ულტრაბგერითი დნმ Shearing

• დნმ-ისა და რნმ-ის დროს, დნმ-ის მოლეკულები მცირდება პატარა ნაჭრებად. დნმ / რნმ ფრაგმენტაცია არის ერთ-ერთი მნიშვნელოვანი ნიმუში, რომელიც საჭიროა მომავალი თაობის თანმიმდევრულობისთვის (NGS) ბიბლიოთეკების შექმნისათვის.
• ულტრაბგერითი დნმ-ის შერევა იყენებს აკუსტიკური კვეთის ძალებს დნმ-ის ან რნმ-ს შესვენების 100 – 5kb bp.
• ულტრაბგერითი მატონიზირებელი საშუალებას იძლევა ზუსტი დნმ ფრაგმენტაციისა და ადაპტაციისთვის სასურველი დნმ-ის სიგრძისთვის.

ულტრაბგერითი დნმ Shearing

Hielscher Ultrasonics სთავაზობს სხვადასხვა ულტრაბგერითი დაფუძნებული გადაწყვეტილებები დნმ, RNA და ქრომატინის shearing. არჩევა შორის probe ტიპის ულტრაბგერითი (მაგ. UP100H) პირდაპირი sonication გამოყენებით microtip, ან გამოიყენოთ VialTweeeter ან ულტრაბგერითი cuphorn ამისთვის არაპირდაპირი დნმ მომზადება სხვადასხვა ნიმუშები ერთდროულად. Hielscher გთავაზობთ იდეალური მოწყობილობის გათვალისწინებით თქვენს საჭიროებებს: wether გაქვთ 1 ან 10 ნიმუშები, ტომი microliter to ლიტრი ტომი – Hielscher ულტრაბგერითი პროცესორები ხელმისაწვდომია თქვენი მოთხოვნების დასაკმაყოფილებლად დნმ-ის, რნმ-ს და ქრომატინის ფრაგმენტების სწორი სიგრძით. რეპროდუცირება, მარტივი ოპერაცია და ზუსტი კონტროლი საშუალებას მისცემს საიმედო ბიბლიოთეკას მომდევნო თაობის თანმიმდევრობისთვის.
ფერმენტული დნმ-ის ფრაგმენტაციისგან განსხვავებით, ულტრაბგერითი შეფუთვა სუფთა მექანიკური თრთოლვის ძალებს იყენებს ქიმიურ ნივთიერებებთან ერთად. პროცესის პარამეტრების ზუსტი პარამეტრით, ულტრაბგერითი თიაქარი აწარმოებს მაღალი მოლეკულური მასის დნმ-ს ფრაგმენტებს (პლაზმადი და გენომური დნმ).
გაწმენდილი ნუკლეინის მჟავები შეიძლება გაძლიერდეს ფრაგმენტაციის წინ ან მის შემდეგ.
Sonication პარამეტრების (ძალა, პულსი ციკლი / bursts, დრო და ტემპერატურა) შეიძლება კონტროლდება უსაფრთხოდ პროგრამული უზრუნველყოფის საშუალებით.

