E. Coli-ს ულტრაბგერითი ლიზისი
- E. coli ბაქტერია მიკრობიოლოგიასა და ბიოტექნოლოგიაში ყველაზე ხშირად გამოყენებული ბაქტერიაა.
- ულტრაბგერითი უჯრედების დამრღვევები იძლევა საიმედო და გამეორებად შედეგებს E. coli-ს ლიზისისთვის.
- ინტენსიური, მაგრამ ზუსტად კონტროლირებადი კავიტაციის და ათვლის ძალები იწვევს სრულ რღვევას და მაღალი ექსტრაქციის მოსავალს (მაგ. ცილები, დნმ).
რატომ არის E. coli-ს ულტრაბგერითი უჯრედების მოშლა სასურველი მეთოდი?
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები ან ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატები გვთავაზობენ E. coli ლიზის რამდენიმე უპირატესობას, რადგან ინტენსიური ულტრაბგერითი ეფექტურად არღვევს უჯრედის კედლებსა და გარსებს. ზონდის ტიპის ულტრაბგერითები ფართოდ გამოიყენება E. coli ლიზისისთვის შემდეგი მიზეზების გამო:
პროტეინის ექსტრაქცია E.coli უჯრედებიდან ეფექტურად ხორციელდება ულტრაბგერითი ზონდი UP200St
ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატი ბევრ უპირატესობას გვთავაზობს E. coli ლიზისისთვის. ულტრაბგერითი პროცესის პარამეტრებზე საიმედო და ზუსტი კონტროლი საშუალებას იძლევა ოპტიმიზაცია მოახდინოს ოპერაციული პარამეტრების, როგორიცაა სიმძლავრე, ხანგრძლივობა და ნიმუშის დამუშავება სასურველი შედეგების მისაღწევად.
E. coli EDL933-ის გენომიური დნმ-ის ელექტროფორეზული ანალიზები ექვემდებარება 0 – 15 წთ ულტრაბგერითი გამოკვლევის დროს. L მიუთითებს დნმ-ის კიბეზე.
(კვლევა და სურათი: ©Basselet et al. 2008)
უჯრედის რღვევა ულტრაბგერითი კავიტაციის გამოყენებით
ულტრაბგერითი ზონდის ტიპის ჰომოგენიზატორები მუშაობენ დაახლ. 20000 ციკლი წამში (20kHz-ზე) და იწვევს კავიტაციას სითხეებში ან სუსპენზიებში. აკუსტიკური კავიტაციის მიკროსკოპული უბნები ვაკუუმის მსგავსი წნევით და მაღალი ტემპერატურით, რომელიც ანადგურებს უჯრედებს. მიუხედავად იმისა, რომ ტემპერატურამ შეიძლება მიაღწიოს რამდენიმე ათას გრადუს ცელსიუსს, კავიტაციის მოცულობა იმდენად მცირეა, რომ პროცესი მნიშვნელოვნად არ ათბობს. ულტრაბგერითი წარმოქმნილი აკუსტიკური კავიტაცია და ათვლის ძალები პერფორირებს ან არღვევს ბაქტერიული უჯრედების უჯრედულ მემბრანას, როგორიცაა E.coli. Hielscher ულტრაბგერითი საშუალებას იძლევა ზუსტი კონტროლი პროცესის პარამეტრებზე, როგორიცაა ულტრაბგერითი ინტენსივობა, ამპლიტუდა, ენერგიის შეყვანა და ტემპერატურა. ამრიგად, ულტრაბგერითი ლიზისის პროცესი შეიძლება ოპტიმალურად მორგებული იყოს უჯრედის ტიპზე, უჯრედის კულტურასა და პროცესის მიზანზე.
