E. coli-ს ულტრაბგერითი ლიზისი

E. coli ბაქტერიები ყველაზე ხშირად გამოიყენება მიკრობიოლოგიასა და ბიოტექნოლოგიაში.
ულტრაბგერითი უჯრედების დამშლელი მოწყობილობები უზრუნველყოფენ საიმედო და გამეორებად შედეგებს E. coli-ს ლიზისთვის.
ინტენსიური, მაგრამ ზუსტად კონტროლირებადი კავიტაციისა და ძვრის ძალები უზრუნველყოფენ სრულ დანგრევას და მაღალ ექსტრაქციის გამოსავლიანობას (მაგ. ცილები, დნმ).

რატომ არის E. coli-ს უჯრედების ულტრაბგერითი დანგრევა პრეფერენტული მეთოდი?

ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები ან პრობის ტიპის ულტრაბგერითი მოწყობილობები რამდენიმე უპირატესობას გთავაზობთ E. coli-ს ლიზისთვის, რადგან ინტენსიური ულტრაბგერა ეფექტურად შლის უჯრედის კედლებსა და მემბრანებს. პრობის ტიპის ულტრაბგერითი მოწყობილობები ფართოდ გამოიყენება E. coli-ს ლიზისთვის შემდეგი მიზეზების გამო:

უჯრედის კედლების ეფექტური დანგრევა: E. coli-ს აქვს ნახევრად მკვრივი უჯრედის კედელი, რომელიც შედგება პეპტიდოგლიკანისგან და რომლის დანგრევა ტრადიციული ლიზის მეთოდებით რთული შეიძლება იყოს. პრობის ტიპის ულტრაბგერითი მოწყობილობა ქმნის ინტენსიურ ულტრაბგერით ტალღებს, რომლებიც უჯრედების გარშემო მყოფ სითხეში ქმნიან კავიტაციის ბუშტუკებს. როდესაც ეს ბუშტუკები იშლება, ისინი ქმნიან მაღალსიჩქარიან სითხის ჯეტებსა და დარტყმით ტალღებს, რაც იწვევს უჯრედის კედლების მექანიკურ დანგრევას და ეფექტურად ათავისუფლებს უჯრედის შიგთავსს, როგორიცაა ბიომოლეკულები.

გაუმჯობესებული შეღწევადობა: პრობის / სონოტროდის მიერ გენერირებული ულტრაბგერითი ტალღები შეუძლიათ ღრმად შეღწეონ ნიმუშში, მიაღწიონ E. coli-ს უფრო მეტ უჯრედს და თანაბრად დამუშავონ ისინი. ეს ხელს უწყობს ლიზის უფრო თანაბარ მიმდინარეობას მთელ ნიმუშში, რაც იწვევს უჯრედების დანგრევის უფრო მაღალ ეფექტურობას.

დამუშავების დროის შემცირება: პრობის ტიპის ულტრაბგერითი მოწყობილობის მიერ მიწოდებული ენერგია ძალიან კონცენტრირებული და ლოკალიზებულია, რაც იწვევს უჯრედების სწრაფ და ეფექტურ ლიზს. სხვა მეთოდებთან შედარებით, როგორიცაა მძივებით დარტყმა ან ფერმენტული ლიზი, ულტრაბგერითი დამუშავებით E. coli-ს ლიზის მიღწევა შესაძლებელია წუთებში ან თუნდაც წამებში. მაშინ როცა ბევრი ალტერნატიული ტექნიკა, როგორიცაა გაყინვა-გალღობა, მოითხოვს დამუშავების რამდენიმე ციკლს, ულტრაბგერითი ლიზი ხსნის უჯრედებს პროცესის ერთ ეტაპზე.

ტემპერატურის კონტროლი: თანამედროვე ულტრაბგერითი მოწყობილობები აღჭურვილია ტემპერატურის სენსორებითა და სმარტ პროგრამული უზრუნველყოფით, რაც საშუალებას იძლევა დაინიშნოს მაქსიმალური პროცესის ტემპერატურა. ულტრაბგერითი მოწყობილობა ავტომატურად ჩერდება, როდესაც ტემპერატურის ზღვარი მიიღწევა და იწყებს ულტრაბგერით დამუშავების პროცესს, როდესაც დასმული ტემპერატურის წერტილი მიიღწევა. ნიმუშების გაციება ყინულის აბაზანაში არის მარტივი მეთოდი ნიმუშის ტემპერატურის დაბალ დონეზე შესანარჩუნებლად და სითბოთი გამოწვეული ნიმუშის დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად.

მასშტაბირებადი: პრობის ტიპის ულტრაბგერითი მოწყობილობები ხელმისაწვდომია სხვადასხვა ზომის, ხელის ტიპის მოწყობილობებიდან დიდი მასშტაბის სამრეწველო მოდელებამდე. ეს მათ შესაფერისს ხდის მცირე მოცულობების დამუშავებისთვის ლაბორატორიაში ან მასშტაბირებისთვის უფრო დიდი ბიოპროცესინგის გამოყენებისთვის, მაგ. ვაქცინების წარმოება ან მოლეკულების ბიოსინთეზი.