ოქმები ულტრაბგერითი დნმ-ის სამკურნალოდ

ქრომატინის იმუნოპრეპიტაციისთვის

მოკლედ, უჯრედები 60 მმ-დიამეტრის კერძებით იყო გათვლილი (400,000 კერძი) და ტრანსოფიცირებული RhoA siRNA- ში (როგორც აღწერილია); მას შემდეგ, რაც 72 საათში, ისინი ინახებდნენ ფორმალდეჰიდის (საბოლოო კონცენტრაცია, 1%), 10 წთ, 37 ° C- ზე დნმ-ზე გადასასვლელად. კროს-ბმული რეაქცია გაჩნდა 1.25 მლ / ლ გლიცინის ერთი მეათედი მოცულობის დამატებით, რაც 125 მმოლ / ლ საბოლოო კონცენტრაციას აძლევდა. უჯრედები დაიბანეთ ორჯერ ცივი-ცივი PBS- ით, რომლებიც აღინიშნა რადიომემუნოპრეციტაციურ აბაშით ბუფერში [150 მმოლი / ლ NaCl, 1% NP40, 0.5% დეოქსიოქოლტატი, 0.1% SDS, 5 მმოლი / L EDTA, 50 მმოლ / ლ Tris-HCl (pH 8.0 )] 1 მმოლ / ლ ფენიილმეთილფლფლონის ფლორდის შემცველი, 1 აგ / მლ აპროტინინი და 1 აგლ / მლ პპპსტატინი A და ინახება ყინულზე 30 წთ. შემდეგ, საკანში lysates იყო sonicated on ice ერთად Hielscher UP200S ულტრაბგერითი გამაძლიერებელი (3 x 40 s, ამპლიტუდა 40%, ციკლი 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), სანამ ჯვარედინი კრომატინებს იყენებდნენ დნმ-ის ფრაგმენტებს 200 და 1000 bp- ს შორის. მთელი მეათედი მთელი ლაზეთი იყო გამოყენებული სხვადასხვა რაოდენობით დნმ-ის რაოდენობის რაოდენობით და განიხილებოდა “სულ შეყვანის დნმ”. Supernatants იყო incubated ერთად ორაგული სპერმის დნმ / ცილის agarose-50% slurry შემცირება nonspecific ფონზე. Immunoprecipitation გაკეთდა ღამით 4 ° C 5 ანტი- NF-nB p65 (Upstate) ან ანტისხეულების გარეშე (უარყოფითი კონტროლი). ეს სუპერნატანები 5 მლ / ლ NaCl- ს და დამატებული ღამით 65 ° C- ზე დაემატა პროტეინის დნმ-ის კასეტური კავშირების აღსადგენად. იმუნოკომპლექსი შემდგომი მკურნალობა იყო DNase- ს და RNase- ზე თავისუფალი პროტეინების K, ხოლო დნმ გაწმენდა ფენოლის / ქლოროფის მოპოვებისა და ეთანოლის ნალექებით. PCR გაკეთდა სპეციფიკური პირებისათვის, რომლებიც შეესაბამება ადამიანის iNOS გენი (P1 პრაიმერი: 5-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3, P2 პრაიმერი: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3). (Doublier et al., 2008)

EGFP- გამოხატვის კვლევები

გამოხატვის შესწავლისათვის, წინამორბედი აღწერილი სხვადასხვა მედიაში გაშენებულია EGFP (გაძლიერებული მწვანე ფლუოროცენტული პროტეინი), ქრომოსომული სსუ ინტეგრირებული გენომის მქონე რევოლბინირებული შტამები L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, გერმანია) დამატებით დამატებით შეესაბამება 100 მგ^-1 ნოვრსატერინინი (იენა ბიოსეინსი, გერმანია). გაშენების დროს 1 მლ ნიმუშები გადაიყვანეს, ცენტრიფუგა (2000 × გ, 20 ° C, 10 წთ) და გარეცხილი 0.9% NaCl ხსნარი. Pellet იყო resuspended ბუფერული (20 მმ HEPES, 5 mM EDTA, 2 მმ DTT) და დაშლის მიერ sonification ერთად ულტრაბგერითი პროცესორი UP400S (ენერგიის გამოყენება ~ 400 WS). უჯრედული ნამსხვრევები ამოღებულ იქნა ცენტრიფუგაციით (6000 × გ, 4 ° C, 5 წთ) და გაანალიზებულია ნატრიუმის დოდიცილის სულფატით - პოლიკარლილამიდული გელი ელექტროფორეზის (SDS-PAGE) მიერ ლაემლიმის მეთოდით (1970) მეთოდით, 12.5% ​​პოლიგრალამიდის ლარით . EGFP- გამოხატვა შეისწავლა წყნარ კულტურაში. (ფრიშჩე 2007 წ.)

ქრომატინის იმუნოპრეპიტაცია

Chromatin immunoprecipitation assay შესრულდა გამოყენებით ChIP-IT^TM ექსპრეს (აქტიური მოტივი, Carlsbad, CA, აშშ) მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით, გარკვეული ცვლილებებით. მოკლედ, დიფერენცირებული ადამიანური podocytes იყო cross-linked 1% formaldehyde 10 წთ ოთახის ტემპერატურაზე. უჯრედები გარეცხილი იყო ცივი ცივი PBS და ფიქსაციის რეაქცია შეჩერდა ოთახის ტემპერატურაზე 0.125 მ გლიცინის 5 წუთის განმავლობაში. უჯრედები კვლავ გარეცხილი იყო ცივი-ცივი PBS- სგან და კერძიდან ჩამოიტანეს. საკნები გაჟღენთილი იყო ცენტრიფუგაით და აღინიშნა ლიზისის ბუფერში. ცენტრიფუგის შემდეგ, ბალიშების ბირთვში აღინიშნებოდა მარილიანი ბუფერში, ყინულზე 30 წუთის განმავლობაში ინკუბაცია და ქრომატინი გამოიმუშავებდა sonication UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, გერმანია) ზე 25% ძალაუფლება 5 pulses 20 წმ თითოეული ყინულის შევიდა ფრაგმენტები დაახლოებით 200-600 bp. გაჟღენთილი ქრომატინი იყო ცენტრიფუგირებული და ზედამხედველი შეაგროვა. იმუნოპრეციტაციებისთვის 60 გრამი ქრომატინი იყო Sp1 (სანტა კრუზი ბიოტექნოლოგია, სანტა კრუზი, CA, აშშ), NF-κB p65 (Abcam, კემბრიჯი, დიდი ბრიტანეთი) ან NF-κB p50 (Abcam) ანტისხეულები ან კურდღლის IgG (Zymed Laboratories, სამხრეთ სან ფრანცისკო, CA, აშშ), როგორც უარყოფითი კონტროლი, ღამის 4 ° C ნაზი როტაცია. Immunocomplexes, რომლებიც დაკავშირებულია მაგნიტური მძივებისგან, შეგროვდა მაგნიტური სტენდით, ინტენსიურად დაიბანდა და ცილა / დნმ-იანი გადაკვეთა იყო შეცვლილი და დნმ-ის რეალურ დროში PCR ანალიზისთვის. (Ristola et al. 2009)