- ლიზისის ზუსტი კონტროლი (ინტენსივობა, ამპლიტუდა, ტემპერატურა)
- საიმედო, განმეორებადი შედეგები
- ოპტიმალური ადაპტაცია კონკრეტულ ნიმუშებთან
- ტემპერატურის კონტროლი
- ძალიან მცირე და ძალიან დიდი ნიმუშებისთვის (μL-დან ლიტრამდე)
- წმინდა მექანიკური დამუშავება
- მოსახერხებელი, უსაფრთხო ოპერაცია
- ხაზოვანი მასშტაბის გაზრდა ლაბორატორიიდან წარმოებამდე
VialTweeter ულტრაბგერითი ლიზისისთვის
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი სხვა ლიზისის ტექნიკის წინააღმდეგ
მიუხედავად იმისა, რომ ქიმიური და ფერმენტული ლიზისი შეიძლება იყოს პრობლემური – ვინაიდან ქიმიურ ლიზას შეუძლია შეცვალოს ცილის სტრუქტურები და გამოიწვიოს გაწმენდის პრობლემები და ფერმენტული ლიზისი მოითხოვს ინკუბაციის ხანგრძლივ პერიოდს და არ არის გამეორებადი – ულტრაბგერითი მოშლა არის დახვეწილი, სწრაფი უჯრედების დაშლის მეთოდი.
ულტრაბგერითი ლიზისი ეფუძნება მხოლოდ მექანიკურ ძალებს. ქიმიკატები არ არის დამატებული, სონიკა არღვევს უჯრედის კედელს ათვლის ძალებით. ქიმიურ ლიზისს შეუძლია შეცვალოს ცილის სტრუქტურა და გამოიწვიოს გაწმენდის პრობლემები. ფერმენტული დარღვევა მოითხოვს ინკუბაციის ხანგრძლივ პერიოდს და არ არის გამეორებადი. E.coli ბაქტერიის უჯრედების ულტრაბგერითი რღვევა არის სწრაფი, მარტივი, საიმედო და რეპროდუცირებადი. სწორედ ამიტომ Hielscher ულტრაბგერითი გამოიყენება ბიოლოგიურ და ბიოქიმიურ ლაბორატორიებში მთელს მსოფლიოში ნიმუშების მომზადებისთვის, წინასწარი ანალიტიკისთვის, ინ ვიტრო დიაგონსტიკისა და მრავალმხრივი ანალიზისთვის.
ზოგადი რეკომენდაციები ულტრაბგერითი ლიზისისთვის
Sonication არის ყველაზე პოპულარული ტექნიკა ძალიან მცირე, საშუალო და დიდი რაოდენობით უჯრედული სუსპენზიების დასაწებებლად. – პიკო-ლიტრიდან 100 ლ/სთ-მდე (ულტრაბგერითი ნაკადის უჯრედის გამოყენებით). უჯრედები ლიზდება თხევადი ათვლის და კავიტაციის გზით. დნმ ასევე იჭრება სონიკაციის დროს, ამიტომ არ არის აუცილებელი დნაზას დამატება უჯრედულ სუსპენზიაში.
ტემპერატურის კონტროლი ულტრაბგერითი E.coli ლიზისის დროს
ნიმუშის წინასწარ გაგრილებით და ნიმუშის ყინულზე გაჟონვის დროს, ნიმუშის თერმული დეგრადაციის აცილება ადვილად შეიძლება.
იდეალურ შემთხვევაში, ნიმუშები უნდა ინახებოდეს ყინულის სახით ლიზისის დროს, მაგრამ ნიმუშების უმეტესობისთვის ეს საკმარისია, თუ ტემპერატურა არ აჭარბებს კულტურის ან ქსოვილის წყაროს ტემპერატურას. ამიტომ რეკომენდირებულია სუსპენზიის ყინულზე შენახვა და ულტრაბგერითი გაჟონვა რამდენიმე მოკლე ულტრაბგერითი იმპულსებით 5-10 წმ და პაუზებით 10-30 წმ. პაუზების დროს, სითბო შეიძლება გაიფანტოს დაბალი ტემპერატურის აღდგენის მიზნით. უფრო დიდი უჯრედის ნიმუშებისთვის ხელმისაწვდომია სხვადასხვა ნაკადის უჯრედის რეაქტორები გაგრილების ჟაკეტებით.
წაიკითხეთ აქ დეტალური რჩევები და რეკომენდაციები წარმატებული ულტრაბგერითი ლიზისისთვის!
პროტოკოლები ულტრაბგერითი მომზადებისთვის E. Coli ლიზატებისთვის
მკვლევარები იყენებენ Hielscher-ის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები E.coli უჯრედების დარღვევისთვის. ქვემოთ შეგიძლიათ იხილოთ E.coli ლიზის სხვადასხვა შემოწმებული და დადასტურებული პროტოკოლები Hielscher ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების გამოყენებით E. coli-სთან დაკავშირებული სხვადასხვა აპლიკაციებისთვის.