მრავალფეროვნება: ულტრაბგერითი მოწყობილობები შეიძლება გამოიყენებოდეს უჯრედების ლიზის გარდა სხვადასხვა დანიშნულებისთვის, როგორიცაა დნმ-ის დაჭრა, ცილების ექსტრაქცია, ქსოვილების ჰომოგენიზაცია, ნანონაწილაკების დისპერსია და ემულსიფიკაცია. შესაბამისად, პრობის ტიპის ულტრაბგერით მოწყობილობაში ინვესტიცია უზრუნველყოფს მრავალფეროვნებას სამეცნიერო ან სამრეწველო პირობებში.

პრობის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატები, როგორიცაა UP200St, არის საიმედო ქსოვილის ჰომოგენიზატორები და უჯრედების დამსხვრევები, ამიტომ ფართოდ გამოიყენება ნიმუშების მომზადებისთვის გენეტიკაში, მაგ., E. coli-ის ლიზისისთვის

ცილების ექსტრაქცია E.coli უჯრედებიდან ეფექტურად ხორციელდება ულტრაბგერითი პრობით UP200St

პრობის ტიპის ულტრაბგერითი მოწყობილობა გთავაზობთ მრავალ უპირატესობას E. coli-ს ლიზისთვის. ულტრაბგერითი პროცესის პარამეტრების საიმედო და ზუსტი კონტროლი საშუალებას იძლევა ოპტიმიზირდეს ოპერაციული პარამეტრები, როგორიცაა სიმძლავრე, ხანგრძლივობა და ნიმუშების მართვა, სასურველი შედეგების მისაღწევად.
 

ეს სახელმძღვანელო განმარტავს, რომელი ტიპის სონიკატორია საუკეთესო ნიმუშების მომზადების ისეთი ამოცანებისთვის, როგორიცაა ლიზისი, უჯრედების დაშლა, ცილების გამოყოფა, დნმ-ისა და რნმ-ის ფრაგმენტაცია ლაბორატორიებში, ანალიზსა და კვლევებში. შეარჩიეთ სონიკატორის იდეალური ტიპი თქვენი გამოყენების სფეროს, ნიმუშის მოცულობის, ნიმუშების რაოდენობისა და წარმადობის შესაბამისად. Hielscher Ultrasonics-ს თქვენთვის იდეალური ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი აქვს!

ულტრაბგერითი DNA-ს ფრაგმენტაცია ხშირად გამოიყენება როგორც ნიმუშის მომზადების ეტაპი მეორე თაობის სეკვენირებაში (NGS)

E. coli EDL933-ის გენომური დნმ-ის ელექტროფორეზული ანალიზი, რომელიც დაექვემდებარა 0 – 15 წუთის ულტრაბგერით დამუშავებას. L აღნიშნავს დნმ-ის ლადერს (მოლეკულური მასის მარკერს).
(კვლევა და სურათი: ©Basselet et al. 2008)

უჯრედების დანგრევა ულტრაბგერითი კავიტაციის გამოყენებით

ულტრაბგერითი პრობული ჰომოგენიზატორები მუშაობენ დაახლოებით 20 000 ციკლით წამში (20kHz-ზე) და იწვევენ კავიტაციას სითხეებში ან სუსპენზიებში. აკუსტიკური კავიტაცია ქმნის მიკროსკოპულ ზონებს ვაკუუმის მსგავსი წნევით და მაღალი ტემპერატურით, რომლებიც უჯრედებს შლიან. მიუხედავად იმისა, რომ ტემპერატურა შეიძლება რამდენიმე ათას ცელსიუსამდე მიაღწიოს, კავიტაციის მოცულობები იმდენად მცირეა, რომ პროცესს მნიშვნელოვნად არ აცხელებენ. ულტრაბგერითი გენერირებული აკუსტიკური კავიტაცია და ძვრის ძალები ხვრეტენ ან შლიან ბაქტერიული უჯრედების, როგორიცაა E.coli, უჯრედის მემბრანას. Hielscher-ის ულტრაბგერითი დამამუშავებლები საშუალებას იძლევა ზუსტი კონტროლი განხორციელდეს პროცესის პარამეტრებზე, როგორიცაა ულტრაბგერითი ინტენსივობა, ამპლიტუდა, ენერგიის შეყვანა და ტემპერატურა. ამრიგად, ულტრაბგერითი ლიზის პროცესი ოპტიმალურად შეიძლება მორგდეს უჯრედის ტიპს, უჯრედულ კულტურას და პროცესის მიზანს.
 

ულტრაბგერითი ლიზის უპირატესობები

ლიზის ზუსტი კონტროლი (ინტენსივობა, ამპლიტუდა, ტემპერატურა)
საიმედო, გამეორებადი შედეგები
ოპტიმალური ადაპტაცია კონკრეტული ნიმუშებისთვის
ტემპერატურული კონტროლი
ძალიან მცირედან ძალიან დიდ ნიმუშებამდე (µL-დან ლიტრამდე)
მხოლოდ მექანიკური დამუშავება
მომხმარებლისთვის მოსახერხებელი, უსაფრთხო ექსპლუატაცია
წრფივი მასშტაბირება ლაბორატორიიდან წარმოებამდე

ულტრაბგერითი მოწყობილობა VialTweeter საშუალებას აძლევს ერთდროულად მოამზადოს ნიმუშები მაქსიმუმ 10 ვიალიში იგივე პროცესის პირობებში. (დააწკაპუნეთ გასაზრდელად!)

