SARS-CoV-2 კორონავირუსის ულტრაბგერითი დამუშავებით ინაქტივაციის პროტოკოლი

Hielscher VialTweeter არის უნიკალური ულტრაბგერითი მრავალნიმუშიანი მოსამზადებელი მოწყობილობა, რომელიც გამოიყენება SARS-CoV-2 კორონავირუსის ინაქტივაციისთვის. VialTweeter საშუალებას იძლევა ერთდროულად მომზადდეს 10-მდე ნიმუშის ფლაკონი და ამრიგად იდეალური მოწყობილობაა ნიმუშების მასობრივი დამუშავებისთვის.

SARS-CoV-2 კორონავირუსის ინაქტივაცია VialTweeter-ით

ფიქსატორის მოცილების შემდეგ მონოშრეები სამჯერ გაირეცხა ფოსფატური ბუფერული ხსნარით (PBS), რის შემდეგაც უჯრედები გადაიფხიანა 1 მლ MEM/5% FBS-ში და დაექვემდებარა სონიკაციას (3 × 10 წამი ჩართვა, 10 წამი გამორთვა 100% სიმძლავრესა და ამპლიტუდაზე) Hielscher-ის ულტრაბგერითი პროცესორით UP200St VialTweeter-ით დანართი. სუპერნატანტები გაიწმინდა ცენტრიფუგირებით 3000 × g 10 წუთის განმავლობაში. წაიკითხეთ სრული პროტოკოლი აქ SARS-CoV-2 კორონავირუსის ინაქტივაციისთვის Welch et al. (2020) ქვემოთ:

უჯრედები და ვირუსი

Vero E6 უჯრედები (Vero C1008; ATCC CRL-1586) კულტივირებული იყო Eagle-ის მოდიფიცირებულ მინიმალურ არსებით გარემოში (MEM), რომელსაც დაემატა 10% (v/v) ნაყოფის ხბოს შრატი (FCS). გამოყენებული ვირუსი იყო SARS-CoV-2 შტამი hCOV-19/England/2/2020, იზოლირებული PHE-ს მიერ ბრიტანეთში პირველი პაციენტთა კლასტერიდან 29/01/2020. ეს ვირუსი მიღებულ იქნა 1 პასაჟზე და გამოიყენებოდა ინაქტივაციის კვლევებისთვის მე-2 ან მე-3 პასაჟზე.
რეაგენტებისა და ქიმიკატების შესახებ, რომლებიც გამოიყენება SARS-CoV-2-ის ინაქტივაციისთვის, ასევე რეაგენტის ციტოტოქსიკურობის მოსაშორებლად, გთხოვთ, იხილოთ Welch et al. (2020) სამეცნიერო მოხსენება.

ვირუსის ინაქტივაცია სარეცხი საშუალებებით – SARS-CoV-2 კორონავირუსის ინაქტივაციის პროტოკოლი, Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 ინაქტივაცია