უჯრედების ზრდა, ჯვარედინი კავშირი და E. coli უჯრედების ექსტრაქტების მომზადება ულტრაბგერითი გამოყენებით
SeqA და რნმ პოლიმერაზას ჩიპ-ჩიპისთვის E. coli MG1655 ან MG1655 ΔseqA გაიზარდა 37°C-ზე OD-მდე600 დაახლოებით 0,15 50 მლ LB-ში (+ 0,2% გლუკოზა) სანამ დაემატებოდა 27 μl ფორმალდეჰიდი (37%) მლ გარემოში (საბოლოო კონცენტრაცია 1%). ჯვარედინი კავშირი განხორციელდა ნელი შერყევის დროს (100 rpm) ოთახის ტემპერატურაზე 20 წუთის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა ჩაქრობა 10 მლ 2.5 M გლიცინით (საბოლოო კონცენტრაცია 0.5 M). სითბოს დარტყმის ექსპერიმენტებისთვის E. coli MG1655 გაიზარდა 65 მლ LB გარემოში 30°C-ზე OD-მდე600 დაახლოებით 0.3. შემდგომში 30 მლ კულტურა გადაიტანეს წინასწარ გახურებულ კოლბაში 43°C-ზე და დარჩენილი ნაწილი ინახება 30°C-ზე. ჯვარედინი კავშირი და ჩაქრობა იყო როგორც ზემოთ აღწერილი, გარდა იმისა, რომ უჯრედები ინახებოდა 30 ან 43°C ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში შემდგომი ნელი შერყევის შემდეგ ოთახის ტემპერატურაზე. უჯრედები შეგროვდა ცენტრიფუგირებით და ორჯერ გარეცხეს ცივი TBS-ით (pH7.5). 1 მლ ლიზის ბუფერში ხელახალი სუსპენზიის შემდეგ (10 მმ ტრისი (pH 8.0), 20% საქაროზა, 50 მმ NaCl, 10 მმ EDTA, 10 მგ/მლ ლიზოზიმი) და ინკუბაციის შემდეგ 37°C-ზე 30 წუთის განმავლობაში, რასაც მოჰყვება 4 მლ IP-ის დამატება. ბუფერული, უჯრედების სონიკირება მოხდა ყინულზე 12-ჯერ 30 წმ და 30 წამის შესვენებით Hielscher ულტრაბგერითი პროცესორის UP400St გამოყენებით 100% სიმძლავრის პარამეტრზე. ცენტრიფუგაციის შემდეგ 10 წუთის განმავლობაში 9000 გ-ზე, 800 μl სუპერნატანტის ალიქვოტები ინახება -20°C-ზე. (Waldminghaus 2010)
ფერმენტების ჭარბი წარმოება და გაწმენდა ულტრაბგერითი ზონდით
დეკაჰისტიდინის (His10) მონიშნული ცილების ჭარბი წარმოებისთვის, E. coli BL21(DE3) გარდაიქმნა pET19b კონსტრუქციებით. ერთი ღამის პრეკულტურა შეგროვდა ცენტრიფუგირებით და 1% გამოიყენებოდა ექსპრესიული კულტურის დასანერგად. უჯრედები, რომლებიც ატარებენ pET19mgtB, გაიზარდა 22°C-ზე ოპტიკურ სიმკვრივემდე 600 ნმ (OD600) 0,7-მდე. კულტურა გადაიტანეს 17°C-მდე და ინდუცირებული იყო 100 μM IPTG-ით. 16 საათის შემდეგ, კულტურა აღებული იქნა ცენტრიფუგირებით 7500 × გ 4°C-ზე. უჯრედები ხელახლა შეჩერდა 50 მმ ფოსფატით ბუფერულ ფიზიოლოგიურ ხსნარში (PBS) 0.3 M NaCl-ით pH 7.4-ზე და დაირღვა ულტრაბგერითი S2 მიკრო-წვერის სონოტროდთან ერთად Hielscher ულტრაბგერითი UP200St ციკლით 0.5 და 75% ამპლიტუდა.
დეკაჰისტიდინით მონიშნული GtfC-ის ჭარბი წარმოება გამოწვეული იყო 37°C-ზე OD-ზე600 0.6-დან 100 μM IPTG-ით. შემდეგ უჯრედები ინკუბირებული იყო 4 საათის განმავლობაში, დაკრეფილი და ლიზირებული, როგორც ზემოთ აღინიშნა MgtB-სთვის.
