ულტრაბგერითი დნმ-ის ფრაგმენტაცია

დნმ-ისა და რნმ-ის დასხვრევის დროს გრძელი დნმ-ის მოლეკულები იშლება უფრო მცირე ფრაგმენტებად, რაც გადამწყვეტი ეტაპია ნიმუშების მომზადებისთვის შემდეგი თაობის სეკვენირების (NGS) ბიბლიოთეკის შესაქმნელად. ულტრაბგერითი დნმ-ის დასხვრევა იყენებს აკუსტიკური კავიტაციის ძალებს დნმ-ის ან რნმ-ის დასაშლელად 100 bp-დან 5 kb-მდე ზომის ფრაგმენტებად. ეს მეთოდი საშუალებას იძლევა ფრაგმენტის ზომა ზუსტად კონტროლდებოდეს, რაც ხელს უწყობს მის მორგებას სასურველ დნმ-ის სიგრძეზე ოპტიმალური სეკვენირების შედეგებისთვის.

დნმ-ის დასხვრევა ულტრაბგერითი დამუშავების გამოყენებით

Hielscher Ultrasonics სთავაზობს ულტრაბგერაზე დაფუძნებულ სხვადასხვა გადაწყვეტილებას დნმ-ის, რნმ-ისა და ქრომატინის დასხვრევისთვის. აირჩიეთ პრობის ტიპის ულტრაბგერითი დისპერგატორები (მაგ. UP100H) მიკროსონოტროდით პირდაპირი ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის, ან გამოიყენეთ VialTweeter ან ულტრაბგერითი cuphorn სხვადასხვა ნიმუშის ერთდროული ირიბი დნმ-ის მოსამზადებლად. Hielscher გთავაზობთ იდეალურ მოწყობილობას თქვენი საჭიროებების შესაბამისად: გაქვთ 1 თუ მაქსიმუმ 10 ნიმუში, მოცულობები მიკროლიტრიდან ლიტრამდე – Hielscher-ის ულტრაბგერითი დისპერგატორები დააკმაყოფილებენ თქვენს მოთხოვნებს დნმ-ის, რნმ-ისა და ქრომატინის ფრაგმენტების სწორ სიგრძეზე მოსამზადებლად. გამეორებადობა, მარტივი ექსპლუატაცია და ზუსტი კონტროლი საშუალებას იძლევა მივიღოთ საიმედო ბიბლიოთეკა შემდეგი თაობის სეკვენირებისთვის.
ენზიმური დნმ-ის ფრაგმენტაციისგან განსხვავებით, ულტრაბგერითი დასხვრევა იყენებს წმინდა მექანიკური ძვრის ძალებს ქიმიკატების დამატების გარეშე. პროცესის პარამეტრების ზუსტი დაყენებით, ულტრაბგერითი დასხვრევა იძლევა მაღალმოლეკულური მასის დნმ-ის ფრაგმენტებს (პლაზმიდური და გენომური დნმ).
გაწმენდილი ნუკლეინის მჟავები შეიძლება გამრავლდეს (ამპლიფიკაცია) ფრაგმენტაციის ეტაპამდე ან მის შემდეგ.
ულტრაბგერითი დამუშავების პარამეტრები (სიმძლავრე, იმპულსური ციკლი / ბურსტები, დრო და ტემპერატურა) შეიძლება უსაფრთხოდ კონტროლდებოდეს პროგრამული უზრუნველყოფის პარამეტრების მეშვეობით.