კომერციული პროდუქტებისთვის, ვირუსული პრეპარატები (ქსოვილის კულტურის სითხე, ტიტრები 1 × 10-დან⁶ 1 × 10-მდე⁸ PFU/მლ) დამუშავდა სამ განმეორებად ნიმუშში რეაგენტებით იმ კონცენტრაციებითა და კონტაქტის დროებით, რომლებიც რეკომენდებულია მწარმოებლის გამოყენების ინსტრუქციებში, სადაც ეს შესაძლებელია, ან კონცენტრაციებითა და დროებით, რომლებიც სპეციალურად მოითხოვეს ტესტირების ლაბორატორიებმა. სადაც მწარმოებელი კონცენტრაციების დიაპაზონს მიუთითებდა, შემოწმდა პროდუქტის ყველაზე დაბალი თანაფარდობა ნიმუშთან (ანუ ტესტირებული პროდუქტის ყველაზე დაბალი რეკომენდებული კონცენტრაცია). ნიმუშის სატრანსპორტო მილის რეაგენტები შემოწმდა ქსოვილის კულტურის სითხის ერთი მოცულობის რეაგენტის ათ მოცულობასთან თანაფარდობით, გარდა იმ შემთხვევისა, როდესაც მწარმოებელმა მიუთითა ნიმუშის სითხისა და რეაგენტის სხვა მოცულობითი თანაფარდობა. სარეცხი საშუალებები, ფიქსატორები და გამხსნელები ტესტირებულ იქნა მითითებულ კონცენტრაციებზე მითითებული დროის განმავლობაში. ინაქტივაციის ყველა ეტაპი შესრულდა გარემოს ოთახის ტემპერატურაზე (18 – 25°C). ალტერნატიული ტიპის ნიმუშების შესამოწმებლად ვირუსი შეყვანილ იქნა მითითებულ ნიმუშის მატრიცაში 1:9 თანაფარდობით, შემდეგ დამუშავდა სატესტო რეაგენტებით, როგორც ზემოთ. ყველა ექსპერიმენტი მოიცავდა სამ განმეორებად საკონტროლო იმიტირებულად დამუშავებულ ნიმუშს, სადაც სატესტო რეაგენტის ნაცვლად გამოყენებული იყო PBS-ის ექვივალენტური მოცულობა. საჭირო კონტაქტის დროის დასრულებისთანავე დამუშავებული ნიმუშის 1 მლ დამუშავდა სათანადოდ შერჩეული ფილტრაციის მატრიცის გამოყენებით. რეაგენტის მოცილება ინაქტივაციის ტესტირებისთვის განხორციელდა უფრო დიდი ფორმატის ცენტრიფუგირებად სვეტებში Pierce 4 მლ Detergent Removal Spin Columns-ის (Thermo Fisher) გამოყენებით, ან Pierce-ის 10 მლ ტევადობის ცარიელი ცენტრიფუგირებადი სვეტების (Thermo Fisher) შევსებით SM2 Bio-Beads-ით, Sephacryl S-400HR-ით ან Sephadex LH-20-ით, რათა მიღებულიყო 4 მლ შეფუთული მძივები/ფისი. Amicon-ის ფილტრებით გასაწმენდად 2 × 500 μl ნიმუში გაიწმინდა ორი ცენტრიფუგული ფილტრით ადრე აღწერილი მეთოდით, შემდეგ კი გაერთიანდა. ფორმალდეჰიდისა და ფორმალდეჰიდის გლუტარალდეჰიდთან ერთად მოცილებისთვის გამოყენებულ იქნა ერთი ფილტრი 1 × 500 μl ნიმუშის მოცულობით, დამუშავების შემდეგ ხელახლა შეჩერდა 500 μl PBS-ში და დაემატა 400 μl MEM/5% FBS-ს. ინფიცირებული მონოშრეების ინაქტივაციისთვის, 12,5 სმ² Vero E6 უჯრედების კოლბები (2.5 × 10⁶ უჯრედი/კოლბა 2,5 მლ MEM/5% FBS-ში) დაინფიცირდა MOI 0,001-ზე და ინკუბირებული იყო 37°C/5% CO₂ -ზე 24 საათის განმავლობაში. სუპერნატანტი მოიხსნა და უჯრედები ფიქსირდა 5 მლ ფორმალდეჰიდით, ან ფორმალდეჰიდითა და გლუტარალდეჰიდით ოთახის ტემპერატურაზე 15 ან 60 წუთის განმავლობაში. ფიქსატორი მოიხსნა და მონოშრეები სამჯერ გაირეცხა PBS-ით, რის შემდეგაც უჯრედები გადაიფხიანა 1 მლ MEM/5% FBS-ში და დაექვემდებარა სონიკაციას (3 × 10 წამი ჩართვა, 10 წამი გამორთვა 100% სიმძლავრესა და ამპლიტუდაზე) UP200St-ის გამოყენებით VialTweeter დანამატით (Hielscher Ultrasound Technology). სუპერნატანტები გაიწმინდა ცენტრიფუგირებით 3000 × g სიჩქარით 10 წუთის განმავლობაში.

რეაგენტის დეტალები, რომელიც გამოიყენება SARS-CoV-2 კორონავირუსის ინაქტივაციისთვის ულტრაბგერითი VialTweeter-ით Welch et al.-ის 2020 წლის პროტოკოლის მიხედვით

სრული პროტოკოლი Hielscher VialTweeter-ის გამოყენების ჩათვლით შეგიძლიათ იხილოთ აქ:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

დახვეწილი ულტრაბგერითი დისმემბრატორები და უჯრედების დამრღვევები

მრავალნიმუშიანი ულტრაბგერითი VialTweeter არის მხოლოდ ერთ-ერთი ულტრაბგერითი გადაწყვეტა ნიმუშის მოსამზადებლად ბიოლოგიურ, ბიოქიმიურ და კლინიკურ ლაბორატორიებში. Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ იდეალურ ულტრაბგერით დისმემბრატორს თქვენი გამოყენებისთვის, მაგ.: უჯრედების ლიზისი, უჯრედების ექსტრაქცია, ქსოვილის ჰომოგენიზაცია, ლიზატის გახსნა, დაშლა, ნიმუშის დეგაზაცია და ა.შ.
შეგვატყობინეთ რამდენი ნიმუშის დამუშავება გჭირდებათ საათში და დღეში, თუ გირჩევნიათ პირდაპირი თუ არაპირდაპირი სონიკა და რა არის ულტრაბგერითი ნიმუშის დამუშავების მიზანი. ჩვენ შემოგთავაზებთ ყველაზე შესაფერის ულტრაბგერით მოწყობილობას თქვენი ყოველდღიური მუშაობისთვის!
Hielscher Ultrasonics-ის ციფრული ულტრაბგერითი პროცესორები აღჭურვილია ჭკვიანი პროგრამული უზრუნველყოფით, მონაცემთა ავტომატური ჩაწერით, ტემპერატურის კონტროლის, სონიკაციის ხანგრძლივობის და ციკლის/პულსის რეჟიმის წინასწარი დაყენების მარტივი ვარიანტებით, ასევე ნიმუშის განათებით და ბრაუზერის დისტანციური მართვით. ჩვენ ვცდილობთ, ჩვენი ულტრაბგერითი მოწყობილობები რაც შეიძლება ჭკვიანი გავხადოთ, რათა თქვენი კვლევისა და სამუშაო რუტინა მაქსიმალურად მოსახერხებელი და წარმატებული იყოს.
დააწკაპუნეთ აქ, რომ იპოვოთ მეტი აპლიკაცია VialTweeter-ით ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადების პროტოკოლების ჩათვლით!