ულტრაბგერითი დნმ-ის გასწორება
დნმ-ისა და რნმ-ის შეწყვეტის დროს, გრძელი დნმ-ის მოლეკულები ფრაგმენტირებულია პატარა ნაჭრებად, რაც გადამწყვეტი ნაბიჯია ნიმუშების მომზადებისთვის შემდეგი თაობის თანმიმდევრობის (NGS) ბიბლიოთეკის მშენებლობისთვის. ულტრაბგერითი დნმ-ის შეკუმშვა იყენებს აკუსტიკური კავიტაციის ძალებს დნმ-ის ან რნმ-ის ფრაგმენტებად დასაშლელად 100 bp-დან 5 kb-მდე. ეს მეთოდი საშუალებას იძლევა ზუსტი კონტროლი ფრაგმენტების ზომაზე, რაც ხელს უწყობს დნმ-ის სასურველ სიგრძეზე მორგებას ოპტიმალური თანმიმდევრობის შედეგებისთვის.
დნმ-ის გასწორება ულტრაბგერითი გამოყენებით
Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ ულტრაბგერაზე დაფუძნებულ სხვადასხვა ხსნარებს დნმ-ის, რნმ-ის და ქრომატინის გარსისთვის. აირჩიეთ ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატები (მაგ. UP100H) პირდაპირი სონიკაციისთვის მიკროწვერის გამოყენებით, ან გამოიყენეთ VialTweeeter ან ულტრაბგერითი კუპიურა სხვადასხვა ნიმუშების არაპირდაპირი დნმ-ის მოსამზადებლად ერთდროულად. Hielscher გთავაზობთ იდეალურ მოწყობილობას თქვენი საჭიროებების გათვალისწინებით: გაქვთ 1 ან 10-მდე ნიმუში, მოცულობა მიკროლიტრიდან ლიტრამდე – Hielscher sonicators დააკმაყოფილებს თქვენს მოთხოვნებს დნმ-ის, რნმ-ის და ქრომატინის ფრაგმენტების სწორ სიგრძეზე მოსამზადებლად. განმეორებადობა, მარტივი ოპერაცია და ზუსტი კონტროლი იძლევა საიმედო ბიბლიოთეკას შემდეგი თაობის თანმიმდევრობისთვის.
ფერმენტული დნმ-ის ფრაგმენტაციისგან განსხვავებით, ულტრაბგერითი ცვლა იყენებს სუფთა მექანიკურ ათვლის ძალებს ყოველგვარი ქიმიკატების დამატების გარეშე. პროცესის პარამეტრების ზუსტი დაყენებით, ულტრაბგერითი შეკუმშვა წარმოქმნის მაღალი მოლეკულური წონის დნმ-ის ფრაგმენტებს (პლაზმიდური და გენომიური დნმ).
გაწმენდილი ნუკლეინის მჟავები შეიძლება გაძლიერდეს ფრაგმენტაციის საფეხურამდე ან მის შემდეგ.
Sonication პარამეტრების (ძალა, პულსის ციკლი / ადიდებული, დრო და ტემპერატურა) შეიძლება უსაფრთხოდ კონტროლდებოდეს პროგრამული პარამეტრების საშუალებით.
