ცილის ულტრაბგერითი ექსტრაქცია ქსოვილებიდან და უჯრედული კულტურებიდან
- ცილის ექსტრაქცია არის ნიმუშის მომზადების აუცილებელი ეტაპი პროტეომიკაში.
- ცილების ექსტრაქცია შეიძლება მოხდეს მცენარეული და ცხოველური ქსოვილებიდან, საფუარებიდან და მიკროორგანიზმებიდან.
- ულტრაბგერითი დამუშავება არის საიმედო, ეფექტური ცილის ექსტრაქციის მეთოდი, რომელიც უზრუნველყოფს ცილის მაღალ გამოსავლიანობას მოკლე ექსტრაქციის დროში.
ცილის ექსტრაქცია ქსოვილებიდან და უჯრედებიდან
ცილის ექსტრაქცია ქსოვილებიდან და კულტივირებული უჯრედებიდან არის ნიმუშის მომზადების აუცილებელი ეტაპი, რომელიც სრულდება ბევრ ბიოქიმიურ და ანალიტიკურ ტექნიკაში, როგორიცაა ELISA, PAGE, ვესტერნ ბლოტინგი, მას-სპექტრომეტრია ან ცილის გასუფთავება. ულტრაბგერითი უჯრედული დისრუფცია, ლიზისი და ექსტრაქცია არის ზუსტად კონტროლირებადი, არათერმული ტექნიკა ცილის მაღალი გამოსავლიანობის უზრუნველსაყოფად.
ცილის ექსტრაქცია უჯრედებიდან ულტრაბგერითი ზონდის UP200St-ის გამოყენებით
- სწრაფი
- მაღალი გამოსავლიანობა
- ძალიან ეფექტური
- პარამეტრების ზუსტი კონტროლი
- განმეორებადი შედეგები
- ლინეარული მასშტაბირებადობა
ზოგადი ინსტრუქციები ულტრაბგერითი ლიზისისა და ცილის ექსტრაქციისთვის
- ტემპერატურის კონტროლი: ცილის მაღალი გამოსავლიანობის უზრუნველსაყოფად თერმული დენატურაციის გარეშე, ექსტრაქციის დროს ტემპერატურა უნდა კონტროლდებოდეს. Hielscher-ის თანამედროვე ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები – ასევე ცნობილი როგორც ულტრაბგერითი დისინტეგრატორები ან ულტრაბგერითი დამუშავების აპარატები – ზუსტად კონტროლირებადია. მათ მოჰყვება მიერთებადი ტემპერატურის სენსორი. ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორის პარამეტრებში შესაძლებელია მაქსიმალური ტემპერატურის დაყენება. ამ მაქსიმალური ტემპერატურის მიღწევისას ულტრაბგერითი აპარატი ავტომატურად ჩერდება, სანამ ნიმუში არ გაგრილდება.
- ბუფერი: შესაფერისი ბუფერისა და მისი მოცულობის შერჩევა ქსოვილის ტიპზეა დამოკიდებული და ცდისა და შეცდომის მეთოდით უნდა მოხდეს.
- იზოლაცია / გასუფთავება: ცილის ლიზატები შეიძლება შეიცავდეს ბიომოლეკულების ჭარბ რაოდენობას, როგორიცაა DNA ან ნახშირწყლები, რომელთა მოცილებაც შესაძლებელია ცილის პრეციპიტაციით (დეზოქსიქოლატი–ტრიქლორძმარმჟავა) ან ბუფერის შეცვლით.
Chittapalo და Noomhorm (2009) თავიანთ კვლევაში აღნიშნავენ, რომ ულტრაბგერითი დამუშავების გამოყენებით ცილის გამოსავლიანობა გაიზარდა და რომ ქსოვილის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზაციისა და ლიზისის პროცესს შეუძლია მნიშვნელოვნად გააუმჯობესოს არსებული ექსტრაქციის პროცესები – რაც კომერციული ექსტრაქციის ახალ შესაძლებლობებს ქმნის.