ნედლი უჯრედის ექსტრაქტები ცენტრიფუგირებულ იქნა 15000 × გ-ზე და 4°C-ზე უჯრედის ნამსხვრევების დასალექად. გასუფთავებული ექსტრაქტები ჩაიტვირთა 1 მლ HisTrap FF Crude სვეტებზე ÄKTAprime Plus სისტემის გამოყენებით. ფერმენტები გაიწმინდა მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით His-tagged ცილების გრადიენტული გამორეცხვისთვის. გამორეცხილი პროტეინის ხსნარები ორჯერ იყო დიალიზებული 50 მმ PBS-ის 1000 მოცულობის წინააღმდეგ, pH 7.4, 0.3 მ NaCl-ით 4°C-ზე. გაწმენდა გაანალიზდა 12% SDS-PAGE-ით. ცილის კონცენტრაცია განისაზღვრა ბრედფორდის მეთოდით Roti-Quant-ის გამოყენებით. (Rabausch et al. 2013)
პროტეინის ულტრაბგერითი ექსტრაქცია E. coli ბაქტერიებიდან
საინტერესო სატყუარას ცილა (ამ შემთხვევაში, MTV1 Arabidopsis thaliana) შერწყმულია GST ტეგთან და გამოხატულია BL21 Escherichia coli (E. coli) უჯრედებში.
- აიღეთ GST-MTV1 და GST თითო მარცვლები (შეესაბამება 50 მლ ბაქტერიულ კულტურას) და ხელახლა შეაჩერეთ თითოეული 2,5 მლ ყინულის ცივი ექსტრაქციის ბუფერში.
- გამოიყენეთ ულტრაბგერითი UP100H (აღჭურვილი MS3 microtip-sonotrode-ით მცირე მოცულობებისთვის, დაახლოებით 2-5 მლ) ბაქტერიების უჯრედების დაშლამდე, სანამ ისინი არ გაიზრდება, რაც მითითებულია შემცირებული გამჭვირვალობით და გაზრდილი სიბლანტით. ეს უნდა განხორციელდეს ყინულზე და რეკომენდირებულია სონიკირება ინტერვალებით (მაგ. 10 წამი სონიკირება, რასაც მოჰყვება 10 წამიანი პაუზა ყინულზე და ასე შემდეგ). სიფრთხილეა საჭირო, რომ არ მოხდეს ზედმეტად მაღალი ინტენსივობით სონიკა. თუ გამოვლინდა ქაფი ან თეთრი ნალექის წარმოქმნა, ინტენსივობა უნდა შემცირდეს.
- ლიზირებული ბაქტერიების ხსნარი გადაიტანეთ 1,5 მლ მიკროცენტრიფუგის მილებში და ცენტრიფუგა 4°C-ზე, 16000 xg 20 წუთის განმავლობაში.
ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატები, როგორიცაა UP400St გამოიყენეთ აკუსტიკური კავიტაციის მუშაობის პრინციპი E.coli-ის ეფექტური ლიზისისთვის.
