ულტრაბგერითი პროტეინის ექსტრაქცია ქსოვილისა და უჯრედული კულტურებიდან
- პროტეინის ექსტრაქცია არის ნიმუშის მომზადების აუცილებელი ეტაპი პროტეომიკაში.
- ცილების მოპოვება შესაძლებელია მცენარეული და ცხოველური ქსოვილისგან, საფუარისა და მიკროორგანიზმებისგან.
- Sonication არის საიმედო, ეფექტური ცილის მოპოვების მეთოდი, რომელიც იძლევა ცილის მაღალ მოსავალს მოკლე ექსტრაქციის დროს.
პროტეინის ექსტრაქცია ქსოვილებიდან და უჯრედებიდან
პროტეინის ექსტრაქცია ქსოვილებიდან და კულტივირებული უჯრედებიდან არის ნიმუშის მომზადების აუცილებელი ეტაპი, რომელიც ხორციელდება მრავალი ბიოქიმიური და ანალიტიკური ტექნიკის დროს, როგორიცაა ELISA, PAGE, Western blotting, მასის სპექტრომეტრია ან ცილის გაწმენდა. ულტრაბგერითი უჯრედების დაშლა, ლიზისი და ექსტრაქცია არის ზუსტად კონტროლირებადი, არათერმული ტექნიკა ცილების მაღალი მოსავლიანობის უზრუნველსაყოფად.
ცილის მოპოვება უჯრედებიდან ულტრაბგერითი ზონდი UP200St
- სწრაფი
- მაღალი მოსავლიანობა
- უაღრესად ეფექტური
- ზუსტი კონტროლი პარამეტრებზე
- განმეორებადი შედეგები
- ხაზოვანი მასშტაბირება
ზოგადი ინსტრუქციები ულტრაბგერითი ლიზისისა და ცილის ექსტრაქციისთვის
- Ტემპერატურის კონტროლი: ცილის მაღალი მოსავლიანობის უზრუნველსაყოფად თერმული დენატურაციის გარეშე, ექსტრაქციის დროს ტემპერატურა უნდა იყოს კონტროლირებადი. Hielscher-ის უახლესი ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები – ასევე მოუწოდა ულტრაბგერითი დეზინტეგრატორი ან ულტრაბგერითი – ზუსტად კონტროლირებადია. მათ მოჰყვება ჩართული ტემპერატურის სენსორი. ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორის დაყენების პარამეტრებში შესაძლებელია მაქსიმალური ტემპერატურის დაყენება. როდესაც ეს ტემპერატურა მაქსიმუმს მიაღწევს, ულტრაბგერითი ავტომატურად ჩერდება, სანამ ნიმუში არ გაცივდება.
- ბუფერი: შესაფერისი ბუფერისა და ბუფერის სწორი მოცულობის არჩევა ქსოვილიდან ქსოვილში განსხვავებულია და უნდა გაირკვეს საცდელი და შეცდომის ტესტირებით.
- იზოლაცია / გაწმენდა: ცილის ლიზატები შეიძლება შეიცავდეს ჭარბი ბიომოლეკულებს, როგორიცაა დნმ ან ნახშირწყლები, რომლებიც შეიძლება მოიხსნას ცილის ნალექით (დეოქსიქოლატ-ტრიქლოროძმარმჟავა) ან ბუფერული გაცვლით.
Chittapalo-მ და Noomhorm-მა (2009) თავიანთ კვლევაში განაცხადეს, რომ ცილის მოსავლიანობა გაიზარდა სონიკაციის გამოყენებით და რომ ულტრაბგერითი ქსოვილის ჰომოგენიზაციისა და ლიზისის პროცესს შეუძლია მნიშვნელოვნად გააძლიეროს არსებული ექსტრაქციის პროცესები. – ახალი კომერციული მოპოვების შესაძლებლობების შესაძლებლობას.
ულტრაბგერითი CupHorn მრავალი ნიმუშის ერთდროული, მაღალეფექტური ნიმუშის მოსამზადებლად ერთსა და იმავე პირობებში ცილის იზოლაციისა და დნმ-ის ფრაგმენტაციისთვის.