ულტრაბგერითი დნმ-ის დასხვრევის პროტოკოლები

ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაციის ანალიზისთვის

მოკლედ, უჯრედები დაიყარა 60mm დიამეტრის ჭურჭელში (400 000 თითო ჭურჭელში) და ტრანსფექტირებული იქნა RhoA siRNA-ით (როგორც აღწერილია); 72 h-ის შემდეგ, ისინი ინკუბირებულ იქნა ფორმალდეჰიდთან (საბოლოო კონცენტრაცია, 1%) 10 min-ის განმავლობაში 37°C-ზე ცილების დნმ-თან დასაკავშირებლად. დაკავშირების რეაქცია შეწყვეტილი იქნა 1,25 mol/L გლიცინის ერთი მეათედის მოცულობის დამატებით, რამაც მოგვცა 125 mmol/L საბოლოო კონცენტრაცია. უჯრედები ორჯერ გაირეცხა ყინულის ცივი PBS-ით, გადაიტანეს რადიოიმუნოპრეციპიტაციის ანალიზის ბუფერში [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% დეოქსიქოლატი, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] შემცველი 1 mmol/L ფენილმეთილსულფონილ ფლუორიდი, 1 Ag/mL აპროტინინი და 1 Ag/mL პეპსტატინი A, და ინახებოდა ყინულზე 30 min-ის განმავლობაში. შემდეგ, უჯრედული ლიზატები ულტრაბგერითად დამუშავდა ყინულზე Hielscher UP200S ულტრაბგერითი დამუშავების მოწყობილობით (3 x 40 წმ, ამპლიტუდა 40%, ციკლი 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), სანამ ჯვარედინად დაკავშირებული ქრომატინი არ დასხვრევდა 200-დან 1 000 bp-მდე დნმ-ის ფრაგმენტებად. მთლიანი ლიზატის ერთი მეათედი გამოიყენეს სხვადასხვა ნიმუშში არსებული დნმ-ის რაოდენობის დასადგენად და ჩაითვალა „მთლიან შეყვანილ დნმ-ად“. სუპერნატანტები ინკუბირებულ იქნა სალმონის სპერმის დნმ/ცილის აგაროზა-50% სუსპენზიასთან არასპეციფიკური ფონის შესამცირებლად. იმუნოპრეციპიტაცია შემდეგ განხორციელდა ღამით 4°C-ზე 5 Ag ანტი-NF-nB p65-ით (Upstate) ან ანტისხეულის გარეშე (უარყოფითი კონტროლი). ამ სუპერნატანტებს დაემატა 5 mol/L NaCl და გაცხელდა ღამით 65°C-ზე ცილა-დნმ ჯვარედინი ბმების გასაუქმებლად. იმუნოკომპლექსები დამატებით დამუშავდა DNase- და RNase-გან თავისუფალი პროტეინაზა K-ით, და დნმ გადასუფთავდა ფენოლი/ქლოროფორმის ექსტრაქციით და ეთანოლით ნალექის წარმოქმნით. PCR განხორციელდა სპეციფიკური პრაიმერებით, რომლებიც შეესაბამება თანმიმდევრობას ადამიანის iNOS გენის პრომოტორულ რეგიონში (p1 პრაიმერი: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 პრაიმერი: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-ექსპრესიის კვლევები

ექსპრესიის კვლევებისთვის, რეკომბინანტური შტამი L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Germany), რომელიც შეიცავს EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) გენს, ქრომოსომული ssu ინტეგრირებული, კულტივირებული იყო სხვადასხვა საკვებ არეში, როგორც უკვე აღინიშნა, და დამატებით შეიცავდა 100 მგ ლ^-1 ნორსოთრიცინს (Jena Bioscience, Germany). კულტივირების პერიოდში, აღებული იყო 1 ml ნიმუშები, ცენტრიფუგირებული (2000 × g, 20°C, 10 min) და გარეცხილი 0,9% NaCl ხსნარით. ნალექი ხელახლა განაწილებული იყო ბუფერში (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) და დაშლილი იყო ულტრაბგერითი დამუშავებით ულტრაბგერითი პროცესორით UP400S (ენერგიის გამოყენება ∼ 400 Ws). უჯრედული ნამსხვრევები მოცილებული იყო ცენტრიფუგირებით (6000 × g, 4°C, 5 წთ) და ანალიზდებოდა ნატრიუმის დოდეცილსულფატ – პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზით (SDS-PAGE) აღმდგენ პირობებში Laemmli-ის (1970) მეთოდის შესაბამისად, 12,5% პოლიაკრილამიდის გელებით. EGFP ექსპრესია შეფასდა მორხეულ (შეანჯღრეულ) კულტურაში. (Fritsche et al. 2007)

ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაცია

ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაციის ანალიზი ჩატარდა ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) მწარმოებლის ინსტრუქციების შესაბამისად, ზოგიერთი ცვლილებით. მოკლედ, დიფერენცირებული ადამიანის პოდოციტები დაჯვარედინდა 1% ფორმალდეჰიდით 10 წთ განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. უჯრედები გარეცხილი იყო ყინულოვანი PBS-ით და ფიქსაციის რეაქცია შეჩერდა 0,125 M გლიცინის დამატებით 5 წთ განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. უჯრედები ხელახლა გარეცხილი იყო ყინულოვანი PBS-ით და მოცილებული იყო თეფშიდან. უჯრედები ნალექდებოდა ცენტრიფუგირებით და ხელახლა განაწილებული იყო ლიზის ბუფერში. ცენტრიფუგირების შემდეგ, ნალექდებული ბირთვები ხელახლა განაწილებული იყო დასაშლელ ბუფერში, ინკუბირდებოდა ყინულზე 30 წთ და ქრომატინი იშლებოდა ულტრაბგერითი დამუშავებით, მაგ. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germany) 25% სიმძლავრით, 5 იმპულსი თითოეული 20 წმ-ის ხანგრძლივობით, ყინულზე, დაახლოებით 200–600 bp ფრაგმენტებად. დასხვრეული ქრომატინი შემდეგ ცენტრიფუგირდა და სუპერნატანტი შეგროვდა. იმუნოპრეციპიტაციისთვის, 60 μl ქრომატინი ინკუბირდებოდა 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ან NF-κB p50 (Abcam) ანტისხეულებთან ან კურდღლის IgG-თან (Zymed Laboratories), როგორც უარყოფით კონტროლთან, ღამის განმავლობაში 4°C-ზე მსუბუქი ბრუნვით. მაგნიტურ მარცვლებთან დაკავშირებული იმუნოკომპლექსები შეგროვდა მაგნიტური სადგარის გამოყენებით, ფართოდ გარეცხილი იყო, ცილა/დნმ ჯვარედინი ბმები გაუქმდა და დნმ ელუირდა რეალური დროის PCR ანალიზისთვის. (Ristola et al. 2009)