- ზუსტი კონტროლი
- ბგერითი ციკლები და დრო ზუსტად ადაპტირებადი დნმ-ის სასურველ ზომასთან
- მაღალი მოლეკულური წონის დნმ-ის ფრაგმენტები
- ტემპერატურის კონტროლი
- Სწრაფი
- განმეორებადი შედეგები
- ავტოკლავირებადი
- სხვადასხვა გადაწყვეტილებები: ზონდის ტიპის, VialTweeter და ჭიქის რქა
პროტოკოლები ულტრაბგერითი დნმ-ის გასწორებისთვის
ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაციის ანალიზისთვის
მოკლედ, უჯრედები მოთავსებული იქნა 60 მმ დიამეტრის ჭურჭელში (400000 თითო ჭურჭელში) და ტრანსფექციით RhoA siRNA (როგორც აღწერილია); 72 საათის შემდეგ, ისინი ინკუბირებული იყო ფორმალდეჰიდით (საბოლოო კონცენტრაცია, 1%) 10 წუთის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე, რათა ჯვარედინი დაკავშირება პროტეინებთან დნმ-თან. ჯვარედინი კავშირის რეაქცია ჩაქრა 1.25 მოლ/ლ გლიცინის მეათედი მოცულობის დამატებით, რაც იძლევა 125 მმოლ/ლ საბოლოო კონცენტრაციას. უჯრედები ორჯერ გაირეცხა ყინულივით ცივი PBS-ით, ხელახლა სუსპენდირებულ იქნა რადიოიმუნოპრეციპიტაციური ანალიზის ბუფერში [150 მმოლ/ლ NaCl, 1% NP40, 0,5% დეოქსიქოლატი, 0,1% SDS, 5 მმოლ/ლ EDTA, 50 მმოლ/ლ Tris-8HCl0H (p )] შეიცავს 1 მმოლ/ლ ფენილმეთილსულფონილ ფტორიდს, 1 აგ/მლ აპროტინინს და 1 აგ/მლ პეპსტატინ A-ს და ინახება ყინულზე 30 წუთის განმავლობაში. შემდეგ, უჯრედის ლიზატები ყინულზე გაჟღერდა ა Hielscher UP200S ულტრაბგერითი ბგერითი აპარატი (3 x 40 წმ, ამპლიტუდა 40%, ციკლი 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) სანამ ჯვარედინი დაკავშირებულ ქრომატინს არ იშლება დნმ-ის ფრაგმენტები 200-დან 1000 bp-მდე. მთლიანი ლიზატის მეათედი გამოიყენებოდა სხვადასხვა ნიმუშებში არსებული დნმ-ის ოდენობის რაოდენობრივი დასადგენად და განიხილებოდა, როგორც “მთლიანი შეყვანის დნმ”. სუპერნატანტები ინკუბირებული იყო ორაგულის სპერმის დნმ-ით/პროტეინის აგაროზა-50% ხსნარით არასპეციფიკური ფონის შესამცირებლად. შემდეგ იმუნოპრეციპიტაცია გაკეთდა ღამით 4°C-ზე 5 Ag ანტი-NF-nB p65 (Upstate) ან ანტისხეულების გარეშე (უარყოფითი კონტროლი). ამ ზენატანებს დაემატა 5 მოლ/ლ NaCl და აცხელეს ღამით 65°C-ზე, რათა აღედგინათ ცილა-დნმ ჯვარედინი კავშირები. იმუნოკომპლექსები შემდგომში დამუშავდა DNase- და RNase-თავისუფალი პროტეინაზა K-ით და დნმ გაიწმინდა ფენოლი/ქლოროფორმის ექსტრაქციისა და ეთანოლის დალექვით. PCR გაკეთდა სპეციფიკური პრაიმერებით, რომლებიც შეესაბამება თანმიმდევრობას ადამიანის iNOS გენის პრომოტორულ რეგიონში (p1 პრაიმერი: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 პრაიმერი: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)
EGFP- ექსპრესიის კვლევები
ექსპრესიის კვლევებისთვის, რეკომბინანტული შტამი L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, გერმანია) გენი EGFP (გაძლიერებული მწვანე ფლუორესცენტური პროტეინი), ქრომოსომული ssu ინტეგრირებული, კულტივირებული იყო სხვადასხვა მედიაში, როგორც ადრე იყო აღწერილი და დამატებით ემატება 100 მგ ლ-1 ნურსეოტრიცინი (Jena Bioscience, გერმანია). კულტივირებისას აღებული იქნა 1 მლ ნიმუშები, ცენტრიფუგირებული (2000 × გ, 20°C, 10 წთ) და გარეცხილი 0,9% NaCl ხსნარით. მარცვლები ხელახლა შეჩერდა ბუფერში (20 მმ HEPES, 5 მმ EDTA, 2 მმ DTT) და დაიშალა ულტრაბგერითი პროცესორით სონიფიკაციით. UP400S (ენერგიის გამოყენება ~ 400 Ws). უჯრედის ნამსხვრევები ამოღებულ იქნა ცენტრიფუგაციით (6000 × გ, 4°C, 5 წთ) და გაანალიზდა ნატრიუმის დოდეცილ სულფატი - პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზით (SDS-PAGE) შემცირების პირობებში Laemmli (1970) მეთოდის მიხედვით 12.5% პოლიაკრალამიდური გელით. . EGFP- ექსპრესია გამოკვლეული იყო აგზნებულ კულტურაში. (Fritsche et al. 2007)

