროვდა და სამჯერ გაირეცხა M9 ბუფერით. M9 ბუფერის შეძლებისდაგვარად სრულად მოცილების შემდეგ ჭიები ხელახლა შეასუსპენზირეს ყინულივით ცივ მეტაფოსფორმჟავაში (5% w/v), შემდეგ ულტრაბგერითად დაამუშავეს ყინულზე VialTweeter ულტრაბგერითი მოწყობილობით, 50% ამპლიტუდაზე, 2 sec-ის ხანგრძლივობის 10 ულტრაბგერით ციკლად, ციკლებს შორის 30 sec პაუზით. შემდეგ ნიმუშები ცენტრიფუგირდა 12 000 rpm-ზე, 4°C-ზე, 15 min-ის განმავლობაში.
(იხ. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans ნიმუშების მომზადება იმუნოპრეციპიტაციისა და ვესტერნ ბლოტინგის წინ

მოკლედ, ემბრიონული ექსტრაქტებისთვის, C. elegans L1 ლარვები გაიზარდა მასშტაბურ თხევად S-საშუალო კულტურებში ზრდასრულ ასაკამდე. ემბრიონები შეგროვდა სტანდარტული ბლინინგის მეთოდით და გადანაწილდა ლიზის ბუფერში (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% გლიცეროლი, 0,05% NP-40, 1􏰅 პროტეაზის ინჰიბიტორების კოქტეილი და 1􏰅 ფოსფატაზის ინჰიბიტორების კოქტეილი I და II), სწრაფად გაიყინა თხევად აზოტში და დაიშალა ულტრაბგერითი უჯრედული დისრუპციის გზით ულტრაბგერითი პროცესორის გამოყენებით მიკროტიპით, როგორიცაა UP200Ht S26d2-ით 10 იმპულსის განმავლობაში 10 წმ-ის განმავლობაში 30% ამპლიტუდაზე. თუ უფრო მეტი რაოდენობის ნიმუშების მომზადებაა საჭირო, რეკომენდებულია ულტრაბგერითი VialTweeter ან MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP ფოსოებიანი პლანშეტებისთვის. ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ ექსტრაქტები წინასწარ გაიწმინდა ცენტრიფუგირებით 30 000g-ზე, 20 წთ-ის განმავლობაში, 4°C-ზე. წინასწარ გაწმენდილი ექსტრაქტი (300µg საერთო ცილა) ინკუბირდა 40µ􏰂g აფინურად გაწმენდილ ანტი-CDC-25.1 ანტისხეულთან (ეს კვლევა), რომელიც ჯვარედინი კავშირებით იყო დაკავშირებული A ცილა-აგაროზასთან; კონტროლად გამოიყენეს A ცილა-აგაროზასთან ჯვარედინი კავშირებით დაკავშირებული კურდღლის იმუნოგლობულინ (Ig)G-ის მსგავსი რაოდენობა. ინკუბაცია ჩატარდა ლიზისის ბუფერის 200µl საერთო მოცულობაში, რომელიც შეიცავდა 1% NP-40-ს; მისი დამატება ამცირებდა ცილების არასპეციფიკურ შეკავშირებას მატრიცასთან. ნიმუშებს აბრუნებდნენ 1 სთ-ის განმავლობაში 4°C-ზე, მარცვლები სამჯერ გაირეცხა ლიზისის ბუფერით და ელუირება ჩატარდა 30µl გლიცინის/HCl-ისა და 200 mM NaCl-ის ხსნარით, pH 2,2. იმუნოპრეციპიტაციის შემდეგ ელუატები განზავდა 30µ􏰂l SDS ნიმუშის ბუფერში და გაცხელდა 95°C-მდე 4 წთ-ის განმავლობაში. ჩვეულებრივ, SDS-PAGE-ზე იტვირთებოდა საწყისი ნიმუშის საერთო რაოდენობის 3% და ელუატების 30%, რასაც მოჰყვებოდა ვესტერნ ბლოტინგი ანტი-CDC-25.1 (1:400), ანტი-LIN-23 (1:750), ანტი-უბიქუიტინის (1:1000), ანტი-GSK3􏰁 (1:500) ან ანტი-􏰁β-აქტინის (1:2000) ანტისხეულებით. თუ ექსტრაქტებს იმუნოპრეციპიტაცია არ უტარდებოდა, ამ ექსტრაქტებიდან მიღებული საერთო ცილის იგივე რაოდენობა ხელახლა სუსპენდირდებოდა SDS ნიმუშის ბუფერში, ცხელდებოდა 95°C-მდე, შემდეგ პირდაპირ იტვირთებოდა SDS-PAGE-ზე და ანალიზდებოდა ვესტერნ ბლოტინგით. (იხ. Segref et al. 2020)

ულტრაბგერითი ლიზისი ტემპერატურის ზუსტი კონტროლის პირობებში

ტემპერატურის ზუსტი და საიმედო კონტროლი გადამწყვეტია ბიოლოგიურ ნიმუშებთან მუშაობისას. მაღალი ტემპერატურა ნიმუშებში ცილის თერმულად გამოწვეულ დეგრადაციას იწვევს.
როგორც ყველა მექანიკური ნიმუშის მომზადების ტექნიკა, ულტრაბგერითი დამუშავება სითბოს წარმოქმნის. თუმცა, ნიმუშების ტემპერატურის კარგად კონტროლი შესაძლებელია VialTweeter-ის გამოყენებისას. ჩვენ გთავაზობთ სხვადასხვა ვარიანტს თქვენი ნიმუშების ტემპერატურის მონიტორინგისა და კონტროლისთვის, VialTweeter-ისა და VialPress-ის გამოყენებით ანალიზისთვის მომზადებისას.