VialTweeter ულტრაბგერითი ლიზისთვის

ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი სხვა ლიზის ტექნიკებთან შედარებით

მიუხედავად იმისა, რომ ქიმიური და ფერმენტული ლიზა შეიძლება პრობლემური იყოს – რადგან ქიმიური ლიზა შეიძლება შეცვალოს ცილის სტრუქტურები და გამოიწვიოს გასუფთავების პრობლემები, ხოლო ფერმენტული ლიზა საჭიროებს ინკუბაციის ხანგრძლივ დროს და არ არის გამეორებადი – ულტრაბგერითი დამუშავება არის დახვეწილი, სწრაფი უჯრედების დაშლის მეთოდი.
ულტრაბგერითი ლიზა ეფუძნება მხოლოდ მექანიკურ ძალებს. ქიმიური ნივთიერებები არ ემატება, ულტრაბგერითი დამუშავება შლის უჯრედის კედელს ძვრის ძალებით. ქიმიური ლიზა შეიძლება შეცვალოს ცილის სტრუქტურა და გამოიწვიოს გასუფთავების პრობლემები. ფერმენტული დამუშავება საჭიროებს ინკუბაციის ხანგრძლივ დროს და არ არის გამეორებადი. E.coli ბაქტერიული უჯრედების ულტრაბგერითი დაშლა არის სწრაფი, მარტივი, საიმედო და გამეორებადი. სწორედ ამიტომ გამოიყენება Hielscher-ის ულტრაბგერითი დამამუშავებლები ბიოლოგიურ და ბიოქიმიურ ლაბორატორიებში მთელ მსოფლიოში ნიმუშების მოსამზადებლად, წინა-ანალიტიკისთვის, in-vitro დიაგნოსტიკისთვის და მრავალფეროვანი ანალიზებისთვის.

ზოგადი რეკომენდაციები ულტრაბგერითი ლიზისთვის

ულტრაბგერითი დამუშავება არის ყველაზე პოპულარული ტექნიკა უჯრედული სუსპენზიების ძალიან მცირე, საშუალო და დიდი რაოდენობების ლიზისთვის – პიკოლიტრიდან 100L/სთ-მდე (ულტრაბგერითი ნაკადის კამერის გამოყენებით). უჯრედები იშლება სითხის ძვრისა და კავიტაციის გზით. DNA ასევე იშლება ულტრაბგერითი დამუშავების დროს, ამიტომ არ არის საჭირო DNase-ის დამატება უჯრედულ სუსპენზიაში.
 

ტემპერატურული კონტროლი ულტრაბგერითი E.coli ლიზის დროს
ნიმუშის წინასწარი გაცივებით და ულტრაბგერითი დამუშავების დროს ნიმუშის ყინულზე შენახვით, ნიმუშის თერმული დეგრადაციის თავიდან აცილება მარტივია.
იდეალურ შემთხვევაში, ნიმუშები ლიზის დროს ყინულის ცივი უნდა იყოს, მაგრამ უმეტესი ნიმუშებისთვის საკმარისია, თუ ტემპერატურა არ აღემატება კულტურის ან ქსოვილის წყაროს ტემპერატურას. ამიტომ რეკომენდებულია სუსპენზიის ყინულზე შენახვა და ულტრაბგერითი დამუშავება რამდენიმე მოკლე ულტრაბგერითი იმპულსით 5–10 წმ-ის განმავლობაში და 10–30 წმ-ის პაუზებით. პაუზების დროს სითბო შეიძლება გაიფანტოს დაბალი ტემპერატურის აღდგენის მიზნით. უფრო დიდი უჯრედული ნიმუშებისთვის ხელმისაწვდომია სხვადასხვა ნაკადის კამერის რეაქტორები გაგრილების ქურთუკებით.
წაიკითხეთ აქ დეტალური რჩევები და რეკომენდაციები წარმატებული ულტრაბგერითი ლიზისთვის!

პროტოკოლები E. Coli ლიზატების ულტრაბგერითი მომზადებისთვის

მკვლევრები იყენებენ Hielscher-ის ულტრაბგერით ჰომოგენიზატორებს E.coli უჯრედების დაშლისთვის. ქვემოთ შეგიძლიათ იპოვოთ სხვადასხვა ტესტირებული და დამტკიცებული პროტოკოლი E.coli ლიზისთვის Hielscher-ის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების გამოყენებით სხვადასხვა E. coli-თან დაკავშირებული გამოყენებისთვის.
 

უჯრედული ზრდა, გაჯვარედინება და E. coli უჯრედული ექსტრაქტების მომზადება ულტრაბგერის გამოყენებით