E. coli EDL933-ის გენომიური დნმ-ის ელექტროფორეზული ანალიზები ექვემდებარება 0 – 15 წთ ულტრაბგერითი გამოკვლევის დროს. L მიუთითებს დნმ-ის კიბეზე. (Basselet et al. 2008)

მრავალ ჭაბურღილის სონიკატორი UIP400MTP მაღალი გამტარუნარიანობის დნმ-ის გაკვეთისთვის
ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაცია
ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაციის ანალიზი ჩატარდა ChIP-IT-ის გამოყენებითTM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით გარკვეული ცვლილებებით. მოკლედ, დიფერენცირებული ადამიანის პოდოციტები ჯვარედინად დაუკავშირეს 1% ფორმალდეჰიდს 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. უჯრედები გარეცხილი იქნა ყინულივით ცივი PBS-ით და ფიქსაციის რეაქცია შეჩერდა 0,125 M გლიცინის დამატებით 5 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. უჯრედები კვლავ გარეცხეს ყინულივით ცივი PBS-ით და ამოიღეს ჭურჭლიდან. უჯრედები დაგროვდა ცენტრიფუგირებით და ხელახლა შეჩერდა ლიზის ბუფერში. ცენტრიფუგაციის შემდეგ, გრანულოზირებული ბირთვები ხელახლა შეჩერდა თხრილის ბუფერში, ინკუბირებული იყო ყინულზე 30 წუთის განმავლობაში და ქრომატინი გაიფანტა სონიკით, მაგ. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, გერმანია) 25% სიმძლავრის დროს ყინულზე 20 წამიანი 5 პულსი დაახლოებით 200-600 bp სიგრძის ფრაგმენტებად. შემდეგ გახეხილი ქრომატინი ცენტრიფუგირებულ იქნა და ზენატანი შეგროვდა. იმუნოპრეციპიტაციისთვის, 60 μl ქრომატინი ინკუბირებული იყო 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ან NF-κB p50 (Abcam) ანტისხეულებით ან IgG (Zymed Laboratories), როგორც უარყოფითი კონტროლი, ღამით 4°C-ზე ნაზი ბრუნვით. მაგნიტურ მარცვლებთან შეკრული იმუნოკომპლექსები შეგროვდა მაგნიტური სადგამის გამოყენებით, გაირეცხა ინტენსიურად და ცილა/დნმ ჯვარედინი ბმულები შეცვალა და დნმ გამოირეცხა რეალურ დროში PCR ანალიზისთვის. (Ristola et al. 2009)
EHEC დნმ მომზადება ჩიპების მასივის ანალიზისთვის
უჯრედების ლიზატებისა და ამოღებული დნმ-ების განლაგება
PBS-ში შეჩერებული ბაქტერიული მარცვლები სასურველ საბოლოო კონცენტრაციამდე დამუშავდა ულტრაბგერითი დამრღვევი UP100H (Hielscher GmbH, გერმანია) აღჭურვილია microtip MS1 (დიამეტრის 1მმ). სამუშაო სიხშირე იყო 30 kHz და ეფექტური გამომავალი სიმძლავრე იყო 100 W. ოპერაციის დროს ნიმუშები გაცივდა ყინულის წყლის აბაზანაში, შერეული და ცენტრიფუგირებული. ნიმუშები გამოყენებული იყო ნაკადის ციტომეტრიის კვლევებისთვის, ხოლო შემდგომი დამუშავებისთვის ნიმუშები დაექვემდებარა თერმულ დამუშავებას (95°C, 5 წთ). ნედლი უჯრედის ლიზატები დამუშავდა ფენოლის: ქლოროფორმის: იზოამილის სპირტის ნარევით (25:24:1). ამ ნარევის თანაბარი მოცულობა დაემატა ლიზატის ნიმუშს, ხსნარი ენერგიულად მორევა 15 წმ და ცენტრიფუგირებულ იქნა 15000 xg 2 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე (RT) დაახლოებით 22°C. ზედა წყლის ფაზა, რომელიც შეიცავს გენომურ დნმ-ს, საგულდაგულოდ გამოიყო და შეგროვდა ახალ სტერილურ ეპენდორფის მილში.