რეკომბინანტული პროტეინის ექსპრესიის ანალიზი და გაწმენდა სონიკაციის გამოყენებით
E. coli-ის მარცვლები სონიკირებული იყო Hielscher ულტრაბგერითი UP100H-ით. ამ მიზნით, უჯრედის მარცვლები ხელახლა შეჩერდა გაცივებულ ლიზის ბუფერში (50 მმ Tris-HCl pH=7.5, 100 მმ NaCl, 5 მმ DTT, 1 მმ PMSF) და გაცივდა ყინულზე 10 წუთის განმავლობაში. შემდეგ, უჯრედის სუსპენზია გაჟღენთილი იყო 10 მოკლე აფეთქებით 10 წამის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა 30 წამის ინტერვალი გაგრილებისთვის. საბოლოოდ, უჯრედის ნამსხვრევები ამოღებულ იქნა ულტრაცენტრფუგირებით 4°C-ზე 15 წუთის განმავლობაში 14000 rpm-ზე. rPR ექსპრესიის დასადასტურებლად, სუპერნატანტი გაჟღენთილია 12% პოლიაკრილამიდის გელზე და გაანალიზებულია SDS-PAGE და Western blotting-ით. rPR-ის გაწმენდა განხორციელდა Ni2+-NTA ფისის გამოყენებით (Invitrogen, აშშ) მწარმოებლის სახელმძღვანელოს მიხედვით. ამ ეტაპზე გამოყენებული იქნა ადგილობრივი გამწმენდი მეთოდი. გასუფთავებული ცილის სისუფთავე შეფასდა ელექტროფორეზის გამოყენებით 12% პოლიაკრილამიდის გელზე და შემდგომი Coomassie ლურჯი შეღებვის გამოყენებით. გაწმენდილი ცილის კონცენტრაცია გაზომილი იყო Micro BCA პროტეინის ანალიზის ნაკრებით (PIERCE, აშშ). (აზარნეჟადი და სხვ. 2016)
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები E. coli Lysis-ისთვის
Hielscher Ultrasonics შეიმუშავებს, აწარმოებს და აწვდის მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების საიმედო და ეფექტური ლიზისისთვის E. coli ბაქტერიების და სხვა უჯრედების ტიპები, ქსოვილები და უჯრედული კულტურები.
ულტრაბგერითი ზონდების ფართო პორტფოლიო, ისევე როგორც არაპირდაპირი ბგერითი სისტემები გვაძლევს საშუალებას შემოგთავაზოთ იდეალური ულტრაბგერითი ქსოვილის ჰომოგენიზატორი თქვენი უჯრედების დაშლისა და ექსტრაქციის გამოყენებისთვის.
დიზაინი, წარმოება და კონსულტაცია – ხარისხი დამზადებულია გერმანიაში
Hielscher ულტრაბგერითები ცნობილია მათი უმაღლესი ხარისხისა და დიზაინის სტანდარტებით. ჭკვიანი პროგრამული უზრუნველყოფა, ინტუიციური მენიუ, პროგრამირებადი პარამეტრები და მონაცემთა ავტომატური პროტოკოლირება Hielscher ულტრაბგერითების მხოლოდ რამდენიმე მახასიათებელია. გამძლეობა და მარტივი ოპერაცია საშუალებას იძლევა ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების გლუვი ინტეგრაცია კვლევით და ბიოტექნოლოგიურ ობიექტებში. უხეში პირობები და მომთხოვნი გარემოც კი ადვილად უმკლავდება Hielscher ულტრაბგერითი აპარატებს.
Hielscher Ultrasonics არის ISO სერთიფიცირებული კომპანია და განსაკუთრებული აქცენტი კეთდება მაღალი ხარისხის ულტრაბგერაზე, რომელიც აღჭურვილია უახლესი ტექნოლოგიით და მომხმარებლის კეთილგანწყობით. რა თქმა უნდა, Hielscher ულტრაბგერითები შეესაბამება CE და აკმაყოფილებს UL, CSA და RoHs მოთხოვნებს.
ქვემოთ მოყვანილი ცხრილი გვიჩვენებს ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების სავარაუდო დამუშავების შესაძლებლობებს:
| სურათების მოცულობა | Დინების სიჩქარე | რეკომენდებული მოწყობილობები |
|---|---|---|
| მრავალ ჭაბურღილის / მიკროტიტრული ფირფიტები | na | UIP400MTP |
| ჭიქა ფლაკონისთვის ან ჭიქისთვის | na | ულტრაბგერითი CupHorn |
| ულტრაბგერითი მიკრო ნაკადის რეაქტორი | na | GDmini2 |
| 10 ფლაკონი 0.5-დან 1.5მლ-მდე | na | VialTweeter |
| 0.5-დან 1.5მლ-მდე | na | VialTweeter |
| 1-დან 500 მლ-მდე | 10-დან 200 მლ/წთ-მდე | UP100H |
| 10-დან 2000 მლ-მდე | 20-დან 400 მლ/წთ-მდე | UP200Ht, UP400 ქ |
| 0.1-დან 20ლ-მდე | 0.2-დან 4ლ/წთ-მდე | UIP2000hdT |
| 10-დან 100 ლ-მდე | 2-დან 10ლ/წთ-მდე | UIP4000 |
| na | 10-დან 100ლ/წთ-მდე | UIP16000 |
| na | უფრო დიდი | კასეტური UIP16000 |
Დაგვიკავშირდით! / Გვკითხე ჩვენ!
დამატებითი პროტოკოლები ულტრაბგერითი E. coli ლიზისისთვის
ალიცინით მოდიფიცირებული პროტეინები E. coli-ში ულტრაბგერითი VialTweeter-ის გამოყენებით
სულფჰიდრილის შემცველობის განსაზღვრა 5,5'-დითიობის(2-ნიტრობენზოინის მჟავა) (DTNB) ანალიზით
E. coli MG1655 ერთი ღამის კულტურა გამოყენებული იყო MOPS მინიმალური საშუალების (1:100) ინოკულაციისთვის. კულტურა იზრდებოდა აერობულად, სანამ არ მიიღწევა A600 0.4. კულტურა დაყოფილი იყო სამ 15-მლ კულტურად სტრესის სამკურნალოდ. არანამკურნალევი კულტურა ემსახურებოდა უარყოფით კონტროლს. 0,79 მმ ალიცინი (128 მკგ მლ-1) ან 1 მმ დიამიდი დაემატა დარჩენილ ორ კულტურას თითოეულს. კულტურები ინკუბირებული იყო 15 წუთის განმავლობაში. თითოეული კულტურის 5 მლ აღებული იქნა ცენტრიფუგაციით (8,525 × გ, 4°C, 10 წთ). უჯრედები ორჯერ გაირეცხა 1 მლ PBS-ით (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, ინახებოდა ანაერობულად გამოყენებამდე) და ცენტრიფუგა (13,000 × გ, 4°C, 10 წთ). უჯრედები ხელახლა სუსპენდირებული იყო ლიზის ბუფერში (PBS 6 მმ გუანიდინის HCl, pH 7.4) ულტრაბგერითი დაშლის დაწყებამდე 4°C-ზე.VialTweeter ულტრაბგერითი აპარატი, Hielscher GmbH, გერმანია) (3 × 1 წთ). უჯრედის ნამსხვრევები დაგროვდა ცენტრიფუგაციით (13000 × გ, 4 °C, 15 წთ). სუპერნატანტი გადატანილი იქნა 3.5 მლ QS-მაკრო კუვეტაში (10 მმ) მაგნიტური მორევის ზოლით და შერეული 1 მლ ლიზის ბუფერთან. ნიმუშების გაქრობის მონიტორინგი ხდებოდა 412 ნმ-ზე Jasco V-650 სპექტროფოტომეტრით, რომელიც აღჭურვილი იყო PSC-718 ტემპერატურის კონტროლირებადი უჯრედის დამჭერით ოთახის ტემპერატურაზე. დაემატა 100 მკლ 3 მმ დითიობის (2-ნიტრობენზოის მჟავა) ხსნარი. გადაშენებას აკონტროლებდნენ, სანამ არ მიაღწევდა გაჯერებას. თიოლის კონცენტრაციის გამოთვლა განხორციელდა გადაშენების კოეფიციენტის ϵ გამოყენებით412 = 13,700 მ-1 სმ-1 თიო-2-ნიტრობენზოის მჟავისთვის (TNB). უჯრედული თიოლის კონცენტრაცია გამოთვლილი იყო E. coli უჯრედების მოცულობის საფუძველზე 6,7 × 10-15 ლიტრი და უჯრედის სიმკვრივე A600 = 0,5 (ექვივალენტური 1 × 108 უჯრედები მლ-1 კულტურა). (მიულერი და სხვ. 2016)
In Vivo გლუტათიონის განსაზღვრა ულტრაბგერითი უჯრედის გამანადგურებელი გამოყენებით
E.coli MG1655 გაიზარდა MOPS მინიმალურ გარემოში, საერთო მოცულობით 200 მლ, სანამ არ მიიღწევა A600 0.5. კულტურა დაყოფილი იყო 50 მლ კულტურებად სტრესის სამკურნალოდ. 15 წუთის ინკუბაციიდან 0,79 მმ ალიცინით, 1 მმ დიამიდით ან დიმეთილ სულფოქსიდით (საკონტროლო), უჯრედები აღებული იქნა 4000 გ-ზე 4°C-ზე 10 წუთის განმავლობაში. უჯრედები ორჯერ გაირეცხა KPE ბუფერით მარცვლების ხელახლა შეჩერებამდე 700 μl KPE ბუფერში. დეპროტეინაციისთვის, 300ლ 10% (w/v) სულფოსალიცილის მჟავა დაემატა ულტრაბგერითი უჯრედების დაშლამდე (3 x 1 წთ; VialTweeter ულტრაბგერითი). სუპერნატანტები შეგროვდა ცენტრიფუგაციის შემდეგ (30 წთ, 13000გრ, 4°C). სულფოსალიცილის მჟავას კონცენტრაცია შემცირდა 1%-მდე KPE ბუფერის 3 მოცულობის დამატებით. მთლიანი გლუტათიონისა და GSSG-ის გაზომვები ჩატარდა, როგორც ზემოთ იყო აღწერილი. უჯრედული გლუტათიონის კონცენტრაცია გამოთვლილი იყო E. coli უჯრედების მოცულობის საფუძველზე 6.7×10-15 ლიტრი და უჯრედის სიმკვრივე A600 0,5 (ექვივალენტური 1×108 უჯრედები მლ-1 კულტურა). GSH კონცენტრაციები გამოთვლილი იყო 2[GSSG]-ის გამოკლებით მთლიანი გლუტათიონიდან. (მიულერი და სხვ. 2016)
ადამიანის mAspAT-ის გამოხატვა E. coli-ში ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორის გამოყენებით
E. coli BL21 (DE3) ერთჯერადი კოლონია, რომელიც შეიცავს ექსპრესიის ვექტორს 30 მლ Luria-Bertani (LB) გარემოში, რომელიც შეიცავს 100 მკგ/მლ ამპიცილინს და შემდეგ კულტივირებულია 37ºC-ზე ოპტიკურ სიმკვრივემდე (OD).600) მიაღწია 0.6-ს. უჯრედები აღებული იქნა ცენტრიფუგირებით 4000 × გ 10 წუთის განმავლობაში და ხელახლა სუსპენდირებულ იქნა 3 ლ ახალი LB გარემოში, რომელიც შეიცავდა 100 მკგ/მლ ამპიცილინს.
შემდგომში, ცილის ექსპრესია ინდუცირებული იყო 1 მმ იზოპროპილ β-ᴅ-1-თიოგალაქტოპირანოზიდით (IPTG) 20 საათის განმავლობაში 16ºC-ზე. უჯრედები აღებული იქნა ცენტრიფუგირებით 8000 × გ 15 წუთის განმავლობაში და გარეცხილი იყო ბუფერი A-ით (20 მმ NaH2PO4, 0.5 მ NaCl, pH 7.4). მიახლოებითი 45 გ (სველი წონა) უჯრედები მიიღეს 3 ლ კულტივიდან. ცენტრიფუგაციის შემდეგ, უჯრედის მარცვლები ხელახლა შეჩერდა 40 მლ-ში (1 ლ კულტურისთვის) ყინულის ექსტრაქციის ბუფერ A-ში და დალიეს ულტრაბგერითი ყინულის ცივ ტემპერატურაზე Hielscher-ის ულტრაბგერითი უჯრედების გამანადგურებელი UP400St. უჯრედის ლიზისი იყო ცენტრიფუგირებული 12000 rpm-ზე 15 წუთის განმავლობაში ხსნადი (ზენატანი) და ნალექი (გრანულების) ფრაქციების გამოსაყოფად. (Jiang et al. 2015)
ფაქტები, რომელთა ცოდნაც ღირს
ე.კოლი
Escherichia coli (E. coli) არის გრამუარყოფითი, ფაკულტატურად ანაერობული, ღეროს ფორმის კოლიფორმული ბაქტერია Escherichia-ს გვარისა, რომელიც ჩვეულებრივ გვხვდება თბილსისხლიანი ორგანიზმების ქვედა ნაწლავში (ენდოთერმები). არსებობს დიდი რაოდენობით E. coli შტამები (ან ქვეტიპები) მრავალფეროვანი მახასიათებლებით. E. coli შტამების უმეტესობა უვნებელია ადამიანისთვის, მაგ. B და K-12 შტამები, რომლებიც ჩვეულებრივ გამოიყენება ლაბორატორიებში კვლევისთვის. თუმცა, ზოგიერთი შტამი საზიანოა და შეიძლება გამოიწვიოს სერიოზული დაავადება.