EHEC დნმ-ის მომზადება ჩიპ-არითის ანალიზისათვის

უჯრედის ლაზერი და მოპოვებული დნმ-ის მოწყობა
PBS- ში ბაქტერიული მარცვლები შეჩერდა სასურველ საბოლოო კონცენტრაციასთან ულტრაბგერითი disruptor UP100H (Hielscher GmbH, გერმანია) აღჭურვილია microtip MS1 (1 მმ დიამეტრის). ოპერაციული სიხშირე იყო 30 kHz და ეფექტური გამომავალი სიმძლავრე იყო 100 W. ექსპლუატაციის დროს ნიმუშები გაცივდა ყინულის აბანოში, შერეული და ცენტრიფუგირებული. ნიმუშები გამოყენებული იყო ნაკადის ციტომეტრიული კვლევებისთვის, ხოლო მოგვიანებით გატარება, ნიმუშები სითბოს მკურნალობას ექვემდებარებოდა (95 ° C, 5 წთ). ნედლეულის უჯრედები ფენოლის ნარევით იყო დამუშავებული: ქლოროფორმა: იზომალილის სპირტი (25: 24: 1). ლაზერული ნიმუში დაემატა ამ mix- ის თანაბარი მოცულობა, ხსნარი 15 სანტიმეტრით და 15 კმ / სთ-ის დაშორებით, ოთახის ტემპერატურაზე (მინ.) 22 ° C- ზე. გენომური დნმ-ის შემცველი ზედა ფაზა ფრთხილად იყოფა და შეგროვდა ახალი სტერილური Eppendorf მილის.
მოგვიანებით, ნიმუშები sonicated ფრაგმენტი დნმ. გამონაბოლქვის ნაბიჯი განხორციელდა იმავე პირობებში, როგორც ზემოთ აღწერილი. გენომური დნმ-ის ფრაგმენტაციის ეფექტის შესაფასებლად, ნიმუშები გაანალიზდა აგარუსის გელი ელექტროფორეზის გამოყენებით.
(…) 2.5 წთ-ზე ადრე მოქმედი ნიმუშები სითბური მკურნალობისა და ცენტრიფუგაციის შემდეგ მოპოვების ნაბიჯს დაექვემდებარა. დნმ გაათავისუფლეს ორჯერ ფენოლთან: ქლოროფის: იზომალის ალკოჰოლური მიქსი და შემდგომში მეორე სიმულაცია ექვემდებარება 0-15 წთ. აეროზოლური გელი ელექტროფორეზი იქნა გამოყენებული, რათა დადგინდეს დნმ-ის ზომა განაწილება, რომელიც ექვემდებარება პოსტ-მოპოვების ულტრაბგერითი ფრაგმენტაციას (ნახაზი ზედა მარჯვენა მხარეს). მაღალი ფრაგმენტული დნმ-ს გამოხატავდა დნმ-ის ნაცხის არსებობა, ვიდრე მაღალი მოლეკულური წონის ზოლები, რომლებიც აღმოიფხვრა ნიმუშებისგან 2.5 წთ-ის ან უფრო დიდხანს. გრძელი sonication თანდათანობით შემცირდა ფრაგმენტი lengths დაახლოებით 150 - 600 bp და sonication 15 წუთის კიდევ დეგრადირებული ეს ფრაგმენტები, როგორც ჩანს, ძირითადად ზედა ნაწილში ნაცხის. ამდენად, საშუალო დნმ-ის ფრაგმენტი ზომა თანდათან უარი თქვა ულტრაბგერითი დროის და 5 წთ მკურნალობის უფლებას, რომლითაც შესაძლებელი იქნებოდა დნმ-ის ფრაგმენტების ზომები, რომლებიც შესაფერისია ჩიპური მასივისთვის. ბოლოს და ბოლოს, დნმ-ის ანალიზის მოსამზადებელი პროცედურა შედგებოდა ულტრაბგერითი მკურნალობის პირველი 2 წუთი, დნმ-ის მოპოვება (2 ×) და შემდგომი 5 წთანიანი sonication. (ბასელეტ და 2008 წ.)