ულტრაბგერითი CupHorn რამდენიმე ნიმუშის ერთდროული, მაღალეფექტური მომზადებისთვის იმავე პირობებში ცილის იზოლაციისა და DNA-ს ფრაგმენტაციისთვის.
ცილის ექსტრაქცია ცხოველური ქსოვილიდან
მთლიანი ქსოვილის მოსამზადებლად (მაგ. თირკმელი, გული, ფილტვი, კუნთი და ა.შ.), ქსოვილი სუფთა ინსტრუმენტებით უნდა დაიჭრას ძალიან მცირე ნაწილებად, სასურველია ყინულზე და რაც შეიძლება სწრაფად, რათა თავიდან იქნეს აცილებული პროტეაზებით დაშლა (მაგ. ლიზისის ბუფერი, როგორიცაა RIPA ან ჰიპოტონური ლიზისის ბუფერი, რომელიც შეიცავს პროტეაზისა და ფოსფატაზის ინჰიბიტორების კოქტეილს). დაჭრის შემდეგ ნიმუში მყისიერი გაყინვისთვის თხევად აზოტში იძირება. ნიმუში შეიძლება შეინახოს -80°C-ზე შემდგომი გამოყენებისთვის ან დარჩეს ყინულზე დაუყოვნებელი ჰომოგენიზაციისთვის. უშუალოდ ულტრაბგერითი ექსტრაქციის წინ ნიმუშის სინჯარაში სწრაფად ემატება ყინულივით ცივი ლიზისის ბუფერი (პროტეაზის ინჰიბიტორებით DTT, ლეუპეპტინითა და აპროტინინით). ყოველ ~10 mg ქსოვილზე რეკომენდებულია დაახლოებით ~600 μL ბუფერი. თითოეული სინჯარისთვის რეკომენდებულია დაახლოებით 20-60mg ქსოვილი.
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზაცია, ლიზისი და ექსტრაქცია ხორციელდება ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორით, როგორიცაა UP100H ან UP200Ht, აღჭურვილი მიკრო-წვერის სონოტროდით. ულტრაბგერითი დამუშავების ხანგრძლივობაა 60-90 წმ. ულტრაბგერითი ციკლური რეჟიმით 15 წმ. ულტრაბგერითი დამუშავება და 10 წმ. დასვენების დრო. ნიმუში მთელი დროის განმავლობაში უნდა ინახებოდეს ყინულში.
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზაციის / ექსტრაქციის შემდეგ, ლიზატი ცენტრიფუგირდება 27 000g-ზე დაახლოებით 20 წთ. შემდეგ ზედა ფენა (სუპერნატანტი) იკრიბება, რათა ცილის კონცენტრაცია განისაზღვროს ცილის ანალიზით, როგორიცაა Pierce ცილის ანალიზი BCA.
ცილის ექსტრაქცია სისხლის შრატიდან
შრატისა და ფოსფატური ბუფერის ერთგვაროვანი ნარევის მისაღებად ნიმუში ულტრაბგერითი უჯრედული ლიზისის წინ ჯერ ვორტექსით ირევა. ულტრაბგერითი ლიზისისთვის ნიმუში მუშავდება ლაბორატორიული ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორით, როგორიცაა UP100H, 8 ციკლის განმავლობაში 20% ამპლიტუდით; თითოეულ ციკლში აპარატი 5 წამით ირთვება და 15 წამით ითიშება. ცილების ექსტრაქცია ხორციელდება ციკლური ულტრაბგერითი დამუშავებით (პულსაციის რეჟიმში) და ნიმუშის ყინულზე მოთავსებით, რათა თავიდან იქნეს აცილებული ნიმუშის გადახურება და თერმული დაშლა. რადგან შრატი შეიცავს მაღალი მოლეკულური მასის ცილების დიდ რაოდენობას (როგორიცაა ალბუმინი, α1-ანტიტრიფსინი, ტრანსფერინი, ჰაპტოგლობულინი, იმუნოგლობულინი G და იმუნოგლობულინი A), რომლებიც ხელს უშლის დაბალი მოლეკულური მასის ცილების გამოყოფას IEF-ის დროს, რეკომენდებულია მათი მოცილება შრატიდან შესაბამისი მოსაცილებელი სვეტის გამოყენებით.