ცილის ექსტრაქცია ცხოველური ქსოვილიდან
მთლიანი ზომის ქსოვილის მოსამზადებლად (მაგ. თირკმელი, გული, ფილტვები, კუნთები და ა.შ.), ქსოვილი უნდა დაიჭრას ძალიან პატარა ნაჭრებად სუფთა ხელსაწყოებით, სასურველია ყინულზე და რაც შეიძლება სწრაფად, რათა თავიდან აიცილოს პროტეაზების დეგრადაცია (მაგ. ლიზისის ბუფერი, როგორიცაა RIPA ან ჰიპოტონური ლიზის ბუფერი, რომელიც შეიცავს პროტეაზას და ფოსფატაზას ინჰიბიტორ კოქტეილს). დაშლის შემდეგ, ნიმუში ჩაეფლო თხევად აზოტში ნაადრევი გაყინვისთვის. ნიმუში შეიძლება ინახებოდეს -80°C-ზე შემდგომი გამოყენებისთვის ან ინახებოდეს ყინულზე დაუყოვნებლივ ჰომოგენიზაციისთვის. უშუალოდ ულტრაბგერითი ექსტრაქციის წინ, ყინულის ცივი ლიზისის ბუფერი (პროტეაზას ინჰიბიტორებით DTT, ლეუპეპტინი და აპროტინინი) სწრაფად ემატება სინჯის მილში (რეკომენდებულია ~10 მგ ქსოვილზე დაახლოებით ~600 μL ბუფერზე). დაახლ. რეკომენდებულია ქსოვილის 20-60 მგ თითო ნიმუშის მილში.
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზაცია, ლიზისი და ექსტრაქცია ხორციელდება ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორით, როგორიცაა UP100H ან UP200Ht, რომელიც აღჭურვილია მიკრო-წვერის სონოტროდით. გახმოვანების ხანგრძლივობაა 60-90 წმ. ულტრაბგერითი ციკლის რეჟიმში 15 წმ. გაჟონვა და 10 წმ. დასვენების დრო. ნიმუში მუდმივად უნდა ინახებოდეს ყინულში.
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზაციის/ექსტრაქციის შემდეგ ლიზატი ცენტრიფუგირდება 27000 გ-ზე დაახლ. 20 წთ. ამის შემდეგ ხდება ზენატანის შეგროვება, რათა ცილის კონცენტრაცია განისაზღვროს ცილის ანალიზით, როგორიცაა Pierce ცილის ანალიზი BCA.
ცილის ექსტრაქცია სისხლის შრატიდან
შრატისა და ფოსფატის ბუფერის ერთგვაროვანი ნარევისთვის, ნიმუში პირველად ტრიალებს უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისამდე. ულტრაბგერითი ლიზისისთვის, ნიმუში ხდება ულტრაბგერითი ლაბორატორიული ჰომოგენიზატორით, როგორიცაა UP100H 8 ციკლისთვის 20% ამპლიტუდაზე, თითოეული 5 წამის ჩართვისა და 15 წამის გამორთვის ციკლისთვის. ცილის ექსტრაქცია ხორციელდება ციკლური ხმით (პულსაციის რეჟიმი) და ნიმუშის ყინულზე მოთავსებით, რათა თავიდან იქნას აცილებული ნიმუშის გადახურება და თერმული დეგრადაცია. ვინაიდან შრატი შეიცავს დიდი რაოდენობით მაღალი მოლეკულური წონის ცილებს (როგორიცაა ალბუმინი, α1-ანტიტრიფსინი, ტრანსფერინი, ჰაპტოგლობულინი, იმუნოგლობულინი G და იმუნოგლობულინი A), რომლებიც ხელს უშლიან დაბალი მოლეკულური წონის ცილების გამოყოფას IEF-ის დროს, რეკომენდებულია მათი გამოფიტვა. შრატიდან ამოწურვის სვეტის გამოყენებით.
ცილის ექსტრაქცია მცენარეული ქსოვილიდან
ახალი, რბილი მცენარეული ქსოვილი, მაგ. ხავსი და ა.შ., ადვილად შეიძლება დაირღვეს, უბრალოდ დაჭრილი ნიმუშის მასალის მოთავსებით ლიზისის ბუფერში გაჟონვისთვის. ხისტი, ლიგენური მცენარის ქსოვილები, როგორიცაა თესლი, ნაძვის ნემსები და ა.შ., უნდა იყოს დაფქული მშრალი. ზოგიერთი მყარი, მერქნიანი მცენარეული მასალა უნდა იყოს გაყინული და დაფქული თხევად აზოტში, სანამ არ მოიპოვება სონიკით. მცენარეული უჯრედების კულტურის სუსპენზიებისთვის, ულტრაბგერითი მკურნალობა 30-დან 150 წამამდე ლიზის ბუფერში ძირითადად საკმარისია. უფრო მკაცრი მასალა, როგორიცაა გოგრის თესლი, საჭიროებს უფრო ინტენსიურ სონიკას, როგორც ეს აღწერილია ქვემოთ.