შემდგომში, ნიმუშები გაჟღერდა დნმ-ის ფრაგმენტად. სონიკაციის ნაბიჯი განხორციელდა იმავე პირობებში, როგორც ზემოთ აღწერილი. გენომის დნმ-ზე ფრაგმენტაციის ეფექტის შესაფასებლად, ნიმუშები გაანალიზდა აგაროზის გელის ელექტროფორეზის გამოყენებით.
(…) ადრე 2,5 წუთის განმავლობაში გაჟღენთილი ნიმუშები დაექვემდებარა ექსტრაქციის საფეხურს თერმული დამუშავებისა და ცენტრიფუგაციის შემდეგ. გამოთავისუფლებული დნმ ამოღებულია ორჯერ ფენოლის: ქლოროფორმის: იზოამილის სპირტის ნაზავით და შემდეგ 0-15 წთ. აგაროზის გელის ელექტროფორეზი გამოიყენებოდა დნმ-ის ზომის განაწილების დასადგენად, რომელიც ექვემდებარება ექსტრაქციის შემდგომ ულტრაბგერით ფრაგმენტაციას (ნახ. ზედა მარჯვენა მხარეს). ძლიერ ფრაგმენტირებული დნმ აშკარა იყო დნმ-ის ნაცხის არსებობით და არა მაღალმოლეკულური წონის ზოლებიდან, რომლებიც აღმოიფხვრა 2,5 წუთის ან მეტი ხნის განმავლობაში სონიკირებული ნიმუშებიდან. უფრო ხანგრძლივმა გაჟღერებამ თანდათან შეამცირა ფრაგმენტების სიგრძე დაახლოებით 150-600 bp-მდე და 15 წუთის განმავლობაში სონიკირებამ კიდევ უფრო გააფუჭა ეს ფრაგმენტები, როგორც ჩანს ძირითადად ნაცხის ზედა ნაწილიდან. ამრიგად, დნმ-ის ფრაგმენტების საშუალო ზომა თანდათან მცირდებოდა ულტრაბგერითი გამოკვლევის დროს და 5 წთ მკურნალობამ საშუალება მისცა მიეღო დნმ-ის ფრაგმენტების ზომები, რომლებიც ყველაზე შესაფერისია ჩიპური მასივის ანალიზისთვის. დაბოლოს, დადგინდა დნმ-ის ანალიზის მომზადების პროცედურა, რომელიც მოიცავს ულტრაბგერითი მკურნალობის პირველ 2 წუთს, დნმ-ის ექსტრაქციას (2×) და შემდგომ 5 წთ სონიკაციას. (Basselet et al. 2008)
ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაცია (ChIP)
HEK293 უჯრედები კულტივირებული იქნა როგორც ზემოთ აღწერილი და ფიქსირდება 2 მმ დისუკცინიმიდილ-გლუტარატით 45 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. შემდგომში, უჯრედები ორჯერ გაირეცხა PBS-ით. ქრომატინი ჯვარედინად იყო დაკავშირებული 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე 1% (ვ/ვ) ფორმალდეჰიდის გამოყენებით და ორჯერ გარეცხეს ყინულივით ცივი PBS-ით. ჯვარედინი კავშირის რეაქცია შეჩერდა გლიცინით ინკუბაციით საბოლოო კონცენტრაციით 0,125 მ 5 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. ტრიპსინთან ინკუბაციის შემდეგ, უჯრედები ამოიღეს უჯრედის კულტურის ჭურჭლიდან და ორჯერ გარეცხეს PBS-ით. უჯრედის მარცვლები ხელახლა შეჩერდა ლიზის ბუფერში (5 მმ მილები, pH 8.0, 85 მმ KCl და 0.5% (ვ/ვ) Nonidet P-40), ინკუბირებული იყო ყინულზე 10 წუთის განმავლობაში და ჰომოგენიზირებული იყო Dounce ჰომოგენიზატორით. შემდგომში, ბირთვები დაგროვდა