ცილების ექსტრაქცია მცენარეული ქსოვილიდან
ახალი, რბილი მცენარეული ქსოვილი, მაგ. ხავსი და ა.შ., ადვილად შეიძლება დაიშალოს ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის დაჭრილი ნიმუშის ლიზისის ბუფერში მოთავსებით. მკვრივი, გახევებული მცენარეული ქსოვილები, როგორიცაა თესლი, სოჭის წიწვები და ა.შ., მშრალად უნდა დაიფქვას. ზოგიერთი მაგარი, გახევებული მცენარეული მასალა ულტრაბგერითი ექსტრაქციის წინ თხევად აზოტში უნდა გაიყინოს და დაიფქვას. მცენარეული უჯრედების კულტურის სუსპენზიებისთვის ლიზისის ბუფერში 30-დან 150 წამამდე ულტრაბგერითი დამუშავება, როგორც წესი, საკმარისია. უფრო მკვრივი მასალა, როგორიცაა გოგრის თესლი, მოითხოვს უფრო ინტენსიურ ულტრაბგერით დამუშავებას, როგორც ქვემოთ არის აღწერილი.
გოგრის თესლიდან ალბუმინის ულტრაბგერითი ექსტრაქციის პროტოკოლი
წვრილად დაფქული გოგრის თესლიდან ალბუმინის ულტრაბგერითი ექსტრაქციისთვის 250mL მინის ჭიქაში ემატება 10 g ცხიმგამოცლილი გოგრის თესლის ფხვნილი და გამხსნელის სახით 100 mL დეიონიზებული წყალი. ცილის ექსტრაქცია შედგება ორი ეტაპისგან: თავდაპირველად ნიმუში ულტრაბგერით მუშავდება ზონდური ტიპის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორით UP400St (400W, 24kHz), რომელიც აღჭურვილია სონოტროდით S24d7. ულტრაბგერითი ჰომოგენიზაციის დროს მინის ჭიქა მოთავსებულია ცივი წყლის აბაზანაში. ულტრაბგერითი აპარატის UP400St მიერთებადი ტემპერატურის სენსორი და ტემპერატურის კონტროლის პარამეტრები უზრუნველყოფს, რომ ნიმუშის ტემპერატურა ყოველთვის 30°C-ზე დაბალი დარჩეს. ულტრაბგერითი დამუშავების დროს ტემპერატურის ზუსტი კონტროლი თავიდან აცილებს ალბუმინის დენატურაციას. მეორე ეტაპზე ექსტრაქცია ხორციელდება მიქსერით 200 rpm სიჩქარით და 30°C-ზე. შემდეგ ჭიქა გადააქვთ თერმოსტატირებულ შემანჯღრევ აპარატში. გლობულინი მოცილდება დისტილირებული წყლით დიალიზის გზით. გლობულინის მოცილების შემდეგ ცილის ექსტრაქტიდან შეიძლება ნიმუშის აღება ალბუმინის პროფილის დასადგენად, რის შემდეგაც ალბუმინის კოაგულაციისთვის 0,1 M HCl-ის გამოყენებით pI=3,0-მდე ხდება დაყვანა. მყარი ფაზა გამოიყოფა ცენტრიფუგირებით 5000g-ზე, 20°C-ზე და ხელახლა იხსნება დეიონიზებულ წყალში. ალბუმინის კოაგულაცია ტარდება ორჯერ, რათა გაიზარდოს ცილის წილი ალბუმინის კონცენტრატში.