გოგრის თესლიდან ალბუმინის ულტრაბგერითი ამოღების პროტოკოლი
ულტრაბგერითი ცილის გამოყვანისთვის ალბუმინის წვრილად დაფქული გოგრის თესლის ფხვნილიდან, 250 მლ შუშის ჭიქაში ემატება 10 გ ცხიმოვანი გოგრის თესლის ფხვნილი და 100 მლ დეიონიზირებული წყალი, როგორც გამხსნელი. ცილის ექსტრაქცია შედგება ორ ეტაპად: პირველი, ნიმუშის გაჟონვა ხდება ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი UP400St (400W, 24kHz) აღჭურვილი sonotrode S24d7. ულტრაბგერითი ჰომოგენიზაციის დროს მინის ჭიქა მოთავსებულია ცივი წყლის აბაზანაში. ჩართვის ტემპერატურის სენსორი და ულტრაბგერითი UP400St ტემპერატურის კონტროლის პარამეტრები უზრუნველყოფს ნიმუშის ტემპერატურის შენარჩუნებას ყოველთვის 30°C-ზე დაბლა. სონიკაციის დროს ტემპერატურის ზუსტი კონტროლით, ალბუმინის დენატურაცია თავიდან აცილებულია. მეორეც, ექსტრაქცია ხდებოდა მიქსერით 200 rpm სიჩქარით და 30°C-ზე. შემდეგ ჭიქა გადადის თერმოსტატულ შეკერში. გლობულინი გამოიყოფა გამოხდილი წყლით დიალიზის გზით. გლობულინის მოცილების შემდეგ, ცილის ექსტრაქტის ნიმუშის აღება შესაძლებელია ალბუმინის პროფილის დასადგენად და შემდგომში მორგებულია pI=3.0-ზე 0.1 M HCl-ის გამოყენებით ალბუმინის კოაგულაციისთვის. მყარი ფაზა გამოყოფილია ცენტრიფუგირებით 5000გრ, 20°C-ზე და ხელახლა იხსნება დეიონიზებულ წყალში. ალბუმინის კოაგულაცია ტარდება ორჯერ, რათა გაიზარდოს ცილის თანაფარდობა ალბუმინის კონცენტრატში.
ულტრაბგერითი ტუტე ცილის ექსტრაქცია ბრინჯის ქატოდან ცილის კონცენტრატის მოსამზადებლად გვიჩვენებს, რომ ულტრაბგერითი დამუშავება იწვევს ცილის მაღალ მოსავალს მნიშვნელოვნად მოკლე დროში. – ექსტრაქციის ჩვეულებრივ მეთოდებთან შედარებით.
ნიმუშის მომზადების პროტოკოლი ფუნქციური iNOS ფერმენტისთვის
სრულად ფუნქციონალური iNOS ფერმენტის მისაღებად (მაგ. წამლების სკრინინგისთვის), რეკომენდებულია შემდეგი პროტოკოლი: უჯრედის სუსპენზია უნდა განთავსდეს ყინულზე და ჩატარდეს სონიკით UP100H 10 μm ამპლიტუდაზე ციკლის რეჟიმში 5 წამში. გაჟონვა და 25 წმ. დაისვენე ყინულზე. პროცედურა უნდა განმეორდეს დაახლ. 3 - ჯერ. დასვენების დრო სონიკაციის ციკლებს შორის ამცირებს ტემპერატურის მატებას და შესაბამისად ამცირებს დენატურაციის რისკს.
ულტრაბგერითი პროტეინის ხსნადი
სონიკაციამ შესაძლოა დააჩქაროს ცილის ხსნადობის პროცესი, რომელიც ჩვეულებრივ რამდენიმე საათს მოითხოვს. იმისათვის, რომ არ მოხდეს ნიმუშის გადახურება და არ მოხდეს ცილების დეგრადაცია და შარდოვანას შემცველ ხსნარებში ცვლილებები, ულტრაბგერითი აფეთქება არ უნდა გაგრძელდეს რამდენიმე წამზე მეტ ხანს.