ცენტრიფუგაციით (3500 xg, 5 წთ, 4 °C) და ხელახლა შეჩერდა ბირთვების ბუფერში (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA და 1% (w/v) SDS). ბირთვები დაირღვა ბგერითი სამი 20-წმ პულსით ა UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) ციკლის 0,5 და ამპლიტუდის 30% პარამეტრზე, რომელიც იძლევა გენომის დნმ-ის ფრაგმენტებს 200 – 1000 bp მოცულობითი ზომით. ChIP-ისთვის 50 გ დნმ განზავებული იყო 4-ჯერ იმუნოპრეციპიტაციის ბუფერში (16.7 მმ ტრის-HCl, pH 8.1, 167 მმ NaCl, 1.2 მმ EDTA, 1.1% (ვ/ვ) Triton X-100 და 0.01% (w/w). ქ) სდს). (ვეისკე და სხვ. 2006)
ჰისტონის მოდიფიკაციის ანალიზი ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაციით (ChIP)
მოკლედ, 6 x 106 უჯრედები ორჯერ გაირეცხა PBS-ით და ჯვარედინი დაკავშირება კულტურის ფირფიტაზე 15 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე 0.5% ფორმალდეჰიდის თანდასწრებით. ჯვარედინი კავშირის რეაქცია შეჩერდა 0,125 M გლიცინის დამატებით. ყველა შემდგომი ნაბიჯი განხორციელდა 48°C ტემპერატურაზე. ყველა ბუფერი წინასწარ გაცივდა და შეიცავდა პროტეაზას ინჰიბიტორებს (Complete Mini, Roche). უჯრედები ორჯერ გაირეცხა PBS-ით და შემდეგ გაიხეხეთ. შეგროვებული მარცვლები იხსნება 1 მლ ლიზის ბუფერში (1% SDS, 5 მმ EDTA, 50 მმ ტრის pH 8) და სონიცირდება ცივ ეთანოლის აბაზანაში 10 ციკლის განმავლობაში 100% ამპლიტუდის გამოყენებით. UP50H sonicator (ჰილშერი, ტელტოვი, გერმანია). ქრომატინის ფრაგმენტაცია ვიზუალური იყო 1% აგაროზის გელში. მიღებული ფრაგმენტები იყო 200-500 pb დიაპაზონში. ხსნადი ქრომატინი მიიღეს გაჟღენთილი ნიმუშების ცენტრიფუგირებით 14000 გ-ზე 10 წუთის განმავლობაში 48°C-ზე. ხსნადი ფრაქცია განზავებული იყო 1/10-ით განზავების ბუფერში (1% Triton X-100, 2 მმ EDTA, 20 მმ ტრის pH 8, 150 მმ NaCl), შემდეგ განაწილდა და ინახებოდა 80°C-ზე გამოყენებამდე. (როდრიგესი და სხვ. 2008)
მოწყობილობა | სიმძლავრე [W] | ტიპი | მოცულობა [მლ] | ||
---|---|---|---|---|---|
UIP400MTP | 400 | მიკროფილებისთვის | 6-დან | – | 3465 ჭაბურღილი | VialTweeter | 200 | ცალკე | 0.5 | – | 1.5 |
UP50H | 50 | ხელით ან დგას | 0.01 | – | 250 |
UP100H | 100 | ხელით ან დგას | 0.01 | – | 500 |
UP200Ht | 200 | ხელით ან დგას | 0.1 | – | 1000 |
UP200 ქ | 200 | ადგას | 0.1 | – | 1000 |
UP400 ქ | 400 | ადგას | 5.0 | – | 2000 წ |
ჭიქის რქა | 200 | CupHorn, სონორეაქტორი | 10 | – | 200 |
GDmini2 | 200 | დაბინძურებისგან თავისუფალი ნაკადის უჯრედი |

VialTweeter ულტრაბგერითი ნიმუშის მოსამზადებლად, მაგ პლაზმიდის (pDNA) ფრაგმენტაცია.
Დაგვიკავშირდით! / Გვკითხე ჩვენ!