ბრინჯის ქატოდან ცილის კონცენტრატის მოსამზადებლად ცილის ულტრაბგერითი ტუტე ექსტრაქცია აჩვენებს, რომ ულტრაბგერითი დამუშავება უზრუნველყოფს ცილის უფრო მაღალ გამოსავლიანობას მნიშვნელოვნად მოკლე ექსტრაქციის დროში – ტრადიციულ ექსტრაქციის მეთოდებთან შედარებით.
ფუნქციური iNOS ფერმენტისთვის ნიმუშის მომზადების პროტოკოლი
სრულად ფუნქციური iNOS ფერმენტის მისაღებად (მაგ. წამლების სკრინინგისთვის) რეკომენდებულია შემდეგი პროტოკოლი: უჯრედული სუსპენზია უნდა მოთავსდეს ყინულზე და დამუშავდეს UP100H-ით 10µm ამპლიტუდით, ციკლურ რეჟიმში, 5 წამიანი ულტრაბგერითი დამუშავებით და ყინულზე 25 წამიანი პაუზით. პროცედურა უნდა განმეორდეს დაახლოებით 3-ჯერ. ულტრაბგერითი დამუშავების ციკლებს შორის პაუზა ამცირებს ტემპერატურის მატებას და, შესაბამისად, დენატურაციის რისკს.
ცილების ულტრაბგერითი ხსნადობის გაზრდა
ულტრაბგერითმა დამუშავებამ შეიძლება დააჩქაროს ცილების გახსნის პროცესი, რომელსაც ჩვეულებრივ რამდენიმე საათი სჭირდება. იმისათვის, რომ ნიმუში არ გადახურდეს და შარდოვანას შემცველ ხსნარებში თავიდან იქნეს აცილებული ცილების დაშლა და მოდიფიკაციები, ულტრაბგერითი იმპულსები რამდენიმე წამზე მეტხანს არ უნდა გაგრძელდეს.
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი UP200Ht 2mm მიკროწვერით S26d2 მცირე ნიმუშების ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის.
ულტრაბგერითი აპარატურა ცილოვანი ექსტრაქციისთვის
Hielscher Ultrasonics სთავაზობს ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების ფართო დიაპაზონს უჯრედების, ქსოვილების, ბაქტერიების, მიკროორგანიზმების, საფუარისა და სპორების დესტრუქციისთვის.
Hielscher-ის ლაბორატორიული ულტრაბგერითი აპარატები მძლავრი და მარტივად გამოსაყენებელია. ისინი შექმნილია 24/7 რეჟიმში მუშაობისთვის და წარმოადგენს გამძლე და ეფექტურ ლაბორატორიულ და სამუშაო მაგიდაზე დასადგმელ მოწყობილობებს. ყველა მოწყობილობის ენერგიის გამომუშავება და ამპლიტუდა ზუსტად კონტროლდება. აქსესუარების ფართო არჩევანი დამატებითი კონფიგურაციის შესაძლებლობებს იძლევა. ციფრულ ულტრაბგერით აპარატებს, როგორიცაა VialTweeter, UP200Ht, UP200St და UP400St, აქვს ტემპერატურის ინტეგრირებული კონტროლი და ჩაშენებული SD ბარათი მონაცემთა ავტომატური ჩაწერისთვის.
ინდირექტული, ჯვარედინი კონტამინაციის გარეშე და მრავალი ნიმუშის ერთდროული ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის, ჩვენ გთავაზობთ VialTweeter-ს ან ულტრაბგერით CupHorn-ს.