ქრომატინის იმუნოპრეპიტაცია (ჩიპი)

HK293 უჯრედები კულტივირებული იყო როგორც ზემოთ აღწერილი და ფიქსირებული 2 მმ-იანი disuccinimidyl-glutarate 45 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. შემდგომში, უჯრედები ორჯერ იყვნენ გარეცხილი PBS- ით. ქრომატინი 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე 1% -ით (ვ / ვ) ფორმალდეჰიდის გამოყენებით ხორციელდება, ხოლო ორჯერ ცივი ცივი PBS- ით. ჯვარედინთან დაკავშირებული რეაქცია შეჩერდა გლიცინით, მაქსიმალური კონცენტრაციით 0.125 მ ოთახის ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში. თირკმელთან ინკუბაციის შემდეგ, საკნები საკნის კულტურის კერძიდან ჩამოიტანეს და PBS- ს ორჯერ დაიბანეთ. საკანში pellet იყო resuspended წელს lysis ბუფერი (5 mM მილები, pH 8.0, 85 მმ KCl, და 0.5% (v / v) Nonidet P-40), incubated ყინულის 10 წუთი და ჰომოგენიზირებული ერთად Dounce homogenizer. შემდგომში ბირთვებმა პერფორაცია (3500 კგ, 5 წთ, 4 ° C) და ბირთვული ბუფერში (50 მმ-ის Tris-HCl, pH 8.1, 10 მმ EDTA და 1% (w / v) SDS). ბირთვებმა ჩაიშალა sonication მიერ სამი 20-იანი pulses a UP50H გამაძლიერებელი (Hielscher Ultraschall Technologie) ციკლი 0.5 და ამპლიტუდა 30% -ს, გენომური დნმ-ს ფრაგმენტების გამოყოფა 200-1000 bp. იმუნოპრეციტაციურ ბუფერზე (16.7 მმ Tris-HCl, pH 8.1, 167 მმ NaCl, 1.2 მმ EDTA, 1.1% (v / v) ტრიტონის X-100 და 0.01% ვ) SDS). (Weiske et al 2006)

ქრომატინის იმუნოპრეიპაციის (ჩიპი) მიერ ჰისტონის მოდიფიკაციის ანალიზი

მოკლედ, 6 x 10⁶ უჯრედები ორჯერ დაიბანეთ PBS- ით და კულტურის ფირფიტაზე 15 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე 0.5% ფორმალდეჰიდის არსებობით. გათიშვის რეაქცია შეჩერდა 0.125 მგ გლიკინთან ერთად. ყველა შემდგომი ნაბიჯი განხორციელდა 48 ° C. ყველა ბუფერი იყო წინასწარ გაცივებული და შეიცავს პროტეაზას ინჰიბიტორებს (სრული მინი, როჩე). უჯრედები ორჯერ PBS- ით იყო გარეცხილი და შემდეგ გაანადგურეს. შეგროვებული მარცვლები დაიშალა 1 მლ ლიზის ბუფერში (1% SDS, 5 მმ EDTA, 50 მმ Tris pH 8) და იყენებდნენ ცივი ეთანოლის აბანოში 10 ციკლისთვის 100% ამპლიტუდის გამოყენებით UP50H გამაძლიერებელი (Hielscher, Teltow, გერმანია). ქრომატინის ფრაგმენტაცია იყო 1% აარარუსის გელით. მიღებული ფრაგმენტები იყო 200-500pb სპექტრი. ხსნადი ქრომატინი მიიღება sonicated ნიმუშების ცენტრიფუგის მიერ 14,000 გ 10 წუთის განმავლობაში 48 ° C. ხსნადი ფრაქციამ გამხსნელის ბუფერში 1/10 გაზავდა (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 მმ Tris pH 8, 150 მმ NaCl), შემდეგ კი 80 ° C ტემპერატურაზე ინახება. (როდრიგესი და სხვ. 2008)