E. coli მნიშვნელოვან როლს ასრულებს თანამედროვე ბიოლოგიურ ინჟინერიასა და სამრეწველო მიკრობიოლოგიაში, ვინაიდან ბაქტერიების მანიპულირება მარტივია. საერთო ლაბორატორიული აპლიკაციები, რომლებიც ხშირად გულისხმობს E. coli-ს გამოყენებას, მაგ., რეკომბინანტული დეზოქსირიბონუკლეინის მჟავის (დნმ) შესაქმნელად ან ორგანიზმის მოდელის როლში.
E. coli არის ძალიან მრავალმხრივი მასპინძელი ჰეტეროლოგიური ცილების წარმოებისთვის, და ხელმისაწვდომია ცილის მრავალმხრივი გამოხატვის სისტემები E. coli-ში რეკომბინანტული ცილების წარმოებისთვის. პლაზმიდების გამოყენებით, რომლებიც იძლევიან ცილების მაღალი დონის გამოხატვის საშუალებას, გენები შეიძლება შევიდეს ბაქტერიებში, რაც იძლევა ასეთი ცილების დიდი რაოდენობით წარმოებას სამრეწველო დუღილის პროცესებში.
E.coli გამოიყენება როგორც უჯრედული ქარხნები ინსულინის წარმოებისთვის. შემდგომი აპლიკაციები მოიცავს E. coli-ს მოდიფიცირებული უჯრედების გამოყენებას ვაქცინების და იმობილიზებული ფერმენტების შესაქმნელად და წარმოებისთვის, ბიოსაწვავის წარმოებისთვის, აგრეთვე ბიორემედიაციისთვის.
შტამი K-12 არის E. coli-ს მუტანტური ფორმა, რომელიც ზედმეტად გამოხატავს ფერმენტ ტუტე ფოსფატაზას (ALP). ეს მუტაცია ხდება გენის დეფექტის გამო, რომელიც მუდმივად ახდენს ფერმენტის კოდირებას. თუ გენი აწარმოებს პროდუქტს ყოველგვარი ინჰიბირების გარეშე, ეს ცნობილია როგორც შემადგენელი აქტივობა. ეს სპეციფიკური მუტანტის ფორმა გამოიყენება ALP ფერმენტის იზოლირებისთვის და გასაწმენდად.
E. coli ბაქტერია ასევე ფართოდ გამოიყენება როგორც უჯრედული ქარხნები. ინჟინერიული მიკრობები (მაგ., ბაქტერიები) და მცენარეული უჯრედები შეიძლება გამოყენებულ იქნას, როგორც ე.წ. უჯრედული ქარხნები. ეს გენმოდიფიცირებული უჯრედები აწარმოებენ მოლეკულებს, ქიმიკატებს, პოლიმერებს, ცილებს და სხვა ნივთიერებებს, რომლებიც გამოიყენება მაგალითად ფარმაცევტულ, საკვებსა და ქიმიურ მრეწველობაში. ასეთი ბიოინჟინერიული უჯრედების ინტერიერში წარმოქმნილი მოლეკულების გასათავისუფლებლად, ულტრაბგერითი ლიზისი არის ჩვეულებრივი მეთოდი უჯრედის კედლების დასარღვევად და სამიზნე ნივთიერებების მიმდებარე სითხეში გადასატანად. წაიკითხეთ მეტი ბიოინჟინერიული უჯრედების ლიზისის შესახებ!
ულტრაბგერითი დნმ-ის გასწორება
ულტრაბგერითი ათვლის ძალები საყოველთაოდ გამოყენებული მეთოდია უჯრედის შიდა ნაწილიდან მოლეკულების, ორგანელების და ცილების გასათავისუფლებლად, ასევე დნმ-ის ძაფების ნაწილებად დასაშლელად. აკუსტიკური კავიტაცია არღვევს უჯრედის კედლებს და მემბრანებს, რათა ამოიღოს დნმ უჯრედებიდან და წარმოქმნას დაახლოებით 600 ფრაგმენტი. – 800 bp სიგრძით, რაც იდეალურია ანალიზისთვის.
დააწკაპუნეთ აქ, რომ გაიგოთ მეტი დნმ-ის ფრაგმენტაციის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების შესახებ!
ლიტერატურა / ლიტერატურა
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics აწარმოებს მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორებისგან ლაბორატორია რომ სამრეწველო ზომა.