ქვემოთ მოცემული ცხრილი გაგიცნობთ ჩვენს ულტრაბგერით აპარატებს ნიმუშების მომზადების, უჯრედების დესტრუქციისა და ექსტრაქციისთვის. დააჭირეთ მოწყობილობის ტიპს, რათა მიიღოთ მეტი ინფორმაცია თითოეული ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორის შესახებ. ჩვენი კარგად მომზადებული და მრავალწლიანი გამოცდილების მქონე ტექნიკური პერსონალი სიამოვნებით დაგეხმარებათ თქვენთვის ყველაზე შესაფერისი ულტრაბგერითი აპარატის შერჩევაში ნიმუშების მომზადებისთვის!
| პარტიის მოცულობა | მოცულობითი ხარჯი | რეკომენდებული მოწყობილობები |
|---|---|---|
| 10 ფლაკონამდე ან სინჯარამდე | n.a. | VialTweeter |
| მრავალკაპიანი / მიკროტიტრული თეფშები | n.a. | UIP400MTP |
| მრავალი სინჯარა / ჭურჭელი | n.a. | CupHorn |
| 1-დან 500mL-მდე | 10-დან 200mL/min-მდე | UP100H |
| 10-დან 1000mL-მდე | 20-დან 200mL/min-მდე | UP200Ht, UP200St |
| 10-დან 2000mL-მდე | 20-დან 400mL/min-მდე | UP400St |
თქვენს გამოყენებაზე, მასალასა და ნიმუშის მოცულობაზე დაყრდნობით, ჩვენ დაგირჩევთ ყველაზე შესაფერის კონფიგურაციას თქვენი ნიმუშების მომზადებისთვის. დაგვიკავშირდით დღესვე!
დაგვიკავშირდით! / დაგვისვით!
Hielscher-ის ციფრული ულტრაბგერითი აპარატები აქვთ ბრაუზერული დისტანციური მართვა და ავტომატური მონაცემთა პროტოკოლირება ინტეგრირებულ SD ბარათზე.
VialTweeter ინდირექტული ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის.
ცნობისმოყვარეობის ღირსი ფაქტები
პროტეომიკა
პროტეომიკა არის სამეცნიერო მიმართულება, რომელიც იკვლევს ცილებს და პროტეომს. ცილები ასრულებენ სიცოცხლისთვის მნიშვნელოვანი ფუნქციების უზარმაზარ სპექტრს ორგანიზმებში. პროტეომი არის ცილების სრული ნაკრები, რომლებიც ექსპრესირდება გენომის, უჯრედის, ქსოვილის ან ორგანიზმის მიერ გარკვეულ დროს. პროტეომი იცვლება დროთა განმავლობაში და განსხვავებული მოთხოვნილებების ან სტრესების მიხედვით, რომლებსაც უჯრედი ან ორგანიზმი განიცდის. უფრო კონკრეტულად, ეს არის ექსპრესირებული ცილების ნაკრები უჯრედის ან ორგანიზმის მოცემული ტიპისთვის, მოცემულ დროს, განსაზღვრულ პირობებში. ტერმინი არის ცილებისა და გენომის შერწყმა. პროტეომიკა არის პროტეომის შესწავლა.