SeqA-სა და RNA პოლიმერაზის ChIP-Chip-ისთვის E. coli MG1655 ან MG1655 ΔseqA იზრდებოდა 37°C-ზე OD₆₀₀ დაახლოებით 0,15-ის 50 ml LB-ში (+ 0,2% გლუკოზა) სანამ არ დაემატა 27 μl ფორმალდეჰიდი (37%) თითო ml საკვებ არეში (საბოლოო კონცენტრაცია 1%). ჯვარედინი შეკვრა განხორციელდა ნელი რხევით (100 rpm) ოთახის ტემპერატურაზე 20 წთ-ის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა შეჩერება 10 ml 2,5 M გლიცინით (საბოლოო კონცენტრაცია 0,5 M). თბური შოკის ექსპერიმენტებისთვის, E. coli MG1655 იზრდებოდა 65 ml LB საკვებ არეში 30°C-ზე OD₆₀₀ დაახლოებით 0,3-მდე. შემდეგ 30 ml კულტურა გადაიტანეს 43°C-მდე წინასწარ გათბობილ კოლბაში, ხოლო დარჩენილი ნაწილი დატოვეს 30°C-ზე. ჯვარედინი შეკავშირება და რეაქციის შეჩერება განხორციელდა ზემოთ აღწერილი მეთოდით, იმ განსხვავებით, რომ ოთახის ტემპერატურაზე შემდგომ ნელ რხევამდე უჯრედებს 5 წთ-ის განმავლობაში აჩერებდნენ 30 ან 43°C-ზე. უჯრედები შეაგროვეს ცენტრიფუგირებით და ორჯერ გარეცხეს ცივი TBS-ით (pH7.5). 1 ml ლიზის ბუფერში (10 mM Tris (pH 8,0), 20% სუკროზა, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml ლიზოციმი) რესუსპენდირებისა და 37°C-ზე 30 წთ ინკუბაციის შემდეგ დაამატეს 4 ml IP ბუფერი. შემდეგ უჯრედები ყინულზე დაამუშავეს ულტრაბგერით 12-ჯერ, თითოეული დამუშავების ხანგრძლივობა იყო 30 წმ, ხოლო შესვენება – 30 წმ. გამოიყენეს Hielscher-ის ულტრაბგერითი პროცესორი UP400St 100% სიმძლავრის პარამეტრით. 9000 g-ზე 10 წთ ცენტრიფუგირების შემდეგ სუპერნატანტის 800 μl ალიკვოტები შეინახეს -20°C-ზე. (Waldminghaus 2010)

ფერმენტების ზედმეტი წარმოქმნა და გასუფთავება ულტრაბგერითი პრობის გამოყენებით

დეკაჰისტიდინის (His10)-დატაგული ცილების ზედმეტი წარმოქმნისთვის, E. coli BL21(DE3) ტრანსფორმირდა pET19b კონსტრუქციებით. ღამის წინასწარი კულტურა შეგროვდა ცენტრიფუგირებით, და 1% გამოიყენებოდა ექსპრესიული კულტურის ინოკულაციისთვის. pET19mgtB-ს მატარებელი უჯრედები იზრდებოდნენ 22°C-ზე სანამ ოპტიკური სიმკვრივე 600 nm-ზე (OD600) არ მიაღწევდა 0,7-ს. კულტურა გადაიტანეს 17°C-ზე და ინდუცირდა 100 μM IPTG-ით. 16 h-ის შემდეგ, კულტურა შეგროვდა ცენტრიფუგირებით 7 500 × g-ზე 4°C-ზე. უჯრედები რესუსპენდირდნენ 50 mM ფოსფატით დაბუფერებულ მარილხსნარში (PBS) 0,3 M NaCl-ით pH 7,4-ზე და დაინგრეს ულტრაბგერითი დამუშავებით S2 მიკრო-წვერის სონოტროდით Hielscher ულტრაბგერით აპარატზე UP200St ციკლით 0,5 და ამპლიტუდით 75%.
დეკაჰისტიდინით მონიშნული GtfC-ს ჭარბი წარმოქმნა ინდუცირდა 37°C-ზე OD₆₀₀ 0,6-ზე 100 μM IPTG-ით. უჯრედები შემდეგ ინკუბირდნენ 4 h-ის განმავლობაში, შეგროვდნენ და დალიზდნენ ზემოთ აღწერილი მეთოდით MgtB-სთვის.
გაუსუფთავებელი უჯრედული ექსტრაქტები ცენტრიფუგირდებოდა 15 000 × g-ზე და 4°C-ზე უჯრედული ნაშთების დასალექად. გამჭვირვალე ექსტრაქტები დაიტვირთა 1-ml HisTrap FF Crude სვეტებზე ÄKTAprime Plus სისტემის გამოყენებით. ფერმენტები გასუფთავდა მწარმოებლის პროტოკოლის შესაბამისად, His-ით მონიშნული ცილების გრადიენტული ელუციით. ელუირებული ცილის ხსნარები ორჯერ დაექვემდებარა დიალიზს 1 000 მოცულობის 50 mM PBS-ის მიმართ, pH 7,4-ზე, 0,3 M NaCl-ით, 4°C-ზე. გასუფთავება გაანალიზდა 12% SDS-PAGE-ით. ცილის კონცენტრაცია განისაზღვრა ბრედფორდის მეთოდით Roti-Quant-ის გამოყენებით. (Rabausch et al. 2013)

ცილის ულტრაბგერითი ექსტრაქცია E. coli ბაქტერიებიდან
საკვლევი სატყუარა ცილა (ამ შემთხვევაში, Arabidopsis thaliana-ს MTV1) შერწყმულია GST ნიშნულთან და ექსპრესირდება BL21 Escherichia coli (E. coli) უჯრედებში.