1. ნიმუშის ტემპერატურის მონიტორინგი: ულტრაბგერითი პროცესორი UP200St, რომელიც VialTweeter-ს ამუშავებს, აღჭურვილია ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფითა და მისაერთებელი ტემპერატურის სენსორით. შეაერთეთ ტემპერატურის სენსორი UP200St-თან და მოათავსეთ სენსორის წვერი ერთ-ერთ ნიმუშიან სინჯარაში. ციფრული ფერადი სენსორული ეკრანის მეშვეობით UP200St-ის მენიუში შეგიძლიათ დააყენოთ კონკრეტული ტემპერატურული დიაპაზონი ნიმუშის ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის. ულტრაბგერითი აპარატი ავტომატურად შეჩერდება მაქსიმალური ტემპერატურის მიღწევისას და შეჩერებული დარჩება, სანამ ნიმუშის ტემპერატურა დაყენებული ტემპერატურული დიაპაზონის ∆ ქვედა ზღვრამდე არ დაიწევს. შემდეგ ულტრაბგერითი დამუშავება ავტომატურად განახლდება. ეს ინტელექტუალური ფუნქცია ხელს უშლის სითბოთი გამოწვეულ დეგრადაციას.
2. VialTweeter-ის ბლოკი შეიძლება წინასწარ გაგრილდეს. ტიტანის ბლოკის წინასწარ გასაგრილებლად მოათავსეთ VialTweeter-ის ბლოკი (მხოლოდ სონოტროდი, გარდამქმნელის გარეშე!) მაცივარში ან საყინულეში, რაც ნიმუშში ტემპერატურის მატებას შეაყოვნებს. შესაძლებლობის შემთხვევაში თავად ნიმუშიც შეიძლება წინასწარ გაგრილდეს.
3. გამოიყენეთ მშრალი ყინული ულტრაბგერითი დამუშავების დროს გასაგრილებლად. გამოიყენეთ მშრალი ყინულით სავსე არაღრმა ლანგარი და მოათავსეთ VialTweeter მშრალ ყინულზე ისე, რომ სითბო სწრაფად გაიფანტოს.

იპოვეთ ოპტიმალური ულტრაბგერითი უჯრედების დამშლელი თქვენი ლიზის აპლიკაციისთვის

Hielscher Ultrasonics არის მაღალი წარმადობის ულტრაბგერითი უჯრედების დამშლელებისა და ჰომოგენიზატორების წარმოებაში ხანგრძლივი გამოცდილების მქონე მწარმოებელი ლაბორატორიული, მაგიდაზე დასადგმელი და სამრეწველო მასშტაბის სისტემებისთვის. თქვენი ბაქტერიული უჯრედული კულტურის ზომა, თქვენი კვლევითი ან საწარმოო მიზანი და საათში ან დღეში დასამუშავებელი უჯრედების მოცულობა მნიშვნელოვანი ფაქტორებია თქვენი ამოცანისთვის შესაბამისი ულტრაბგერითი უჯრედების დამშლელის შესარჩევად.
Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ სხვადასხვა გადაწყვეტას მრავალი ნიმუშის (10-მდე ვიალი) და დიდი რაოდენობის ნიმუშების (მაგ., მიკროტიტრული ფირფიტები / 96-ფოსოიანი ფირფიტები) ერთდროული ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის: კლასიკური ზონდური ტიპის ლაბორატორიული ულტრაბგერითი აპარატებიდან, რომელთა სიმძლავრე 50-დან 400 ვატამდეა, სამრეწველო ულტრაბგერით პროცესორებამდე, რომელთა სიმძლავრე ერთეულზე 16 000 ვატამდეა და რომლებიც განკუთვნილია ფართომასშტაბიან წარმოებაში უჯრედების კომერციული დაშლისა და ცილების ექსტრაქციისთვის. Hielscher-ის ყველა ულტრაბგერითი აპარატი შექმნილია სრული დატვირთვით 24/7/365 მუშაობისთვის. გამძლეობა და საიმედოობა ჩვენი ულტრაბგერითი მოწყობილობების ძირითადი თვისებებია.
ყველა ციფრული ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი აღჭურვილია ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფით, ფერადი სენსორული ეკრანითა და მონაცემთა ავტომატური აღრიცხვის ფუნქციით, რაც ულტრაბგერით მოწყობილობას მოსახერხებელ სამუშაო ინსტრუმენტად აქცევს ლაბორატორიებსა და საწარმოებში.
გვითხარით, რა ტიპის უჯრედები, რა მოცულობა, რა სიხშირით და რა მიზნით უნდა დაამუშაოთ თქვენი ბიოლოგიური ნიმუშები. ჩვენ გირჩევთ ყველაზე შესაფერის ულტრაბგერით უჯრედების დამშლელს თქვენი პროცესის მოთხოვნებისთვის.

ქვემოთ მოცემული ცხრილი გაძლევთ წარმოდგენას ჩვენი ულტრაბგერითი სისტემების მიახლოებითი დამუშავების შესაძლებლობებზე კომპაქტური ხელის ჰომოგენიზატორებიდან და MultiSample ულტრაბგერითი გენერატორებიდან სამრეწველო ულტრაბგერით პროცესორებამდე კომერციული აპლიკაციებისთვის: