E. კოლის ულტრაბგერითი ლიზი

  • E. coli ბაქტერია წარმოადგენს ყველაზე ხშირად გამოყენებულ ბაქტერიას მიკრობიოლოგიასა და ბიოტექნოლოგიაში.
  • ულტრაბგერითი უჯრედის დარღვევები ე.კოლის ლილისთვის საიმედო და რეპროდუქციულ შედეგებს აწვდის.
  • ინტენსიური ჯერჯერობით ზუსტად კონტროლირებადი cavitation და shear ძალების შედეგად სრული დარღვევა და მაღალი მოპოვების შემოსავალი (მაგ. ცილები, დნმ).

რატომ არის E. coli-ს ულტრაბგერითი უჯრედების მოშლა სასურველი მეთოდი?

ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები ან ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატები გვთავაზობენ E. coli ლიზის რამდენიმე უპირატესობას, რადგან ინტენსიური ულტრაბგერითი ეფექტურად არღვევს უჯრედის კედლებსა და გარსებს. ზონდის ტიპის ულტრაბგერითები ფართოდ გამოიყენება E. coli ლიზისისთვის შემდეგი მიზეზების გამო:

  • უჯრედის კედლების ეფექტური რღვევა: E. coli-ს აქვს პეპტიდოგლიკანისგან შემდგარი ნახევრად ხისტი უჯრედის კედელი, რომლის დაშლა რთულია ლიზისის ტრადიციული მეთოდების გამოყენებით. ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი წარმოქმნის ინტენსიურ ულტრაბგერით ტალღებს, რომლებიც ქმნიან კავიტაციის ბუშტებს უჯრედების მიმდებარე სითხეში. როდესაც ეს ბუშტები იშლება, ისინი წარმოქმნიან მაღალსიჩქარიან თხევად ნაკადს და დარტყმის ტალღებს, რაც იწვევს უჯრედის კედლების მექანიკურ დარღვევას და ეფექტურად ათავისუფლებს უჯრედულ შიგთავსს, როგორიცაა ბიომოლეკულები.
  • გაძლიერებული შეღწევადობა: ზონდის/სონოტროდის მიერ წარმოქმნილ ულტრაბგერით ტალღებს შეუძლია ღრმად შეაღწიოს ნიმუშში, მიაღწიოს E. coli უჯრედების უფრო დიდ რაოდენობას და დამუშავდეს მათ თანაბრად. ეს უზრუნველყოფს, რომ ლიზისი უფრო ერთგვაროვანი იყოს მთელ ნიმუშში, რაც იწვევს უჯრედების დაშლის უფრო მაღალ ეფექტურობას.
  • შემცირებული დამუშავების დრო: ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი მიწოდებული ენერგია ძალიან კონცენტრირებული და ლოკალიზებულია, რაც იწვევს უჯრედების სწრაფ და ეფექტურ ლიზას. სხვა მეთოდებთან შედარებით, როგორიცაა მძივების დარტყმა ან ფერმენტული ლიზისი, სონიკით შეიძლება მიაღწიოს E. coli ლიზისს რამდენიმე წუთში ან თუნდაც წამში. მიუხედავად იმისა, რომ მრავალი ალტერნატიული ტექნიკა, როგორიცაა გაყინვა-დათბობა, მოითხოვს მკურნალობის რამდენიმე რაუნდს, ულტრაბგერითი ლიზისი ხსნის უჯრედებს ერთი პროცესის საფეხურზე.
  • ტემპერატურის კონტროლი: უახლესი ულტრაბგერითი აპარატები აღჭურვილია ტემპერატურის სენსორებით და ჭკვიანი პროგრამული უზრუნველყოფით, რაც საშუალებას გაძლევთ დააყენოთ პროცესის მაქსიმალური ტემპერატურა. ულტრაბგერითი ავტომატურად ჩერდება ტემპერატურის ლიმიტის მიღწევისას და იწყებს ხმოვან პროცესს, როდესაც მიიღწევა დაყენებული ტემპერატურის წერტილი. ნიმუშების ყინულის აბაზანაში გაცივება მარტივი მეთოდია ნიმუშის დაბალი ტემპერატურის შესანარჩუნებლად და სინჯის სიცხისგან გამოწვეული დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად.
  • მასშტაბურობა: ზონდის ტიპის ულტრაბგერითები ხელმისაწვდომია სხვადასხვა ზომებში, ხელის მოწყობილობებიდან დაწყებული ფართომასშტაბიანი სამრეწველო მოდელებით. ეს მათ შესაფერისს ხდის ლაბორატორიაში მცირე მოცულობის დასამუშავებლად ან უფრო დიდი ბიოპროცესის გამოყენებისთვის, მაგ. ვაქცინის წარმოებისთვის ან მოლეკულების ბიოსინთეზისთვის.
  • მრავალმხრივობა: ულტრაბგერითი აპარატები შეიძლება გამოყენებულ იქნას უჯრედების ლიზის მიღმა სხვადასხვა აპლიკაციებისთვის, როგორიცაა დნმ-ის გათიშვა, ცილების ექსტრაქცია, ქსოვილის ჰომოგენიზაცია, ნანონაწილაკების დისპერსიული და ემულსიფიკაცია. მაშასადამე, ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი ინვესტიცია უზრუნველყოფს მრავალფეროვნებას კვლევის ან სამრეწველო გარემოში.
  • ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი, როგორიცაა UP200St, არის ქსოვილის საიმედო ჰომოგენიზატორები და უჯრედების გამანადგურებელი, ამიტომ ფართოდ გამოიყენება გენეტიკაში ნიმუშის მოსამზადებლად, მაგ., E.coli ლიზისისთვის.

    პროტეინის ექსტრაქცია E.coli უჯრედებიდან ეფექტურად ხორციელდება ულტრაბგერითი ზონდი UP200St

    ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატი ბევრ უპირატესობას გვთავაზობს E. coli ლიზისისთვის. ულტრაბგერითი პროცესის პარამეტრებზე საიმედო და ზუსტი კონტროლი საშუალებას იძლევა ოპტიმიზაცია მოახდინოს ოპერაციული პარამეტრების, როგორიცაა სიმძლავრე, ხანგრძლივობა და ნიმუშის დამუშავება სასურველი შედეგების მისაღწევად.
     

    ინფორმაციის მოთხოვნა




    გაითვალისწინეთ ჩვენი კონფიდენციალურობის პოლიტიკა.


     

    ეს გაკვეთილი განმარტავს, თუ რომელი ტიპის სონიკატორია საუკეთესო თქვენი ნიმუშის მომზადების ამოცანებისთვის, როგორიცაა ლიზისი, უჯრედების დარღვევა, ცილების იზოლაცია, დნმ-ისა და რნმ-ის ფრაგმენტაცია ლაბორატორიებში, ანალიზი და კვლევა. აირჩიეთ იდეალური სონიკატორის ტიპი თქვენი განაცხადისთვის, ნიმუშის მოცულობა, ნიმუშის ნომერი და გამტარუნარიანობა. Hielscher Ultrasonics-ს აქვს თქვენთვის იდეალური ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი!

    როგორ მოვძებნოთ სრულყოფილი სონიკატორი უჯრედების დაშლისა და ცილების ექსტრაქციისთვის მეცნიერებასა და ანალიზში

    ვიდეოს მინიატურა

    ულტრაბგერითი დნმ-ის ფრაგმენტაცია ხშირად გამოიყენება, როგორც ნიმუშის მომზადების ეტაპი შემდეგი თაობის თანმიმდევრობით (NGS)

    E. coli EDL933-ის გენომიური დნმ-ის ელექტროფორეზული ანალიზები ექვემდებარება 0 – 15 წთ ულტრაბგერითი გამოკვლევის დროს. L მიუთითებს დნმ-ის კიბეზე.
    (კვლევა და სურათი: ©Basselet et al. 2008)

    უჯრედის რღვევა ულტრაბგერითი კავიტაციის გამოყენებით

    ულტრაბგერითი ზონდის ტიპის ჰომოგენიზატორები მუშაობენ დაახლ. 20000 ციკლი წამში (20kHz-ზე) და იწვევს კავიტაციას სითხეებში ან სუსპენზიებში. აკუსტიკური კავიტაციის მიკროსკოპული უბნები ვაკუუმის მსგავსი ზეწოლისა და მაღალი ტემპერატურის, რომელიც ანადგურებს უჯრედებს. მიუხედავად იმისა, რომ ტემპერატურამ შეიძლება მიაღწიოს რამდენიმე ათას გრადუს ცელსიუსს, კავიტაციის მოცულობა იმდენად მცირეა, რომ პროცესი მნიშვნელოვნად არ ათბობს. ულტრაბგერითი გამომუშავებული აკუსტიკური კავიტაცია და ათვლის ძალები პერფორირებს ან არღვევს ბაქტერიული უჯრედების უჯრედულ მემბრანას, როგორიცაა E.coli. Hielscher ულტრაბგერითი საშუალებას იძლევა ზუსტი კონტროლი პროცესის პარამეტრებზე, როგორიცაა ულტრაბგერითი ინტენსივობა, ამპლიტუდა, ენერგიის შეყვანა და ტემპერატურა. ამრიგად, ულტრაბგერითი ლიზისის პროცესი შეიძლება ოპტიმალურად მორგებული იყოს უჯრედის ტიპზე, უჯრედის კულტურასა და პროცესის მიზანზე.
     

    ულტრაბგერითი ლიზის უპირატესობები

    • ლილის ზუსტი კონტროლი (ინტენსივობა, ამპლიტუდა, ტემპერატურა)
    • საიმედო, განმეორებადი შედეგები
    • ოპტიმალური ადაპტაცია კონკრეტული ნიმუშების მიმართ
    • ტემპერატურის კონტროლი
    • ძალიან მცირე ძალიან დიდი ნიმუშები (μL ლიტრი)
    • წმინდა მექანიკური მკურნალობა
    • მოსახერხებელი, უსაფრთხო ოპერაცია
    • ლაბორატორიიდან წარმოების ხაზოვანი მასშტაბი
    ულტრაბგერითი მოწყობილობა VialTweeter საშუალებას აძლევს ერთდროულად მომზადდეს 10 ფლაკონის მომზადება ამავე პროცესის პირობებში. (დააჭირეთ გასადიდებლად!)

    VialTweeter ულტრაბგერითი ლიზისთვის

    ინფორმაციის მოთხოვნა




    გაითვალისწინეთ ჩვენი კონფიდენციალურობის პოლიტიკა.


    ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი სხვა ლიზისის ტექნიკის წინააღმდეგ

    მიუხედავად იმისა, რომ ქიმიური და ფერმენტული ლიზისი შეიძლება იყოს პრობლემური – რადგან ქიმიური ლიზისის შეცვლა შეუძლია ცილის სტრუქტურებში და გააცნოს გამწმენდი პრობლემები და ენზიმისტური ლიზირება მოითხოვს ხანგრძლივი ინკუბაციის დროს და არ არის რეპროდუქციული – ულტრაბგერითი დარღვევა არის დახვეწილი, სწრაფი საკანში დარღვევის მეთოდი.
    ულტრაბგერითი ლიზისი ეფუძნება მხოლოდ მექანიკურ ძალებს. ქიმიკატები არ არის დამატებული, სონიკა არღვევს უჯრედის კედელს ათვლის ძალებით. ქიმიურ ლიზისს შეუძლია შეცვალოს ცილის სტრუქტურა და გამოიწვიოს გაწმენდის პრობლემები. ფერმენტული დარღვევა მოითხოვს ინკუბაციის ხანგრძლივ პერიოდს და არ არის გამეორებადი. E.coli ბაქტერიის უჯრედების ულტრაბგერითი რღვევა არის სწრაფი, მარტივი, საიმედო და რეპროდუცირებადი. სწორედ ამიტომ Hielscher ულტრაბგერითი გამოიყენება ბიოლოგიურ და ბიოქიმიურ ლაბორატორიებში მთელს მსოფლიოში ნიმუშების მომზადებისთვის, წინასწარი ანალიტიკისთვის, ინ ვიტრო დიაგონსტიკისა და მრავალმხრივი ანალიზისთვის.

    ზოგადი რეკომენდაციები ულტრაბგერითი ლიზისისთვის

    Sonication არის ყველაზე პოპულარული ტექნიკა, რომელიც იძლევა ძალიან მცირე, საშუალო და დიდი რაოდენობით უჯრედების შეჩერებას – პიკო-ლიტრიდან 100 ლ / სთ-მდე (ულტრაბგერითი ნაკადის უჯრედის გამოყენებით). უჯრედები lysed მიერ თხევადი shear და cavitation. დნმ ასევე გამოიმუშავებს sonication, ამიტომ არ არის აუცილებელი დაამატოთ DNase საკანში შეჩერების.
     

    ტემპერატურის კონტროლი ულტრაბგერითი E.coli ლიზისის დროს
    ულტრაბგერითი უჯრედის დამრღვევი UP100H (100W) უჯრედის დაშლისა და მცენარეული ნაერთების მოპოვებისთვის.ნიმუშის წინასწარი გაგრილებით და ნიმუშის ნიმუშის ყინვის დროს ნიმუშის შენახვა, ნიმუშის თერმული დეგრადაციის ნიმუში ადვილად შეიძლება.
    იდეალურ შემთხვევაში, ნიმუშები უნდა ინახებოდეს ყინულის სახით ლიზისის დროს, მაგრამ ნიმუშების უმეტესობისთვის ეს საკმარისია, თუ ტემპერატურა არ აჭარბებს კულტურის ან ქსოვილის წყაროს ტემპერატურას. ამიტომ რეკომენდირებულია სუსპენზიის ყინულზე შენახვა და რამდენიმე მოკლე ულტრაბგერითი იმპულსებით 5-10 წამის და 10-30 წამის პაუზებით გაჟონვა. პაუზების დროს, სითბო შეიძლება გაიფანტოს დაბალი ტემპერატურის აღდგენის მიზნით. უფრო დიდი უჯრედის ნიმუშებისთვის ხელმისაწვდომია სხვადასხვა ნაკადის უჯრედის რეაქტორები გაგრილების ჟაკეტებით.
    წაიკითხეთ აქ დეტალური რჩევები და რეკომენდაციები წარმატებული ულტრაბგერითი ლიზისისთვის!

    პროტოკოლები ულტრაბგერითი მომზადებისთვის E. Coli ლიზატებისთვის

    მკვლევარები იყენებენ Hielscher-ის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები E.coli უჯრედების დარღვევისთვის. ქვემოთ შეგიძლიათ იხილოთ E.coli ლიზის სხვადასხვა შემოწმებული და დადასტურებული პროტოკოლები Hielscher ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების გამოყენებით E. coli-სთან დაკავშირებული სხვადასხვა აპლიკაციებისთვის.
     

    ამ ვიდეო კლიპში ნაჩვენებია Hielscher ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი UP100H, ულტრაბგერითი აპარატი, რომელიც ფართოდ გამოიყენება ლაბორატორიებში ნიმუშის მოსამზადებლად.

    ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი UP100H

    ვიდეოს მინიატურა

    უჯრედების ზრდა, ჯვარედინი კავშირი და E. coli უჯრედების ექსტრაქტების მომზადება ულტრაბგერითი გამოყენებით

    იყიდება SeqA და RNA პოლიმერაზა ChIP-Chip E. coli MG1655 ან MG1655 ΔseqA გაიზარდა 37 ° C მდე OD600 დაახლოებით 50 მლ LB (+ 0.2% გლუკოზა), დაახლოებით 27 მლ ფორმალდეჰიდის (37%) თითო მლ / მლ-ზე დამატებამდე (საბოლოო კონცენტრაცია 1%). Crosslinking შეასრულა ნელა აფეთქება (100 rpm) ოთახის ტემპერატურაზე 20 წუთი, შემდეგ 10 მლ 2.5 მგ გლიცინის (საბოლოო კონცენტრაცია 0.5 მ) ჩაქუჩით. სითბოს-შოკის ექსპერიმენტებისათვის, E. coli MG1655 65 მლ ლმ-ში საშუალო 30 ° C- მდე გაიზარდა600 დაახლოებით 0.3. შემდგომში 30 მლ კულტურა გადაიტანეს წინასწარ გახურებულ კოლბაში 43°C-ზე და დარჩენილი ნაწილი ინახება 30°C-ზე. ჯვარედინი კავშირი და ჩაქრობა იყო როგორც ზემოთ აღწერილი, გარდა იმისა, რომ უჯრედები ინახებოდა 30 ან 43°C ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში შემდგომი ნელი შერყევის შემდეგ ოთახის ტემპერატურაზე. უჯრედები შეგროვდა ცენტრიფუგირებით და ორჯერ გარეცხეს ცივი TBS-ით (pH7.5). 1 მლ ლიზის ბუფერში ხელახალი სუსპენზიის შემდეგ (10 მმ ტრისი (pH 8.0), 20% საქაროზა, 50 მმ NaCl, 10 მმ EDTA, 10 მგ/მლ ლიზოზიმი) და ინკუბაციის შემდეგ 37°C-ზე 30 წუთის განმავლობაში, რასაც მოჰყვება 4 მლ IP-ის დამატება. ბუფერული, უჯრედების სონიკირება მოხდა ყინულზე 12-ჯერ 30 წმ და 30 წამის შესვენებით Hielscher ულტრაბგერითი პროცესორის UP400St გამოყენებით 100% სიმძლავრის პარამეტრზე. ცენტრიფუგაციის შემდეგ 10 წუთის განმავლობაში 9000 გ-ზე, 800 μl სუპერნატანტის ალიქვოტები ინახება -20°C-ზე. (Waldminghaus 2010)
     

    ფერმენტების ჭარბი წარმოება და გაწმენდა ულტრაბგერითი ზონდით

    Ultrasonicator UP100H არის ლაბორატორიული ჰომოგენიზატორი, რომელიც ხშირად გამოიყენება უჯრედის კულტურის ფირფიტების ნიმუშის მოსამზადებლად.დეკაჰისტიდინის (His10) მონიშნული ცილების ჭარბი წარმოებისთვის, E. coli BL21(DE3) გარდაიქმნა pET19b კონსტრუქციებით. ერთი ღამის პრეკულტურა შეგროვდა ცენტრიფუგირებით და 1% გამოიყენებოდა ექსპრესიული კულტურის დასანერგად. უჯრედები, რომლებიც ატარებენ pET19mgtB, გაიზარდა 22°C-ზე ოპტიკურ სიმკვრივემდე 600 ნმ (OD600) 0,7-მდე. კულტურა გადაიტანეს 17°C-მდე და ინდუცირებული იყო 100 μM IPTG-ით. 16 საათის შემდეგ, კულტურა აღებული იქნა ცენტრიფუგირებით 7500 × გ 4°C-ზე. უჯრედები ხელახლა შეჩერდა 50 მმ ფოსფატით ბუფერულ ფიზიოლოგიურ ხსნარში (PBS) 0.3 M NaCl-ით pH 7.4-ზე და დაირღვა ულტრაბგერითი S2 მიკრო-წვერის სონოტროდთან ერთად Hielscher ულტრაბგერითი UP200St ციკლით 0.5 და 75% ამპლიტუდა.
    დეჰჰისიდინდინი-გიგანტური GtfC- ის ზედმეტი გამონაკლისი იყო 37 ° C- ზე OD- ზე600 0.6-დან 100 μM IPTG- ით. უჯრედები შემდგომში დაიბომბა 4 საათის განმავლობაში, მოსავალს და იწოვდნენ როგორც ზემოთ აღინიშნა MgtB- სთვის.
    ნედლი უჯრედის ექსტრაქტები ცენტრიფუგირებულ იქნა 15000 × გ-ზე და 4°C-ზე უჯრედის ნამსხვრევების დასალექად. გასუფთავებული ექსტრაქტები ჩაიტვირთა 1 მლ HisTrap FF Crude სვეტებზე ÄKTAprime Plus სისტემის გამოყენებით. ფერმენტები გაიწმინდა მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით His-tagged ცილების გრადიენტული გამორეცხვისთვის. გამორეცხილი პროტეინის ხსნარები ორჯერ იყო დიალიზებული 50 მმ PBS-ის 1000 მოცულობის წინააღმდეგ, pH 7.4, 0.3 მ NaCl-ით 4°C-ზე. გაწმენდა გაანალიზდა 12% SDS-PAGE-ით. ცილის კონცენტრაცია განისაზღვრა ბრედფორდის მეთოდით Roti-Quant-ის გამოყენებით. (Rabausch et al. 2013)
     

    პროტეინის ულტრაბგერითი ექსტრაქცია E. coli ბაქტერიებიდან
    დაინტერესების საშიში ცილა (ამ შემთხვევაში, არაბვიპოსის თალიანის MTV1) GST- ის ტოლერანტთან არის დაკავშირებული და გამოხატულია BL21 Escherichia coli (E. coli) საკნებში.

    1. აიღეთ GST-MTV1 და GST თითო მარცვლები (შეესაბამება 50 მლ ბაქტერიულ კულტურას) და ხელახლა შეაჩერეთ თითოეული 2,5 მლ ყინულის ცივი ექსტრაქციის ბუფერში.
    2. გამოიყენეთ ულტრაბგერითი UP100H (აღჭურვილი MS3 microtip-sonotrode-ით მცირე მოცულობებისთვის, დაახლოებით 2-5 მლ) ბაქტერიების უჯრედების დაშლამდე, სანამ ისინი არ გაიზრდება, რაც მითითებულია შემცირებული გამჭვირვალობით და გაზრდილი სიბლანტით. ეს უნდა განხორციელდეს ყინულზე და რეკომენდირებულია სონიკირება ინტერვალებით (მაგ. 10 წამი სონიკირება, რასაც მოჰყვება 10 წამიანი პაუზა ყინულზე და ასე შემდეგ). სიფრთხილეა საჭირო, რომ არ მოხდეს ზედმეტად მაღალი ინტენსივობით სონიკა. თუ გამოვლინდა ქაფი ან თეთრი ნალექის წარმოქმნა, ინტენსივობა უნდა შემცირდეს.
    3. ლიზირებული ბაქტერიების ხსნარი გადაიტანეთ 1,5 მლ მიკროცენტრიფუგის მილებში და ცენტრიფუგა 4°C-ზე, 16000 xg 20 წუთის განმავლობაში.

     

    ულტრაბგერითი ზონდები იყენებენ აკუსტიკური კავიტაციის ძალებს უჯრედის დასაშლელად და E.coli-დან მოლეკულების და დნმ-ის ამოსაღებად.

    ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატები, როგორიცაა UP400St გამოიყენეთ აკუსტიკური კავიტაციის მუშაობის პრინციპი E.coli-ის ეფექტური ლიზისისთვის.

    რეკომბინანტული პროტეინის ექსპრესიის ანალიზი და გაწმენდა სონიკაციის გამოყენებით

    E. coli-ის მარცვლები სონიკირებული იყო Hielscher ულტრაბგერითი UP100H-ით. ამ მიზნით, უჯრედის მარცვლები ხელახლა შეჩერდა გაცივებულ ლიზის ბუფერში (50 მმ Tris-HCl pH=7.5, 100 მმ NaCl, 5 მმ DTT, 1 მმ PMSF) და გაცივდა ყინულზე 10 წუთის განმავლობაში. შემდეგ, უჯრედის სუსპენზია გაჟღენთილი იყო 10 მოკლე აფეთქებით 10 წამის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა 30 წამის ინტერვალი გაგრილებისთვის. საბოლოოდ, უჯრედის ნამსხვრევები ამოღებულ იქნა ულტრაცენტრფუგირებით 4°C-ზე 15 წუთის განმავლობაში 14000 rpm-ზე. rPR ექსპრესიის დასადასტურებლად, სუპერნატანტი გაჟღენთილია 12% პოლიაკრილამიდის გელზე და გაანალიზებულია SDS-PAGE და Western blotting-ით. rPR-ის გაწმენდა განხორციელდა Ni2+-NTA ფისის გამოყენებით (Invitrogen, აშშ) მწარმოებლის სახელმძღვანელოს მიხედვით. ამ ეტაპზე გამოყენებული იქნა ადგილობრივი გამწმენდი მეთოდი. გასუფთავებული ცილის სისუფთავე შეფასდა ელექტროფორეზის გამოყენებით 12% პოლიაკრილამიდის გელზე და შემდგომი Coomassie ლურჯი შეღებვის გამოყენებით. გაწმენდილი ცილის კონცენტრაცია გაზომილი იყო Micro BCA პროტეინის ანალიზის ნაკრებით (PIERCE, აშშ). (აზარნეჟადი და სხვ. 2016 წ.)
     

    ამ ვიდეოში ნაჩვენებია 200 ვატიანი ულტრაბგერითი თასმა ლაბორატორიული ნიმუშების დასაშლელად, ჰომოგენიზაციისთვის, ამოღების ან გაზისგან.

    ულტრაბგერითი კუბური (200 ვატი)

    ვიდეოს მინიატურა

    ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები E. coli Lysis-ისთვის

    Hielscher Ultrasonics შეიმუშავებს, აწარმოებს და აწვდის მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების საიმედო და ეფექტური ლიზისისთვის E. coli ბაქტერიების და სხვა უჯრედების ტიპები, ქსოვილები და უჯრედული კულტურები.
    ულტრაბგერითი ზონდების ფართო პორტფოლიო, ისევე როგორც არაპირდაპირი ბგერითი სისტემები გვაძლევს საშუალებას შემოგთავაზოთ იდეალური ულტრაბგერითი ქსოვილის ჰომოგენიზატორი თქვენი უჯრედების დაშლისა და ექსტრაქციის გამოყენებისთვის.

    დიზაინი, წარმოება და კონსულტაცია – ხარისხი დამზადებულია გერმანიაში

    Hielscher-ის ულტრაბგერითი მოწყობილობების მართვა შესაძლებელია დისტანციურად ბრაუზერის მართვის საშუალებით. Sonication პარამეტრების მონიტორინგი და მორგება ზუსტად პროცესის მოთხოვნებს.Hielscher ულტრაბგერითები ცნობილია მათი უმაღლესი ხარისხისა და დიზაინის სტანდარტებით. ჭკვიანი პროგრამული უზრუნველყოფა, ინტუიციური მენიუ, პროგრამირებადი პარამეტრები და მონაცემთა ავტომატური პროტოკოლირება Hielscher ულტრაბგერითების მხოლოდ რამდენიმე მახასიათებელია. გამძლეობა და მარტივი ოპერაცია საშუალებას იძლევა ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების გლუვი ინტეგრაცია კვლევით და ბიოტექნოლოგიურ ობიექტებში. უხეში პირობები და მომთხოვნი გარემოც კი ადვილად უმკლავდება Hielscher ულტრაბგერითი აპარატებს.

    Hielscher Ultrasonics არის ISO სერთიფიცირებული კომპანია და განსაკუთრებული აქცენტი კეთდება მაღალი ხარისხის ულტრაბგერაზე, რომელიც აღჭურვილია უახლესი ტექნოლოგიით და მომხმარებლის კეთილგანწყობით. რა თქმა უნდა, Hielscher ულტრაბგერითები შეესაბამება CE და აკმაყოფილებს UL, CSA და RoHs მოთხოვნებს.

    ქვემოთ მოყვანილი ცხრილი გაძლევთ ჩვენს ულტრასონისტების სავარაუდო დამუშავების შესაძლებლობებს:

    Batch მოცულობადინების სიჩქარერეკომენდირებული მოწყობილობები
    მრავალ ჭაბურღილის / მიკროტიტრული ფირფიტებიnaUIP400MTP
    ჭიქა ფლაკონისთვის ან ჭიქისთვისnaულტრაბგერითი cuphorn
    ულტრაბგერითი მიკრო ნაკადის რეაქტორიnaGDmini2
    10 ფლაკონი 0.5-დან 1.5მლ-მდეnaVialTweeter
    05 დან 1.5 მლnaVialTweeter
    1-დან 500 მლ-მდე10 დან 200 მლ / წთUP100H
    10 დან 2000 მლ20 დან 400 მლ / წთUf200 ः t, UP400St
    01-დან 20 ლ-მდე02-დან 4 ლ / წთUIP2000hdT
    10-დან 100 ლ2-დან 10 ლ / წთUIP4000
    na10-დან 100 ლ / წთUIP16000
    naუფრო დიდიკასეტური UIP16000

    დაგვიკავშირდით! / გვკითხე ჩვენ!

    სთხოვეთ დამატებითი ინფორმაციის მისაღებად

    გთხოვთ, გამოიყენოთ ქვემოთ მოცემული ფორმა, რათა მოითხოვოთ დამატებითი ინფორმაცია ულტრაბგერითი ქსოვილის ჰომოგენიზატორებისა და უჯრედის გამანადგურებლების, ლიზისის აპლიკაციებისა და ფასების შესახებ. მოხარული ვიქნებით განვიხილოთ თქვენთან თქვენი პროცესი და შემოგთავაზოთ ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი, რომელიც აკმაყოფილებს თქვენს მოთხოვნებს!









    გთხოვთ გაითვალისწინოთ ჩვენი კონფიდენციალურობის პოლიტიკა.


    ვიდეო გვიჩვენებს ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადების სისტემა UIP400MTP, რომელიც საშუალებას იძლევა საიმედო ნიმუშის მომზადება ნებისმიერი სტანდარტული მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტაზე მაღალი ინტენსივობის ულტრაბგერის გამოყენებით. UIP400MTP-ის ტიპიური აპლიკაციები მოიცავს უჯრედების ლიზას, დნმ-ს, რნმ-ს და ქრომატინის ცვლას, ასევე ცილების ექსტრაქციას.

    ულტრაბგერითი UIP400MTP მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის გამაჯანსაღებისთვის

    ვიდეოს მინიატურა

    დამატებითი პროტოკოლები ულტრაბგერითი E. coli ლიზისისთვის

    ალიცინით მოდიფიცირებული პროტეინები E. coli-ში ულტრაბგერითი VialTweeter-ის გამოყენებით

    VialTweeter ულტრაბგერითი პროცესორით UP200STსულფჰიდრილის შემცველობის განსაზღვრა 5,5-დიტირობით (2-ნიტრობენზოური მჟავა) (DTNB)
    E. coli MG1655 ერთი ღამის კულტურა გამოყენებული იყო MOPS მინიმალური საშუალების (1:100) ინოკულაციისთვის. კულტურა იზრდებოდა აერობულად, სანამ არ მიიღწევა A600 0.4. კულტურა დაყოფილი იყო სამ 15-მლ კულტურად სტრესის სამკურნალოდ. არანამკურნალევი კულტურა ემსახურებოდა უარყოფით კონტროლს. 0,79 მმ ალიცინი (128 მკგ მლ-1) ან 1 მმ დიამიდი დაემატა დარჩენილ ორ კულტურას თითოეულს. კულტურები ინკუბირებული იყო 15 წუთის განმავლობაში. თითოეული კულტურის 5 მლ აღებული იქნა ცენტრიფუგაციით (8,525 × გ, 4°C, 10 წთ). უჯრედები ორჯერ გაირეცხა 1 მლ PBS-ით (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, ინახებოდა ანაერობულად გამოყენებამდე) და ცენტრიფუგა (13,000 × გ, 4°C, 10 წთ). უჯრედები ხელახლა სუსპენდირებული იყო ლიზის ბუფერში (PBS 6 მმ გუანიდინის HCl, pH 7.4) ულტრაბგერითი დაშლის დაწყებამდე 4°C-ზე.VialTweeter ულტრაბგერითი აპარატი, Hielscher GmbH, გერმანია) (3 × 1 წთ). უჯრედის ნამსხვრევები დაგროვდა ცენტრიფუგაციით (13000 × გ, 4 °C, 15 წთ). სუპერნატანტი გადატანილი იქნა 3.5 მლ QS-მაკრო კუვეტაში (10 მმ) მაგნიტური მორევის ზოლით და შერეული 1 მლ ლიზის ბუფერთან. ნიმუშების გაქრობის მონიტორინგი ხდებოდა 412 ნმ-ზე Jasco V-650 სპექტროფოტომეტრით, რომელიც აღჭურვილი იყო PSC-718 ტემპერატურის კონტროლირებადი უჯრედის დამჭერით ოთახის ტემპერატურაზე. დაემატა 100 მკლ 3 მმ დითიობის (2-ნიტრობენზოის მჟავა) ხსნარი. გადაშენებას აკონტროლებდნენ, სანამ არ მიაღწევდა გაჯერებას. თიოლის კონცენტრაციის გამოთვლა განხორციელდა გადაშენების კოეფიციენტის ϵ გამოყენებით412 = 13,700 მ-1 სმ-1 thio-2-nitrobenzoic მჟავა (TNB). უჯრედული თიოლური კონცენტრაციები გამოითვალა ე.კოლის უჯრედების მოცულობით 6.7 × 10-15 ლიტრი და უჯრედის სიმკვრივე A600 = 0,5 (ექვივალენტური 1 × 108 უჯრედების მლ-1 კულტურა). (მიულერის და 2016 წ.)
     

    In Vivo გლუტათიონის განსაზღვრა ულტრაბგერითი უჯრედის გამანადგურებელი გამოყენებით

    E.coli MG1655 გაიზარდა MOPS მინიმალურ გარემოში, საერთო მოცულობით 200 მლ, სანამ არ მიიღწევა A600 0.5. კულტურა დაყოფილი იყო 50 მლ კულტურებად სტრესის სამკურნალოდ. 15 წუთის ინკუბაციიდან 0,79 მმ ალიცინით, 1 მმ დიამიდით ან დიმეთილ სულფოქსიდით (საკონტროლო), უჯრედები აღებული იქნა 4000 გ-ზე 4°C-ზე 10 წუთის განმავლობაში. უჯრედები ორჯერ გაირეცხა KPE ბუფერით მარცვლების ხელახლა შეჩერებამდე 700 μl KPE ბუფერში. დეპროტეინაციისთვის, 300ლ 10% (w/v) სულფოსალიცილის მჟავა დაემატა ულტრაბგერითი უჯრედების დაშლამდე (3 x 1 წთ; VialTweeter ულტრაბგერითი). Supernatants შეგროვდა შემდეგ ცენტრიფუგირება (30 წუთი, 13,000 გ, 4 ° C). Sulfosalicylic მჟავა კონცენტრაციები შემცირდა 1% KPE ბუფერის 3 ტომის დამატებით. ზემოთ აღწერილი იქნა შესრულებული მთლიანი გლუტავტონისა და GSSG- ის გაზომვები. უჯრედული გლუტავითონური კონცენტრაციები გამოითვალა ე.კოლის უჯრედების მოცულობის მიხედვით 6.7×10-15 ლიტრი და უჯრედის სიმკვრივე A600 0,5 (ექვივალენტური 1×108 უჯრედების მლ-1 კულტურა). GSH- ის კონცენტრაციები გამოითვალა გლუტავტონის საერთო ჯამში 2 [GSSG] გამოყოფით. (მიულერის და 2016 წ.)

    ადამიანის mAspAT-ის გამოხატვა E. coli-ში ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორის გამოყენებით

    ულტრაბგერითი უჯრედის დეზინფორმატორი UP400St (400W) უჯრედშიდა ნივთიერების მოპოვებისთვის (მაგ. ცილების, ორგანოს, დნმ, რნმენ და ა.შ.)E. coli BL21- ის (DE3) ერთ კოლონიაში, გამოხატვის ვექტორი, Luria-Bertani (LB) საშუალო 100 მგ / მლ ამპიცილინის შემცველი 30 მლ-იანი ამპლიცილინის შემცველი და შემდეგ გაშენებულია 37ºC- მდე ოპტიკური სიმკვრივის600) მიაღწია 0.6. უჯრედები მოსავლიანობით 4000 × გ 10 წთ-ით გაიზარდა და 3L ახალი LB საშუალო შემცველობით 100 მგ / მლ ამპიცილინზე აღინიშნა.
    შემდგომში, ცილის ექსპრესია ინდუცირებული იყო 1 მმ იზოპროპილ β-ᴅ-1-თიოგალაქტოპირანოზიდით (IPTG) 20 საათის განმავლობაში 16ºC-ზე. უჯრედები აღებული იქნა ცენტრიფუგირებით 8000 × გ 15 წუთის განმავლობაში და გარეცხილი იყო ბუფერი A-ით (20 მმ NaH2PO4, 0.5 მ NaCl, pH 7.4). მიახლოებითი 45 გ (სველი წონა) უჯრედები მიიღეს 3 ლ კულტივიდან. ცენტრიფუგაციის შემდეგ, უჯრედის მარცვლები ხელახლა შეჩერდა 40 მლ-ში (1 ლ კულტურისთვის) ყინულის ექსტრაქციის ბუფერ A-ში და დალიეს ულტრაბგერითი ყინულის ცივ ტემპერატურაზე Hielscher-ის ულტრაბგერითი უჯრედების გამანადგურებელი UP400St. უჯრედის ლიზისი იყო ცენტრიფუგირებული 12000 rpm-ზე 15 წუთის განმავლობაში ხსნადი (ზენატანი) და ნალექი (გრანულების) ფრაქციების გამოსაყოფად. (Jiang et al. 2015)
     



    ფაქტები Worth Knowing

    E.coli

    Escherichia coli (E. coli) არის გრამ-ნეგატიური, ფაკულტეულურად ანაერობული, როდ ფორმირებული, კოლორიფული ბაქტერია ეშერიჩია, რომელიც ხშირად გვხვდება თბილ-სისხლძარღვთა ორგანიზმის ქვედა ნაწლავში (ენდოთერაპია). არსებობს დიდი რაოდენობით E. coli შტამები (ან subtypes) მრავალფეროვანი მახასიათებლები. უმეტესი E. coli შტამები უვნებელია ადამიანისთვის, მაგ. B და K-12 შტამები, რომლებიც გამოიყენება ლაბორატორიებში კვლევითი განაცხადებისთვის. თუმცა, ზოგიერთი შტამების მავნე და შეიძლება გამოიწვიოს სერიოზული ავადმყოფობის.
    E. coli მნიშვნელოვან როლს ასრულებს თანამედროვე ბიოლოგიურ საინჟინრო და სამრეწველო მიკრობიოლოგიაში, რადგან ბაქტერიები ადვილად მანიპულირებადია. საერთო ლაბორატორიული აპლიკაციები, რომლებიც ხშირად იწვევენ E. coli- ის გამოყენებას, მაგალითად, რეკომბინანტი დეოქსირიბორნუკლის მჟავას (დნმ) შექმნას ან მოდელის ორგანიზმში.
    E. coli არის ძალიან მრავალმხრივი მასპინძელი წარმოების ჰეტეროლოგიური ცილებისა და მრავალფეროვანი ცილის გამოხატვის სისტემები ხელმისაწვდომია რეკომბინენტური პროტეინის წარმოებაში E. coli. პლაზმატების გამოყენება, რომელიც იძლევა პროტეინის მაღალი დონის გამოხატვას, გენების მიღება შესაძლებელია ბაქტერიაში, რაც საშუალებას აძლევს ასეთი ცილების წარმოება მაღალ რაოდენობით სამრეწველო დუღილის პროცესებში.
    E.coli გამოიყენება როგორც უჯრედული ქარხნები ინსულინის წარმოებისთვის. შემდგომი აპლიკაციები მოიცავს E. coli-ს მოდიფიცირებული უჯრედების გამოყენებას ვაქცინების და იმობილიზებული ფერმენტების შესაქმნელად და წარმოებისთვის, ბიოსაწვავის წარმოებისთვის, აგრეთვე ბიორემედიაციისთვის.
    შტამპი K-12 არის E. კოლის მუტანული ფორმა, რომელიც გამოხატავს ფერმენტ ალკალინ ფოსფატასს (ALP). ეს მუტაცია ხდება გენის დეფექტის გამო, რომელიც მუდმივად ემსახურება ფერმენტს. თუ გენი აწარმოებს პროდუქტს რაიმე დათრგუნვის გარეშე, ეს არის ცნობილი როგორც აქტიური საქმიანობა. ეს კონკრეტული მუტანტის ფორმა გამოიყენება ALP ფერმენტის იზოლაციისა და გაწმენდისათვის.
    E. coli ბაქტერია ასევე ფართოდ გამოიყენება როგორც უჯრედული ქარხნები. ინჟინერიული მიკრობები (მაგ., ბაქტერიები) და მცენარეული უჯრედები შეიძლება გამოყენებულ იქნას, როგორც ე.წ. უჯრედების ქარხნები. ეს გენმოდიფიცირებული უჯრედები აწარმოებენ მოლეკულებს, ქიმიკატებს, პოლიმერებს, ცილებს და სხვა ნივთიერებებს, რომლებიც გამოიყენება მაგალითად ფარმაცევტულ, საკვებ და ქიმიურ მრეწველობაში. ასეთი ბიოინჟინერიული უჯრედების ინტერიერში წარმოქმნილი მოლეკულების გასათავისუფლებლად, ულტრაბგერითი ლიზისი ჩვეულებრივი მეთოდია უჯრედის კედლების დასაშლელად და სამიზნე ნივთიერებების მიმდებარე სითხეში გადასატანად. წაიკითხეთ მეტი ბიოინჟინერიული უჯრედების ლიზისის შესახებ!

    ულტრაბგერითი დნმ Shearing

    ულტრაბგერითი ათვლის ძალები საყოველთაოდ გამოყენებული მეთოდია უჯრედის შიდა ნაწილიდან მოლეკულების, ორგანელების და ცილების გასათავისუფლებლად, ასევე დნმ-ის ძაფების ნაწილებად დასაშლელად. აკუსტიკური კავიტაცია არღვევს უჯრედის კედლებს და მემბრანებს, რათა ამოიღოს დნმ უჯრედებიდან და წარმოქმნას დაახლოებით 600 ფრაგმენტი. – 800 bp სიგრძის, რომელიც იდეალურია ანალიზისთვის.
    დააწკაპუნეთ აქ, რომ გაიგოთ უფრო მეტი ულტრაბგერითი ჰომოგენეზერები დნმ-ის ფრაგმენტაციისთვის!

    ლიტერატურა / ცნობები


    მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი! Hielscher პროდუქციის ასორტიმენტი მოიცავს სრულ სპექტრს კომპაქტური ლაბორატორიული ულტრაბგერითი აპარატიდან დაწყებული სკამების ზედა ერთეულებამდე სრულ ინდუსტრიულ ულტრაბგერით სისტემებამდე.

    Hielscher Ultrasonics აწარმოებს მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორებისგან ლაბორატორია to სამრეწველო ზომა.


    მოხარული ვიქნებით განვიხილოთ თქვენი პროცესი.

    მოდით დავუკავშირდეთ.