აიღეთ GST-MTV1-ისა და GST-ის თითო ნალექი (თითოეული შეესაბამება 50 ml ბაქტერიულ კულტურას) და თითოეული რესუსპენდირეთ 2,5 mL ყინულივით ცივ ექსტრაქციულ ბუფერში.
გამოიყენეთ ულტრაბგერითი აპარატი UP100H (აღჭურვილი MS3 მიკროწვერიანი სონოტროდით დაახლოებით 2-5mL მცირე მოცულობებისთვის) ბაქტერიული უჯრედების დასაშლელად, სანამ არ მოხდება მათი ლიზისი, რაზეც მიუთითებს შემღვრეულობის შემცირება და სიბლანტის მატება. ეს უნდა განხორციელდეს ყინულზე და რეკომენდებულია ულტრაბგერითი დამუშავება ინტერვალებით (მაგ. 10 sec ულტრაბგერითი დამუშავება, რასაც მოჰყვება 10 sec შესვენება ყინულზე და ა.შ.). საჭიროა სიფრთხილე, რათა ულტრაბგერითი დამუშავების ინტენსივობა ზედმეტად მაღალი არ იყოს. თუ აღინიშნება ქაფი ან თეთრი ნალექის წარმოქმნა, ინტენსივობა უნდა შემცირდეს.
გადაიტანეთ დალიზებული ბაქტერიული ხსნარი 1,5 mL მიკროცენტრიფუგის სინჯარებში და ცენტრიფუგირეთ 4°C-ზე, 16 000 x g-ზე 20 min-ის განმავლობაში.

ულტრაბგერითი პრობები იყენებენ აკუსტიკური კავიტაციის ძალებს უჯრედების დასანგრევად და მოლეკულებისა და DNA-ს ამოსაღებად E. coli-დან.

პრობის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატები, როგორიცაა UP400St იყენებენ აკუსტიკური კავიტაციის სამუშაო პრინციპს E.coli-ს ეფექტური ლიზისთვის.

რეკომბინანტული ცილის ექსპრესიის ანალიზი და გასუფთავება ულტრაბგერითი დამუშავების გამოყენებით

E. coli-ის ნალექი დამუშავდა Hielscher-ის ულტრაბგერითი აპარატით UP100H. ამ მიზნით უჯრედული ნალექი რესუსპენდირდა გაციებულ ლიზის ბუფერში (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) და გაცივდა ყინულზე 10 წთ-ის განმავლობაში. შემდეგ უჯრედული სუსპენზია დამუშავდა ულტრაბგერით 10 მოკლე იმპულსით, თითო 10 წმ-ის ხანგრძლივობით, გაგრილებისთვის 30 წმ-იანი ინტერვალებით. ბოლოს უჯრედული ნაშთები მოცილდა ულტრაცენტრიფუგირებით 4°C-ზე 15 წთ-ის განმავლობაში 14 000 ბრ/წთ სიჩქარით. rPR-ის ექსპრესიის დასადასტურებლად სუპერნატანტი გაატარეს 12% პოლიაკრილამიდის გელზე და გაანალიზეს SDS-PAGE-ითა და ვესტერნ ბლოტინგით. rPR-ის გასუფთავება განხორციელდა Ni2+-NTA ფისის გამოყენებით (Invitrogen, USA), მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად. ამ ეტაპზე გამოყენებულ იქნა ნატიური გასუფთავების მეთოდი. გასუფთავებული ცილის სიწმინდე შეფასდა ელექტროფორეზით 12% პოლიაკრილამიდის გელზე და შემდგომი კუმასის ლურჯით შეღებვით. გასუფთავებული ცილის კონცენტრაცია გაიზომა Micro BCA ცილის ანალიზის ნაკრებით (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
 

ამ ვიდეოში ნაჩვენებია 200 ვატის სიმძლავრის ულტრაბგერითი ჭიქისებრი სონოტროდი ლაბორატორიული ნიმუშების დისპერგირების, ჰომოგენიზაციის, ექსტრაქციისა თუ დეგაზაციისთვის.

ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები E. coli-ის ლიზისთვის

Hielscher Ultrasonics აპროექტებს, აწარმოებს და აწვდის მაღალი წარმადობის ულტრაბგერით ჰომოგენიზატორებს E. coli ბაქტერიებისა და სხვა უჯრედული ტიპების, ქსოვილებისა და უჯრედული კულტურების საიმედო და ეფექტური ლიზისთვის.
ულტრაბგერითი პრობებისა და ირიბი ულტრაბგერითი დამუშავების სისტემების ფართო ასორტიმენტი საშუალებას გვაძლევს, შემოგთავაზოთ იდეალური ულტრაბგერითი ქსოვილური ჰომოგენიზატორი თქვენი უჯრედული დისრუფციისა და ექსტრაქციის ამოცანისთვის.

პროექტირება, წარმოება და კონსალტინგი – ხარისხი დამზადებულია გერმანიაში

Hielscher ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები ცნობილია თავისი უმაღლესი ხარისხისა და დიზაინის სტანდარტებით. მძლავრი პროგრამული უზრუნველყოფა, ინტუიციური მენიუ, პროგრამირებადი პარამეტრები და ავტომატური მონაცემთა პროტოკოლირება მხოლოდ რამდენიმეა Hielscher ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების ფუნქციებს შორის. მდგრადობა და მარტივი ექსპლუატაცია საშუალებას გვაძლევს, ჩვენი ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები მარტივად ჩავრთოთ სამეცნიერო და ბიოტექნოლოგიურ დაწესებულებებში. მკაცრი პირობები და მოთხოვნადი გარემოც კი მარტივად მართვადია Hielscher ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების მიერ.

Hielscher Ultrasonics არის ISO სერტიფიცირებული კომპანია და განსაკუთრებულ მნიშვნელობას ანიჭებს მაღალი წარმადობის ულტრაბგერით ჰომოგენიზატორებს, რომლებიც აღჭურვილია თანამედროვე ტექნოლოგიებით და მომხმარებლისთვის მოსახერხებელია. რა თქმა უნდა, Hielscher ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები შეესაბამება CE სტანდარტებს და აკმაყოფილებენ UL, CSA და RoHs მოთხოვნებს.

ქვემოთ მოცემული ცხრილი გაჩვენებთ ჩვენი ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების დაახლოებითი დამუშავების სიმძლავრის მაჩვენებლებს:

პარტიის მოცულობა	მოცულობითი ხარჯი	რეკომენდებული მოწყობილობები
მრავალჭიანი / მიკროტიტრული ფირფიტები	n.a.	UIP400MTP
CupHorn ვიალებისთვის ან ლაბორატორიული ჭიქისთვის	n.a.	ულტრაბგერითი CupHorn
ულტრაბგერითი მიკრო-ნაკადის რეაქტორი	n.a.	GDmini2
10 ვიალამდე 0,5-დან 1,5mL-მდე	n.a.	VialTweeter
0,5-დან 1,5mL-მდე	n.a.	VialTweeter
1-დან 500mL-მდე	10-დან 200mL/წთ-მდე	UP100H
10-დან 2000mL-მდე	20-დან 400mL/წთ-მდე	UP200Ht, UP400St
0,1-დან 20L-მდე	0,2-დან 4L/წთ-მდე	UIP2000hdT
10-დან 100L-მდე	2-დან 10L/წთ-მდე	UIP4000
n.a.	10-დან 100L/წთ-მდე	UIP16000
n.a.	უფრო დიდი	კლასტერი UIP16000

დაგვიკავშირდით! / დაგვისვით შეკითხვა!

მოითხოვეთ დამატებითი ინფორმაცია

გთხოვთ, გამოიყენოთ ქვემოთ მოცემული ფორმა ქსოვილების ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორებისა და უჯრედების დამშლელი მოწყობილობების, ლიზისის გამოყენების სფეროებისა და ფასების შესახებ დამატებითი ინფორმაციის მოსათხოვად. სიამოვნებით განვიხილავთ თქვენთან თქვენს პროცესს და შემოგთავაზებთ ულტრაბგერით ჰომოგენიზატორს, რომელიც თქვენს მოთხოვნებს აკმაყოფილებს!

ელფოსტის მისამართი (სავალდებულო)

ტელეფონის ნომერი

სახელი

ინტერესის სფერო

ვიდეოში ნაჩვენებია ნიმუშების ულტრაბგერითი მომზადების სისტემა UIP400MTP, რომელიც მაღალი ინტენსივობის ულტრაბგერით ნებისმიერი სტანდარტული მრავალფოსოიანი ფირფიტის ნიმუშების საიმედოდ მომზადების საშუალებას იძლევა. UIP400MTP-ის ტიპური გამოყენებებია უჯრედების ლიზისი, დნმ-ის, რნმ-ისა და ქრომატინის ფრაგმენტაცია, ასევე ცილების ექსტრაქცია.

დამატებითი პროტოკოლები ულტრაბგერითი E. coli ლიზისთვის

ალიცინით მოდიფიცირებული ცილები E. coli-ში ულტრაბგერითი VialTweeter-ის გამოყენებით

სულფჰიდრილის შემცველობის დადგენა 5,5′-დითიობის(2-ნიტრობენზოის მჟავა) (DTNB) ანალიზით
E. coli MG1655-ის ღამის კულტურა გამოიყენეს MOPS მინიმალური საკვები გარემოს ინოკულირებისთვის (1:100). კულტურა იზრდებოდა აერობულად, სანამ A600 არ მიაღწია 0,4-ს. კულტურა დაიყო სამ 15-ml კულტურად სტრესული დამუშავებისთვის. დაუმუშავებელი კულტურა გამოიყენებოდა უარყოფით კონტროლად. დარჩენილი ორი კულტურიდან ერთს დაემატა 0,79 mM ალიცინი (128 μg ml-1), მეორეს კი – 1 mM დიამიდი. კულტურები ინკუბირდებოდა 15 min-ის განმავლობაში. თითოეული კულტურის 5 ml შეაგროვეს ცენტრიფუგირებით (8 525 × g, 4°C, 10 min). უჯრედები ორჯერ გარეცხეს 1 ml PBS-ით (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, გამოყენებამდე ინახებოდა ანაერობულ პირობებში) და ცენტრიფუგირებდნენ (13 000 × g, 4°C, 10 min). უჯრედები რესუსპენდირდა ლიზის ბუფერში (PBS 6 mM გუანიდინიუმის HCl-ით, pH 7,4), რის შემდეგაც ისინი დაიშალა 4°C-ზე ულტრაბგერითი დამუშავებით (VialTweeter ულტრაბგერითი დამუშავება (VialTweeter, Hielscher GmbH, Germany) (3 × 1 min). უჯრედული ნაშთები ცენტრიფუგირებით გამოიყო (13 000 × g, 4 °C, 15 min). ზედა ფენა გადაიტანეს 3,5-ml QS-მაკრო კიუვეტში (10 mm) მაგნიტური მრეცხავით და აურიეს 1 ml ლიზის ბუფერთან. ნიმუშების ექსტინქცია მონიტორინგდებოდა 412 nm-ზე Jasco V-650 სპექტროფოტომეტრით, რომელიც აღჭურვილია PSC-718 ტემპერატურის კონტროლირებადი კამერით, ოთახის ტემპერატურაზე. დაემატა 100μl 3 mM დითიობის(2-ნიტრობენზოის მჟავა) ხსნარი. ექსტინქცია მონიტორინგდებოდა სანამ ის არ მიაღწია გაჯერებას. თიოლის კონცენტრაციის გამოთვლა განხორციელდა ექსტინქციის კოეფიციენტის ϵ₄₁₂ = 13 700 M^-1 cm^-1 თიო-2-ნიტრობენზოის მჟავასთვის (TNB). უჯრედული თიოლის კონცენტრაციები გამოითვლებოდა E. coli უჯრედების 6,7 × 10^-15 ლიტრის მოცულობისა და A600 = 0,5 უჯრედული სიმკვრივის საფუძველზე (შესაბამისობაში 1 × 10⁸ უჯრედი მლ^-1 კულტურა). (Müller et al. 2016)

In Vivo გლუტათიონის განსაზღვრა ულტრაბგერითი უჯრედების დამშლელი აპარატის გამოყენებით

E.coli MG1655 იზრდებოდა MOPS მინიმალურ საკვებ არეში 200ml საერთო მოცულობით, სანამ A600 არ მიაღწია 0,5-ს. კულტურა დაიყო 50-ml კულტურებად სტრესული დამუშავებისთვის. 0,79 mM ალიცინთან, 1 mM დიამიდთან ან დიმეთილ სულფოქსიდთან (კონტროლი) 15 min ინკუბაციის შემდეგ უჯრედები შეაგროვეს ცენტრიფუგირებით 4,000g-ზე, 4°C-ზე, 10 min-ის განმავლობაში. უჯრედები ორჯერ გარეცხეს KPE ბუფერით, შემდეგ კი ნალექი ხელახლა შეასუსპენზირეს 700µl KPE ბუფერში. ცილების მოსაცილებლად დაამატეს 300l 10% (w/v) სულფოსალიცილის მჟავა უჯრედების ულტრაბგერით დაშლამდე (3 x 1 min; VialTweeter ულტრაბგერითი აპარატი). სუპერნატანტები შეაგროვეს ცენტრიფუგირების შემდეგ (30 წთ, 13 000g, 4°C). სულფოსალიცილის მჟავას კონცენტრაციები შემცირდა 1%-მდე 3 მოცულობის KPE ბუფერის დამატებით. ჯამური გლუტათიონისა და GSSG-ის გაზომვები განხორციელდა ზემოთ აღწერილი მეთოდით. უჯრედული გლუტათიონის კონცენტრაციები გამოითვლებოდა E. coli უჯრედების 6,7×10^-15 ლიტრის მოცულობისა და A600 0,5 უჯრედული სიმკვრივის საფუძველზე (რაც შეესაბამება 1×10⁸ უჯრედი მლ^-1 კულტურა). GSH კონცენტრაციები გამოითვლებოდა ჯამური გლუტათიონიდან 2[GSSG] გამოკლებით. (Müller et al. 2016)

ადამიანის mAspAT-ის ექსპრესია E. coli-ში ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორის გამოყენებით

E. coli BL21 (DE3)-ის ერთი კოლონია, რომელიც შეიცავდა ექსპრესიის ვექტორს, იზრდებოდა 30 mL Luria-Bertani (LB) საკვებ არეში, რომელიც შეიცავდა 100μg/mL ამპიცილინს, და შემდეგ კულტივირდებოდა 37ºC-ზე, სანამ ოპტიკური სიმკვრივე (OD₆₀₀) არ მიაღწია 0,6-ს. უჯრედები შეაგროვეს ცენტრიფუგირებით 4,000 × g-ზე 10 min-ის განმავლობაში და ხელახლა შეასუსპენზირეს 3L ახალ LB საკვებ არეში, რომელიც შეიცავდა 100μg/mL ამპიცილინს.
შემდეგ, ცილის ექსპრესია ინდუცირდებოდა 1 mM იზოპროპილ β-ᴅ-1-თიოგალაქტოპირანოზიდით (IPTG) 20 h-ის განმავლობაში 16ºC-ზე. უჯრედები მოიპოვებოდა ცენტრიფუგირებით 8 000 × g-ზე 15 min-ის განმავლობაში და გარეცხებოდა A ბუფერით (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). დაახლოებით 45g (მუცლის წონა) უჯრედები მიღებულ იქნა 3 L კულტურიდან. ცენტრიფუგირების შემდეგ, უჯრედული ნალექი გადაიტანებოდა 40 mL (1 L კულტურისთვის) ყინულოვან ექსტრაქციის A ბუფერში და ლიზდებოდა ულტრაბგერითი დამუშავებით ყინულოვან ტემპერატურაზე Hielscher ულტრაბგერითი უჯრედების დამსხვრევი UP400St-ის გამოყენებით. უჯრედული ლიზატი ცენტრიფუგირდებოდა 12 000 rpm-ზე 15 min-ის განმავლობაში, რათა გამოყოფილიყო ხსნადი (ზედა ფენა) და ნალექი (ნალექი) ფრაქციები. (Jiang et al. 2015)

დაკავშირებული თემები

საყურადღებო ფაქტები

E.coli

Escherichia coli (E. coli) არის გრამ-უარყოფითი, ფაკულტატურად ანაერობული, ღეროსებრი, კოლიფორმული ბაქტერია Escherichia-ს გვარისა, რომელიც ხშირად გვხვდება თბილსისხლიანი ორგანიზმების (ენდოთერმების) ქვედა ნაწლავში. არსებობს E. coli-ის შტამების (ან ქვეტიპების) დიდი რაოდენობა მრავალფეროვანი მახასიათებლებით. E. coli-ის შტამების უმეტესობა ადამიანისთვის უვნებელია, მაგალითად, B და K-12 შტამები, რომლებიც ხშირად გამოიყენება ლაბორატორიულ საკვლევ პროგრამებში. თუმცა, ზოგიერთი შტამი საზიანოა და შეიძლება გამოიწვიოს მძიმე დაავადება.
E. coli მნიშვნელოვან როლს თამაშობს თანამედროვე ბიოინჟინერიასა და სამრეწველო მიკრობიოლოგიაში, რადგან ამ ბაქტერიით მანიპულირება მარტივია. ლაბორატორიებში E. coli ხშირად გამოიყენება, მაგალითად, რეკომბინანტური დეზოქსირიბონუკლეინის მჟავას (DNA) შესაქმნელად ან მოდელურ ორგანიზმად.
E. coli ჰეტეროლოგიური ცილების წარმოებისთვის მრავალმხრივ გამოსადეგი მასპინძელი ორგანიზმია და მასში რეკომბინანტური ცილების მისაღებად ცილების ექსპრესიის მრავალი სისტემა არსებობს. პლაზმიდების გამოყენებით, რომლებიც ცილის მაღალი დონის ექსპრესიას უზრუნველყოფენ, ბაქტერიებში შესაძლებელია გენების შეტანა, რაც სამრეწველო ფერმენტაციის პროცესებში ასეთი ცილების დიდი რაოდენობით წარმოების საშუალებას იძლევა.
E. coli გამოიყენება როგორც უჯრედული ფაბრიკები ინსულინის წარმოებისთვის. შემდგომი გამოყენებები მოიცავს მოდიფიცირებული E. coli-ის უჯრედების გამოყენებას ვაქცინებისა და იმობილიზებული ფერმენტების შესამუშავებლად და წარმოებისთვის, ბიოსაწვავის წარმოებისთვის, ასევე ბიორემედიაციისთვის.
K-12 შტამი არის E. coli-ის მუტანტური ფორმა, რომელიც ჭარბად წარმოქმნის ფერმენტ ტუტე ფოსფატაზას (ALP). ეს მუტაცია ხდება იმ გენის დეფექტის გამო, რომელიც მუდმივად აკოდირებს ფერმენტს. თუ გენი წარმოქმნის პროდუქტს ყოველგვარი ინჰიბირების გარეშე, ამას კონსტიტუტიური აქტივობა ეწოდება. ეს კონკრეტული მუტანტური ფორმა გამოიყენება ALP ფერმენტის იზოლაციისა და გასუფთავებისთვის.
E. coli ბაქტერიები ასევე ფართოდ გამოიყენება როგორც უჯრედული ფაბრიკები. ინჟინერული მიკრობები (მაგ., ბაქტერიები) და მცენარეული უჯრედები შეიძლება გამოიყენებოდეს ე.წ. უჯრედული ფაბრიკების როლში. ეს გენეტიკურად მოდიფიცირებული უჯრედები აწარმოებენ მოლეკულებს, ქიმიკატებს, პოლიმერებს, ცილებს და სხვა ნივთიერებებს, რომლებიც, მაგალითად, გამოიყენება ფარმაცევტულ, საკვებ და ქიმიურ მრეწველობაში. იმისათვის, რომ გამოიყოს მოლეკულები, რომლებიც წარმოიქმნება ასეთი ბიოინჟინერული უჯრედების შიგნით, ულტრაბგერითი ლიზისი არის საერთო მეთოდი უჯრედის კედლების დასანგრევად და სამიზნე ნივთიერებების გადასაყვანად გარემომცველ სითხეში. გაიგეთ მეტი ბიოინჟინერული უჯრედების ლიზისის შესახებ!

DNA-ს ულტრაბგერითი დაჭრა

ულტრაბგერითი ძვრის ძალები არის ხშირად გამოყენებული მეთოდი მოლეკულების, ორგანელების და ცილების უჯრედის შიგნიდან გამოსაყოფად, ასევე DNA-ს ჯაჭვების ნაწილებად დასაჭრელად. აკუსტიკური კავიტაცია არღვევს უჯრედის კედლებს და მემბრანებს DNA-ს უჯრედებიდან ამოსაღებად და წარმოქმნის დაახლოებით 600 – 800 bp სიგრძის ფრაგმენტებს, რაც იდეალურია ანალიზისთვის.
დააწკაპუნეთ აქ, რომ გაიგოთ მეტი ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების შესახებ DNA-ს ფრაგმენტაციისთვის!

ლიტერატურა / რეფერენსები

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

მაღალი წარმადობის ულტრაბგერა! Hielscher-ის პროდუქციის დიაპაზონი მოიცავს სრულ სპექტრს კომპაქტური ლაბორატორიული ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორიდან მაგიდის ზომის აპარატებამდე და სრულად ინდუსტრიული ულტრაბგერითი სისტემების ჩათვლით.

Hielscher Ultrasonics აწარმოებს მაღალი წარმადობის ულტრაბგერით ჰომოგენიზატორებს ლაბორატორიული დან სამრეწველო ზომამდე.