ცილა
ცილები არის დიდი ბიომოლეკულები, ე.წ. მაკრომოლეკულები – რომლებიც შედგება ამინომჟავური ნაშთების ერთი ან მეტი გრძელი ჯაჭვისგან. ცილები წარმოდგენილია მცენარეული და ცხოველური წარმოშობის ყველა ორგანიზმში და ისინი გადამწყვეტია ბიოლოგიური ფუნქციების უმეტესობისთვის. რადგან ცილები შეიცავენ ბევრ ბიოლოგიურ ინფორმაციას, ისინი ექსტრაქციას ექვემდებარებიან ანალიტიკური მიზნებისთვის, მაგ. პროტეომიკული კვლევებისთვის. ცილების მიერ შესრულებული ყველაზე მნიშვნელოვანი ფუნქციები მოიცავს მეტაბოლური რეაქციების კატალიზს, დნმ-ის რეპლიკაციას, სტიმულებზე რეაგირებას და მოლეკულების ტრანსპორტირებას ერთი ადგილიდან მეორეზე. ცილები ერთმანეთისგან ძირითადად განსხვავდებიან ამინომჟავების თანმიმდევრობით, რომელიც განისაზღვრება მათი გენების ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობით და რომელიც ჩვეულებრივ იწვევს ცილის დახვევას კონკრეტულ სამგანზომილებიან სტრუქტურაში, რომელიც განსაზღვრავს მის აქტივობას. ცილები არის – პეპტიდების გარდა – საკვების ერთ-ერთი მთავარი კომპონენტი. ამიტომ, პროტეომიკა არის მძლავრი ინსტრუმენტი საკვების მეცნიერებაში პროცესების, საკვების უსაფრთხოებისა და კვებითი შეფასების ოპტიმიზაციისთვის.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction არის წინაანალიტიკური პროცედურა ანალიტების გამოსაყოფად და წინასწარ კონცენტრაციისთვის. ულტრაბგერით დამუშავებასთან კომბინაციაში, ღრუბლის წერტილის ექსტრაქცია შეიძლება გაძლიერდეს, რაც პროცესს უფრო ეფექტურს, სწრაფს და ეკოლოგიურად სუფთას ხდის. ულტრაბგერითი დამუშავებით, ღრუბლის წერტილის ექსტრაქცია არის ანალიტების მომზადების მნიშვნელოვნად უფრო ეფექტური მეთოდი. წაიკითხეთ მეტი ულტრაბგერითი დახმარებით ღრუბლის წერტილის ექსტრაქციის შესახებ!
გელ-ელექტროფორეზი
გელ-ელექტროფორეზი არის მაკრომოლეკულების, როგორიცაა დნმ, რნმ და ცილები, ასევე მათი ფრაგმენტების, ზომისა და მუხტის მიხედვით გამიჯვნისა და ანალიზის ძირითადი მეთოდი. ის გამოიყენება კლინიკურ ქიმიაში ცილების მუხტისა და/ან ზომის მიხედვით გამოსაყოფად (IEF აგაროზა, პრაქტიკულად ზომაზე დამოუკიდებელი), ხოლო ბიოქიმიაში, მოლეკულურ ბიოლოგიასა და პროტეომიკაში – დნმ-ისა და რნმ-ის ფრაგმენტების შერეული პოპულაციის სიგრძის მიხედვით გამოსაყოფად, დნმ-ისა და რნმ-ის ფრაგმენტების ზომის შესაფასებლად ან ცილების მუხტის მიხედვით გამოსაყოფად.
უჯრედული კულტურები
უჯრედული კულტურა არის კონტროლირებადი ზრდის პროცესი, რომლის დროსაც უჯრედები კონტროლირებად პირობებში კულტივირდება. უჯრედული კულტურის პირობები განსხვავდება თითოეული უჯრედის ტიპისთვის. ზოგადად, უჯრედული კულტურის გარემო შედგება შესაბამისი ჭურჭლისგან (მაგ. პეტრის თეფში) სუბსტრატით ან საკვები გარემოთი, რომელიც უზრუნველყოფს აუცილებელ ნუტრიენტებს (ამინომჟავები, ნახშირწყლები, ვიტამინები, მინერალები), ზრდის ფაქტორებს, ჰორმონებს და აირებს (CO2, O2), და აკონტროლებს ფიზიკურ-ქიმიურ გარემოს (pH ბუფერი, ოსმოსური წნევა, ტემპერატურა). უჯრედების უმეტესობას სჭირდება ზედაპირი ან ხელოვნური სუბსტრატი, მაგრამ სხვა უჯრედული კულტურები შეიძლება კულტივირდეს საკვებ გარემოში თავისუფლად შეტივტივებულ მდგომარეობაში (სუსპენზიური კულტურა, უჯრედული სუსპენზია).
ცხოველური უჯრედული ხაზების მასობრივი კულტურები გამოიყენება ვირუსული ვაქცინებისა და სხვა ბიოტექნოლოგიურად მიღებული პროდუქტების სამრეწველო წარმოებაში. ადამიანის ღეროვანი უჯრედები კულტივირდება უჯრედების რაოდენობის გასაზრდელად და უჯრედების სხვადასხვა სომატურ უჯრედულ ტიპებად დიფერენციაციისთვის, ტრანსპლანტაციის მიზნით.