ულტრაბგერითი UP200Ht 2მმ მიკროწვერით S26d2 მცირე ნიმუშების სონიკაციისთვის.
ულტრაბგერითი მოწყობილობა ცილის ექსტრაქციისთვის
Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების ფართო სპექტრს უჯრედების, ქსოვილების, ბაქტერიების, მიკროორგანიზმების, საფუარის და სპორების დაშლის მიზნით.
Hielscher-ის ლაბორატორიის ულტრაბგერითი აპარატები მძლავრი და მარტივი გამოსაყენებელია. შექმნილია 24/7 მუშაობისთვის, ისინი შექმნილია როგორც მძლავრი და ეფექტური ლაბორატორიული და სკამების მოწყობილობა. ყველა მოწყობილობისთვის ენერგიის გამომუშავება და ამპლიტუდა ზუსტად შეიძლება კონტროლდებოდეს. აქსესუარების ფართო სპექტრი ხსნის დაყენების შემდგომ ვარიანტებს. ციფრულ ულტრაბგერას, როგორიცაა VialTweeter, UP200Ht, UP200St და UP400St აქვს ინტეგრირებული ტემპერატურის კონტროლი და ჩაშენებული SD ბარათი მონაცემთა ავტომატური ჩაწერისთვის.
მრავალი ნიმუშის არაპირდაპირი, ჯვარედინი დაბინძურების გარეშე და ერთდროული გაჟღერებისთვის, ჩვენ გთავაზობთ VialTweeter ან ულტრაბგერითი CupHorn.
ქვემოთ მოყვანილი ცხრილი გაძლევთ მიმოხილვას ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების შესახებ ნიმუშის მომზადებისთვის, უჯრედების დაშლისა და ექსტრაქციისთვის. დააწკაპუნეთ მოწყობილობის ტიპზე, რომ მიიღოთ მეტი ინფორმაცია თითოეული ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორის შესახებ. ჩვენი კარგად გაწვრთნილი და დიდი ხნის გამოცდილების მქონე ტექნიკური პერსონალი სიამოვნებით დაგეხმარებათ აირჩიოთ ყველაზე შესაფერისი ულტრაბგერითი თქვენი ნიმუშის მომზადებისთვის!
| სურათების მოცულობა | Დინების სიჩქარე | რეკომენდებული მოწყობილობები |
|---|---|---|
| 10-მდე ფლაკონი ან ტუბი | na | VialTweeter |
| მულტიბელ / მიკროტიტრული ფირფიტები | na | UIP400MTP |
| მრავალი მილები / ჭურჭელი | na | ჭიქის რქა |
| 1-დან 500 მლ-მდე | 10-დან 200 მლ/წთ-მდე | UP100H |
| 10-დან 1000 მლ-მდე | 20-დან 200 მლ/წთ-მდე | UP200Ht, UP200 ქ |
| 10-დან 2000 მლ-მდე | 20-დან 400 მლ/წთ-მდე | UP400 ქ |
თქვენი განაცხადის, მასალისა და ნიმუშის მოცულობიდან გამომდინარე, ჩვენ გირჩევთ ყველაზე შესაფერის დაყენებას თქვენი ნიმუშის მოსამზადებლად. დაგვიკავშირდით დღესვე!
Დაგვიკავშირდით! / Გვკითხე ჩვენ!
Hielscher ციფრული ულტრაბგერითი აღჭურვილია ბრაუზერის დისტანციური მართვის პულტით და მონაცემთა ავტომატური პროტოკოლით ინტეგრირებულ SD ბარათზე.
VialTweeter არაპირდაპირი გაჟღერებისთვის.
ფაქტები, რომელთა ცოდნაც ღირს
პროტეომიკა
პროტეომიკა არის კვლევის სფერო, რომელიც იკვლევს ცილებს და პროტეომებს. ცილები ასრულებენ ორგანიზმში სასიცოცხლო ფუნქციების ფართო სპექტრს. პროტეომა არის ცილების მთელი ნაკრები, რომელიც გამოხატულია გენომის, უჯრედის, ქსოვილის ან ორგანიზმის მიერ გარკვეულ დროს. პროტეომა იცვლება დროისა და განსხვავებული მოთხოვნების, ანუ სტრესის მიხედვით, რომელსაც უჯრედი ან ორგანიზმი განიცდის. უფრო კონკრეტულად, ეს არის გამოხატული ცილების ნაკრები მოცემულ ტიპის უჯრედში ან ორგანიზმში, მოცემულ დროს, განსაზღვრულ პირობებში. ტერმინი არის ცილებისა და გენომის ნაზავი. პროტეომიკა არის პროტეომის შესწავლა.