ლიტერატურა/ცნობარი
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): ნიმუშის დამუშავება ენტეროჰემორაგიული Escherichia coli (EHEC) დნმ-ის ჩიპების მასივზე დაფუძნებული ანალიზისთვის. მიკრობული უჯრედების ქარხნები 7:29. 2008 წ.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA დუმილი აბრუნებს დოქსორუბიცინის წინააღმდეგობას ადამიანის მსხვილი ნაწლავის კიბოს უჯრედებში. მოლეკულური კიბოს კვლევა 6 (10), 2008 წ.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid NHH, Simonsson M. (2008): მიცელიიდან და ხორბლიდან ფუზარიუმის დნმ-ის ექსტრაქციის მეთოდის შეფასება რეალურ დროში PCR რაოდენობრივად და მიკოტოქსინის დონეებთან კორელაციისთვის. ჟურნალი მიკრობიოლოგიური მეთოდები 2008 წ.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Leishmania tarentolae-ის ზრდის ქცევის დახასიათება - რეკომბინანტული ცილების ექსპრესიის ახალი სისტემა. ჟურნალი ძირითადი მიკრობიოლოგიის 47, 2007. 384-393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem MA, Mathieson PW, Welsh GI, Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Neph3 გენის რეგულირება პოდოციტებში - ტრანსკრიპციის ფაქტორების NF-κB და Sp1 ძირითადი როლები. BMC Molecular Biology 10:83, 2009 წ.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado MA (2008): გენომის მასშტაბური თვალყურის დევნება არამეთილირებული დნმ Alu-ს მეორდება ნორმალურ და კიბოს უჯრედებში. ნუკლეინის მჟავების კვლევა ტ. 36, No3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): ჰისტიდინის ტრიადის პროტეინი მინიშნება1 იწვევს აპოპტოზს მისი ფერმენტული აქტივობისგან დამოუკიდებლად. ჟურნალი ბიოლოგიური ქიმია. ტ. 281, No37, 2006. 27356–27366.
ფაქტები, რომელთა ცოდნაც ღირს
რა არის დნმ-ის გაპარსვა?
დნმ-ის გაპარსვა არის პროცესი, რომელიც გამოიყენება დნმ-ის მოლეკულების უფრო პატარა ნაჭრებად დაყოფისთვის, როგორც წესი, მექანიკური ძალების მეშვეობით, როგორიცაა გაჟონვა. ეს ტექნიკა ჩვეულებრივ გამოიყენება მოლეკულურ ბიოლოგიაში დნმ-ის მოსამზადებლად თანმიმდევრობის ან სხვა ანალიზისთვის, რაც უზრუნველყოფს ფრაგმენტების მართვადი და თანმიმდევრული ზომის. გაპარსვა არღვევს დნმ-ის გრძელ ძაფებს თანმიმდევრობით სპეციფიკური ჭრილობის გარეშე, ფერმენტული მონელებისგან განსხვავებით, რომელიც იშლება კონკრეტულ ადგილებში.
რატომ არის საჭირო დნმ-ის გახეხვა?
საჭიროა დნმ-ის გაკვეთა, რათა შეიქმნას მართვადი, ერთიანი ზომის ფრაგმენტები, რომლებიც შესაფერისია თანმიმდევრობის, ბიბლიოთეკის მომზადებისა და მოლეკულური ბიოლოგიის სხვა ტექნიკისთვის. ისეთ პროგრამებში, როგორიცაა შემდეგი თაობის თანმიმდევრობა, ფრაგმენტული დნმ იძლევა საშუალებას წარმოქმნას გადახურული თანმიმდევრობა, რომელიც შეიძლება გამოთვლითი ხელახლა შეიკრიბოს ორიგინალური დნმ-ის თანმიმდევრობის აღსადგენად. ცვლა ასევე ხელს უწყობს დნმ-ის რანდომიზაციას, რაც საშუალებას იძლევა გენეტიკური მასალის ყოვლისმომცველი ნიმუშის აღება, რაც გადამწყვეტია ზუსტი ანალიზისა და გენეტიკური ვარიაციების იდენტიფიკაციისთვის.
როგორ დავჭრათ გენომის დნმ?
გენომიური დნმ-ის გათიშვა შესაძლებელია მექანიკური ძალების გამოყენებით, როგორიცაა სონიკა, რომელიც იყენებს ულტრაბგერითი ტალღებს დნმ-ის დასაშლელად. ალტერნატიულად, ენდონუკლეაზებთან ფერმენტული ცვლა შეიძლება გამოყენებულ იქნას კონტროლირებადი ფრაგმენტაციისთვის. მეთოდისა და პირობების არჩევანი, როგორიცაა ხანგრძლივობა და ინტენსივობა, დამოკიდებულია ფრაგმენტის სასურველ ზომაზე და ქვედა დინების აპლიკაციებზე.