ქსოვილის ნიმუშები
ტერმინი ქსოვილი აღწერს უჯრედულ შუალედურ მდგომარეობას, სადაც უჯრედული მასალა ორგანიზაციული თვალსაზრისით უჯრედებსა და სრულ ორგანოს შორის მდებარეობს. ქსოვილში ერთმანეთთან შეკრებილია მსგავსი უჯრედები, რომლებიც ერთი და იმავე წარმოშობისაა და ერთად ასრულებენ კონკრეტულ ფუნქციას. მრავალი ქსოვილის ფუნქციური დაჯგუფებით ფორმირდება ორგანოების რთული სტრუქტურები.
ქსოვილის ნიმუშები აიღება კვლევისთვის ბიოლოგიაში, ჰისტოლოგიაში/ჰისტოპათოლოგიაში, პარაზიტოლოგიაში, ბიოქიმიაში, იმუნოჰისტოქიმიაში, ასევე დნმ-ის კულტივირებისა და ექსტრაქციის მიზნით. განასხვავებენ ცხოველურ (ქვეჯგუფი: ძუძუმწოვრების ქსოვილი) და მცენარეულ ქსოვილს. ცხოველური ქსოვილები იყოფა ოთხ ძირითად ტიპად: შემაერთებელი, კუნთოვანი, ნერვული და ეპითელიური ქსოვილი. მცენარეული ქსოვილი იყოფა შემდეგ სამ ქსოვილოვან სისტემად: ეპიდერმისი, ძირითადი ქსოვილი და გამტარი ქსოვილი.
ქსოვილის ნიმუშები შეიძლება მომზადდეს ცხოველური ან მცენარეული ნაწილებისგან, მაგ. ძვალი, კუნთი, ფოთლები და ა.შ.
სხეულის სითხეები
სისხლი, სერუმი, პლაზმა, ცერებროსპინალური სითხე, ნერწყვი და სინოვიური სითხე არის სხეულის სითხეები, რომლებიც წარმოადგენენ დიდი რაოდენობით დიაგნოსტიკურად მნიშვნელოვანი ინფორმაციის წყაროს. ამიტომ, ანალიზისთვის სხეულის სითხის ნიმუშების დახვეწილი მომზადება მნიშვნელოვანია. პირველი სირთულე დაკავშირებულია სხეულის სითხეებში არსებული კომპონენტების ფართო დინამიურ დიაპაზონთან.
ცილის კონცენტრაციის დადგენა
ბრედფორდის ანალიზი, ლოურის ანალიზი და ბიკინჩონინის მჟავას (BCA) ანალიზი არის ცილების კონცენტრაციის დასადგენად ხშირად გამოყენებადი ანალიზები. ძროხის სერუმის ალბუმინი (BSA) არის ერთ-ერთი ყველაზე ხშირად გამოყენებადი ცილის სტანდარტი.
ლიზის ბუფერი
ლიზის ბუფერი უნდა შეირჩეს უჯრედული მასალის ან ქსოვილის (ქსოვილოვანი კულტურა, მცენარე, ბაქტერია, სოკო და ა.შ.) შესაბამისად, ასევე იმის მიხედვით, არის თუ არა უჯრედები სტრუქტურაში და რა ტიპის სტრუქტურაა. ცილების, მემბრანებისა და ორგანელების ექსტრაქციისთვის ლიზის ბუფერების ფართო დიაპაზონი ფორმულირდება ერთი ან მეტი დეტერგენტით. დეტერგენტი ჩვეულებრივ შეირჩევა ცდა-შეცდომის მეთოდით ან – თუ არსებობს – არსებული ცილების ექსტრაქციის პროტოკოლის შესაბამისად. დეტერგენტი უნდა იყოს თავსებადი ქსოვილის წყაროსა და ცილებთან. ზოგადად, ირჩევა ყველაზე მსუბუქი დეტერგენტი, რომელიც მუშაობს კონკრეტული ქსოვილის / ცილისთვის, რათა შენარჩუნდეს ექსტრაქტის მაქსიმალური ფუნქციონირება. გარდა ამისა, მემბრანებისა და ორგანელების ექსტრაქციის შემთხვევაში, მსუბუქი დეტერგენტი ინარჩუნებს მემბრანის მთლიანობას. ლიზის ბუფერებში ხშირად გამოყენებული დეტერგენტები ძირითადად არაიონური ან ცვიტერიონულია, მაგ. CHAPS, დეოქსიქოლატი, Triton™ X-100, NP40 და Tween 20.