EHEC დნმ-ის მომზადება ჩიპის მასიზის ანალიზისთვის

უჯრედული ლიზატების და ამოღებული დნმ-ების მოწყობა
ბაქტერიული ნალექები, რომლებიც განაწილებული იყო PBS-ში სასურველი საბოლოო კონცენტრაციამდე, დამუშავდა ულტრაბგერითი დისრუპტორით UP100H (Hielscher GmbH, Germany) აღჭურვილია მიკროტიპით MS1 (დიამეტრი 1mm). სამუშაო სიხშირე იყო 30 kHz და ეფექტური გამომავალი სიმძლავრე 100 W. ოპერაციის დროს, ნიმუშები გაცივდა ყინულოვან წყალბანში, შერეული და ცენტრიფუგირებული იყო. ნიმუშები გამოიყენებოდა ნაკადის ციტომეტრიის კვლევებისთვის, ხოლო შემდგომი დამუშავებისთვის, ნიმუშები დაექვემდებარა სითბურ დამუშავებას (95°C, 5 min). მუდმივი უჯრედული ლიზატები დამუშავდა ფენოლი:ქლოროფორმი:იზოამილ სპირტის ნარევით (25:24:1). ამ ნარევის თანაბარი მოცულობა დაემატა ლიზატის ნიმუშს, ხსნარი მკვეთრად ვორტექსირდა 15 s და ცენტრიფუგირდა 15 000 x g სიჩქარით 2 min ოთახის ტემპერატურაზე (RT) დაახლოებით 22°C. ზედა წყალხსნადი ფაზა, რომელიც შეიცავდა გენომურ დნმ-ს, ფრთხილად გამოიყო და შეგროვდა ახალ სტერილურ ეპენდორფის ჭურჭელში.
შემდეგ, ნიმუშები ულტრაბგერითი დამუშავების საშუალებით დნმ-ის ფრაგმენტაციისთვის გამოიყენეს. ულტრაბგერითი დამუშავების ეტაპი განხორციელდა ზემოთ აღწერილი იგივე პირობებით. გენომურ დნმ-ზე ფრაგმენტაციის ეფექტების შესაფასებლად, ნიმუშები ანალიზდებოდა აგაროზის გელის ელექტროფორეზის გამოყენებით.
(…) ნიმუშები, რომლებიც ადრე 2,5 min ულტრაბგერით დამუშავდა, სითბური დამუშავებისა და ცენტრიფუგირების შემდეგ დაექვემდებარა ექსტრაქციის ეტაპს. გამოთავისუფლებული დნმ ორჯერ ამოიღეს ფენოლი:ქლოროფორმი:იზოამილის სპირტის ნარევით და შემდეგ დაექვემდებარა მეორე ულტრაბგერით დამუშავებას 0 – 15 min ხანგრძლივობით. აგაროზის გელის ელექტროფორეზი გამოიყენეს ექსტრაქციის შემდგომი ულტრაბგერითი ფრაგმენტაციის დაქვემდებარებული დნმ-ის ზომის განაწილების დასადგენად (ნახ. ზედა მარჯვენა მხარეს). ძლიერ ფრაგმენტირებულ დნმ-ზე მიუთითებდა დნმ-ის ნაცხის არსებობა მაღალმოლეკულური ზოლების ნაცვლად, რომლებიც 2,5 min ან მეტი ხნის განმავლობაში დამუშავებულ ნიმუშებში გაქრა. უფრო ხანგრძლივი ულტრაბგერითი დამუშავება თანდათან ამცირებდა ფრაგმენტების სიგრძეს დაახლოებით 150 – 600 bp-მდე, ხოლო 15 min ულტრაბგერითი დამუშავება ამ ფრაგმენტებს კიდევ უფრო შლიდა, რაც ძირითადად ნაცხის ზედა ნაწილში ჩანს. ამრიგად, დნმ-ის ფრაგმენტების საშუალო ზომა თანდათან მცირდებოდა ულტრაბგერითი დამუშავების დროის მატებასთან ერთად და 5 min დამუშავება იძლეოდა დნმ-ის ფრაგმენტების იმ ზომებს, რომლებიც ყველაზე შესაფერისია ჩიპ-მასივის ანალიზებისთვის. საბოლოოდ დადგინდა დნმ-ანალიტის მომზადების პროცედურა, რომელიც მოიცავდა ჯერ 2 min ულტრაბგერით დამუშავებას, დნმ-ის ექსტრაქციას (2×) და შემდეგ 5 min ულტრაბგერით დამუშავებას. (Basselet et al. 2008)

ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაცია (ChIP)

HEK293 უჯრედები კულტივირდებოდნენ ზემოთ აღწერილი მეთოდით და ფიქსირდებოდნენ 2 mM დისუქცინიმიდილ-გლუტარატით 45 min ოთახის ტემპერატურაზე. შემდეგ, უჯრედები ორჯერ გარეცხილი იყო PBS-ით. ქრომატინი ჯვარედინად შეკავშირებული იყო 10 min ოთახის ტემპერატურაზე 1% (v/v) ფორმალდეჰიდის გამოყენებით და ორჯერ გარეცხილი იყო ყინულოვანი PBS-ით. ჯვარედინი შეკავშირების რეაქცია შეჩერდა გლიცინთან ინკუბაციით საბოლოო კონცენტრაციით 0,125 M 5 min ოთახის ტემპერატურაზე. ტრიფსინთან ინკუბაციის შემდეგ, უჯრედები მოცილდებოდნენ უჯრედული კულტურის ჭურჭელს და ორჯერ გარეცხილი იყო PBS-ით. უჯრედული ნალექი ხელახლა შედგა ლიზის ბუფერში (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl, და 0,5% (v/v) Nonidet P-40), ინკუბირდებოდა ყინულზე 10 min, და ჰომოგენიზდებოდა Dounce ჰომოგენიზატორით. შემდეგ, ბირთვები ცენტრიფუგირებით ნალექდებოდა (3500 x g, 5 min, 4 °C) და ხელახლა შედგა ბირთვულ ბუფერში (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA, და 1% (w/v) SDS). ბირთვები ანგრევდებოდა ულტრაბგერითი დამუშავებით სამი 20-s პულსით UP50H სონიკატორი (Hielscher Ultraschall Technologie) ციკლი 0,5 და ამპლიტუდა 30% პარამეტრებით, რაც იძლეოდა გენომური დნმ-ის ფრაგმენტებს 200 – 1000 bp მასშტაბის ზომით. ChIP-ისთვის, 50g დნმ განზავდა 4-ჯერ იმუნოპრეციპიტაციის ბუფერში (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100, და 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

ჰისტონის მოდიფიკაციის ანალიზი ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაციით (ChIP)

მოკლედ, 6 x 10⁶ უჯრედები ორჯერ გაირეცხა PBS-ით და დაჯვარედინდა კულტურის თეფშზე 15 წთ-ის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე 0,5% ფორმალდეჰიდის თანდასწრებით. ჯვარედინი შეკავშირების რეაქცია შეჩერდა 0,125 M გლიცინის დამატებით. ყველა შემდგომი ეტაპი განხორციელდა 48°C-ზე. ყველა ბუფერი წინასწარ გაგრილდა და შეიცავდა პროტეაზის ინჰიბიტორებს (Complete Mini, Roche). უჯრედები ორჯერ გაირეცხა PBS-ით და შემდეგ ჩამოფხეკილ იქნა. შეგროვებული ნალექი გახსნილ იქნა 1 ml ლიზის ბუფერში (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) და დამუშავდა ულტრაბგერით ცივ ეთანოლის აბაზანაში 10 ციკლის განმავლობაში 100% ამპლიტუდით, გამოყენებით UP50H სონიკატორი (Hielscher, Teltow, Germany). ქრომატინის ფრაგმენტაცია ვიზუალიზებული იქნა 1% აგაროზის გელში. მიღებული ფრაგმენტები იყო 200–500bp დიაპაზონში. ხსნადი ქრომატინი მიღებული იქნა ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ ნიმუშების ცენტრიფუგირებით 14 000g-ზე 10 წთ-ის განმავლობაში 48°C-ზე. ხსნადი ფრაქცია განზავდა 1/10 განზავების ბუფერში (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), შემდეგ დაიყო ალიკვოტებად და შეინახა 80°C-ზე გამოყენებამდე. (Rodriguez et al. 2008)