ცილის
ცილები არის დიდი ბიომოლეკულები, ე.წ. მაკრომოლეკულები – რომლებიც შედგება ამინომჟავების ნარჩენების ერთი ან მეტი გრძელი ჯაჭვისგან. ცილები წარმოდგენილია როგორც მცენარეული, ასევე ცხოველური წარმოშობის ყველა ორგანიზმში და ისინი გადამწყვეტია ბიოლოგიური ფუნქციების უმეტესობისთვის. ვინაიდან ცილები შეიცავს უამრავ ბიოლოგიურ ინფორმაციას, ისინი ამოღებულია ანალიტიკური მიზნით, მაგალითად, პროტეომიური კვლევისთვის. ცილების მიერ შესრულებული ყველაზე მნიშვნელოვანი ფუნქცია მოიცავს მეტაბოლური რეაქციების კატალიზებას, დნმ-ის რეპლიკაციას, სტიმულებზე რეაგირებას და მოლეკულების ტრანსპორტირებას ერთი ადგილიდან მეორეზე. პროტეინები ერთმანეთისგან განსხვავდებიან ძირითადად ამინომჟავების თანმიმდევრობით, რაც ნაკარნახევია მათი გენების ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობით და რაც ჩვეულებრივ იწვევს ცილის დაკეცვას კონკრეტულ სამგანზომილებიან სტრუქტურაში, რომელიც განსაზღვრავს მის აქტივობას. ცილები არის – პეპტიდების გარდა – საკვების ერთ-ერთი მთავარი კომპონენტი. ამიტომ, პროტეომიკა არის მძლავრი ინსტრუმენტი კვების მეცნიერებაში პროცესების ოპტიმიზაციისთვის, სურსათის უვნებლობისა და კვების შეფასებისთვის.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction არის წინასწარი ანალიტიკური პროცედურა ანალიზების გამოყოფისა და წინასწარ კონცენტრირებისთვის. ულტრაბგერითთან ერთად, ღრუბლის წერტილების მოპოვება შეიძლება გაძლიერდეს, რაც პროცესს უფრო ეფექტურს, სწრაფს და ეკოლოგიურად კეთილგანწყობილს ხდის. ულტრაბგერითი, ღრუბლის წერტილის მოპოვება ანალიტის მომზადების მნიშვნელოვნად უფრო ეფექტური მეთოდია. წაიკითხეთ მეტი ულტრაბგერითი დახმარებით ღრუბლის წერტილის ამოღების შესახებ!გელის ელექტროფორეზი
გელის ელექტროფორეზი არის მაკრომოლეკულების გამოყოფისა და ანალიზის ძირითადი მეთოდი, როგორიცაა დნმ, რნმ და ცილები, ასევე მათი ფრაგმენტები, მათი ზომისა და მუხტის მიხედვით. იგი გამოიყენება კლინიკურ ქიმიაში ცილების მუხტისა და/ან ზომის მიხედვით (IEF აგაროზა, არსებითად ზომით დამოუკიდებელი) და ბიოქიმიაში, მოლეკულურ ბიოლოგიაში და პროტეომიკაში დნმ-ისა და რნმ-ის ფრაგმენტების შერეული პოპულაციის სიგრძის მიხედვით გამოსაყოფად, დნმ-ის ზომის შესაფასებლად. და რნმ ფრაგმენტები ან ცილების გამოყოფა მუხტის მიხედვით.
უჯრედული კულტურები
უჯრედის კულტურა არის კონტროლირებადი მზარდი პროცესი, რომლითაც უჯრედები კულტივირებულია კონტროლირებად პირობებში. უჯრედის კულტურის პირობები განსხვავდება თითოეული უჯრედის ტიპისთვის. ზოგადად, უჯრედული კულტურის გარემო შედგება შესაფერისი ჭურჭლისგან (მაგ. პეტრის კერძი) სუბსტრატით ან გარემოთი, რომელიც ამარაგებს აუცილებელ საკვებ ნივთიერებებს (ამინომჟავები, ნახშირწყლები, ვიტამინები, მინერალები), ზრდის ფაქტორები, ჰორმონები და გაზები (CO).2, ო2) და არეგულირებს ფიზიოქიმიურ გარემოს (pH ბუფერი, ოსმოსური წნევა, ტემპერატურა). უჯრედების უმეტესობას სჭირდება ზედაპირი ან ხელოვნური სუბსტრატი, ხოლო სხვა უჯრედული კულტურები შეიძლება კულტივირებული იყოს თავისუფლად მცურავ კულტურულ გარემოში (სუსპენზიის კულტურა, უჯრედის სუსპენზია).