მაგალითად, ისეთი ქსოვილები, როგორიცაა ტვინი, ღვიძლი, ნაწლავი, თირკმელი, ელენთა და ა.შ., შეიძლება უბრალოდ დამუშავდეს RIPA-თი – თუმცა უნდა იყოს დამატებული პროტეაზის ინჰიბიტორები და DTT (მაგ. გელის ელექტროფორეზისთვის).
ლიზის ბუფერი ჩონჩხის კუნთის ქსოვილისთვის (ყინულოვანი): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) გლიცეროლი, 1 mM EDTA, 1 mM დითიოთრეიტოლი, დამატებული პროტეაზისა და ფოსფატაზის ინჰიბიტორების კოქტეილით
ხშირად გამოყენებული ბუფერებისა და მათი pH დიაპაზონის ცხრილი. ზოგადად, ეს ბუფერები ჩვეულებრივ გამოიყენება 20-50 mM კონცენტრაციებში.
| ბუფერი | pH დიაპაზონი |
|---|---|
| ლიმონმჟავა – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| ნატრიუმის ციტრატი – ლიმონმჟავა | 3,0 – 6,2 |
| ნატრიუმის აცეტატი – ძმარმჟავა | 3,6 – 5,6 |
| კაკოდილმჟავას ნატრიუმის მარილი – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| ნატრიუმის დიჰიდროგენფოსფატი – დინატრიუმის ჰიდროგენფოსფატი | 5,8 – 8,0 |
| იმიდაზოლი – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| ტრიეთანოლამინის ჰიდროქლორიდი – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricine – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| ნატრიუმის ტეტრაბორატი – ბორმჟავა | 7,6 – 9,2 |
| Bicine – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| გლიცინი – NaOH | 8,6 – 10,6 |
ბუფერების უმეტესობა აჩვენებს pH-დამოკიდებულებას ტემპერატურასთან. ეს განსაკუთრებით მართებულია Tris ბუფერებისთვის. pKa იცვლება 8,06-დან 25°C-ზე 8,85-მდე 0°C-ზე.
(ბუფერის pH და pKa: pH ზომავს წყალბადის იონების კონცენტრაციას წყალხსნარში. pKa (= მჟავას დისოციაციის მუდმივა) არის დაკავშირებული, მაგრამ უფრო კონკრეტული ზომა, რადგან ის გვეხმარება პროგნოზირებაში, თუ როგორ იმოქმედებს მოლეკულა კონკრეტულ pH მნიშვნელობაზე.)
TRIzol
TRIzol არის ქიმიური ხსნარი, რომელიც გამოიყენება RNA/DNA/ცილის ექსტრაქციისთვის გუანიდინიუმ თიოციანატ-ფენოლ-ქლოროფორმის ექსტრაქციის დროს. ულტრაბგერითი დახმარებით TRIzol ექსტრაქციის გამოყენება იძლევა DNA, RNA და ცილის მაღალ გამოსავლიანობას იმავე ნიმუშიდან და ამით აღემატება სხვა ექსტრაქციის მეთოდებს.
ლიტერატურა/რეფერენციები
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.