ცხოველთა უჯრედული ხაზების მასობრივი კულტურები გამოიყენება ვირუსული ვაქცინების და სხვა ბიოტექნოლოგიურად წარმოებული პროდუქტების სამრეწველო წარმოებაში. ადამიანის ღეროვანი უჯრედები კულტივირებულია უჯრედების რაოდენობის გასაფართოებლად და უჯრედების დიფერენცირებისთვის სხვადასხვა სომატურ უჯრედებად ტრანსპლანტაციის მიზნით.
ქსოვილის ნიმუშები
ტერმინი ქსოვილი აღწერს უჯრედულ შუალედს, სადაც უჯრედის მასალა ორგანიზაციულ დონეზეა უჯრედებსა და სრულ ორგანოს შორის. ქსოვილში იკრიბება მსგავსი უჯრედები, იგივე წარმოშობიდან, რომლებიც ერთად ასრულებენ კონკრეტულ ფუნქციას. მრავალი ქსოვილის ფუნქციური დაჯგუფებით იქმნება ორგანოების რთული სტრუქტურები.
ქსოვილის ნიმუში აღებულია ბიოლოგიაში, ჰისტოლოგიაში/ჰისტოლოგიაში, პარაზიტოლოგიაში, ბიოქიმიაში, იმუნოჰისტოქიმიაში, აგრეთვე დნმ-ის კულტივირებისთვის და ექსტრაქციისთვის. შეიძლება გამოიყოს ცხოველური (ქვეგანყოფილება: ძუძუმწოვრების ქსოვილი) და მცენარეული ქსოვილი. ცხოველური ქსოვილები დაჯგუფებულია შემაერთებელი, კუნთოვანი, ნერვული და ეპითელური ქსოვილის ოთხ ძირითად ტიპად. მცენარეული ქსოვილი იყოფა შემდეგ სამ ქსოვილოვან სისტემად: ეპიდერმისი, მიწის ქსოვილი და სისხლძარღვოვანი ქსოვილი.
ქსოვილის ნიმუშები შეიძლება მომზადდეს ცხოველის ან მცენარის ნაწილებისგან, მაგ. ძვლის, კუნთის, ფოთლებისგან და ა.შ.
სხეულის სითხეები
სისხლი, შრატი, პლაზმა, ცერებროსპინალური სითხე, ნერწყვი და სინოვიალური სითხე არის სხეულის სითხეები, რომლებიც გვთავაზობენ დიაგნოსტიკურად შესაბამისი ინფორმაციის დიდ წყაროს. აქედან გამომდინარე, მნიშვნელოვანია სხეულის სითხის ნიმუშების დახვეწილი მომზადება ანალიზისთვის. პირველი სირთულე დაკავშირებულია სხეულის სითხეებში არსებული კომპონენტების ფართო დინამიურ დიაპაზონთან.
ცილის კონცენტრაციის განსაზღვრა
ბრედფორდის ანალიზი, ლოურის ანალიზი და ბიკინქონინის მჟავა (BCA) ანალიზი არის საერთო ანალიზი ცილების კონცენტრაციის დასადგენად. მსხვილფეხა რქოსანი შრატის ალბუმინი (BSA) არის ერთ-ერთი ყველაზე ხშირად გამოყენებული ცილის სტანდარტი.
ლიზის ბუფერი
ლიზისის ბუფერი უნდა შეირჩეს უჯრედის მასალისა თუ ქსოვილის (ქსოვილის კულტურა, მცენარე, ბაქტერიები, სოკოები და ა.შ.) და იმის მიხედვით, არის თუ არა უჯრედები სტრუქტურაში და სტრუქტურის ტიპზე. ლიზისის ბუფერების ფართო სპექტრი ცილების, მემბრანების და ორგანელების ექსტრაქციისთვის ფორმულირებულია ერთი ან მეტი სარეცხი საშუალებით. სარეცხი საშუალება ჩვეულებრივ შეირჩევა საცდელი და შეცდომის ტესტებით ან – თუ არის შესაძლებელი – ცილის მოპოვების არსებული პროტოკოლის მიხედვით. სარეცხი საშუალება უნდა შეესაბამებოდეს ქსოვილის წყაროს და ცილებს. ზოგადად, ყველაზე რბილი სარეცხი საშუალება, რომელიც მუშაობს კონკრეტულ ქსოვილზე/ცილაზე, შეირჩევა ექსტრაქტის მაქსიმალური ფუნქციონირების შესანარჩუნებლად. გარდა ამისა, მემბრანების და ორგანელების ამოღების შემთხვევაში, რბილი სარეცხი საშუალება ინარჩუნებს მემბრანას ხელუხლებლად. ლიზის ბუფერებში ხშირად გამოყენებული სარეცხი საშუალებები ძირითადად არის არაიონური ან ცვიტერიონული, მაგ. CHAPS, დეოქსიქოლატი, Triton™ X-100, NP40 და Tween 20.
მაგალითად, ქსოვილები, როგორიცაა ტვინი, ღვიძლი, ნაწლავები, თირკმელები, ელენთა და ა.შ. შეიძლება უბრალოდ ბუფერული იყოს RIPA-თ. – თუმცა პროტეაზას ინჰიბიტორები და DTT (მაგ. გელის ელექტროფორეზისთვის) უნდა იყოს შეტანილი.
ლიზისის ბუფერი ჩონჩხის კუნთოვანი ქსოვილისთვის (ყინულის ცივი): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) გლიცერინი, 1 mM EDTA 1 მმ დითიოთრეიტოლი დამატებულია პროტეაზასა და ფოსფატაზას ინჰიბიტორი კოქტეილით
საერთო ბუფერების ცხრილი და მათი pH დიაპაზონი. ზოგადად, ეს ბუფერები ჩვეულებრივ გამოიყენება 20-50 მმ კონცენტრაციებში.
| ბუფერი | pH დიაპაზონი |
|---|---|
| Ლიმონმჟავა – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| ნატრიუმის ციტრატი – Ლიმონმჟავა | 3.0 – 6.2 |
| Ნატრიუმის აცეტატი – ძმარმჟავა | 3.6 – 5.6 |
| კაკოდილის მჟავა ნატრიუმის მარილი – HCl | 5.0 – 7.4 |
| სამინისტროს – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| ნატრიუმის დიჰიდროფოსფატი – დინატრიუმის წყალბადის ფოსფატი | 5.8 – 8.0 |
| იმიდაზოლი – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| ტრიეთანოლამინის ჰიდროქლორიდი – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| ტრის – HCl | 7.0 – 9.0 |
| ჰეპესი – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| ტრიცინი – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| ნატრიუმის ტეტრაბორატი – ბორის მჟავა | 7.6 – 9.2 |
| ბიცინი – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| გლიცინი – NaOH | 8.6 – 10.6 |
ბუფერების უმეტესობა აჩვენებს pH-დამოკიდებულებას ტემპერატურასთან. ეს განსაკუთრებით ეხება Tris ბუფერებს. pKa იცვლება 8,06-დან 25°C-დან 8,85-მდე 0°C-ზე.
(ბუფერის pH და pKa: pH ზომავს წყალბადის იონების კონცენტრაციას წყალხსნარში. pKa (= მჟავის დისოციაციის მუდმივი) არის დაკავშირებული, მაგრამ უფრო სპეციფიკური საზომი, რადგან ის გვეხმარება იმის პროგნოზირებაში, თუ როგორ იმოქმედებს მოლეკულა კონკრეტულზე. pH მნიშვნელობა.)
ტრიზოლი
ტრიზოლი არის ქიმიური ხსნარი, რომელიც გამოიყენება რნმ/დნმ/ცილის მოსაპოვებლად გუანიდინის თიოციანატ-ფენოლ-ქლოროფორმის ექსტრაქციის დროს. ულტრაბგერითი დახმარებით ტრიზოლის ექსტრაქციის გამოყენება იწვევს დნმ-ის, რნმ-ის და ცილების მაღალ მოსავლიანობას ერთი და იმავე ნიმუშიდან და ამით აღემატება ექსტრაქციის სხვა მეთოდებს.
ლიტერატურა/ცნობარი
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.