E. კოლის ულტრაბგერითი ლიზი
- E. coli ბაქტერია წარმოადგენს ყველაზე ხშირად გამოყენებულ ბაქტერიას მიკრობიოლოგიასა და ბიოტექნოლოგიაში.
- ულტრაბგერითი უჯრედის დარღვევები ე.კოლის ლილისთვის საიმედო და რეპროდუქციულ შედეგებს აწვდის.
- ინტენსიური ჯერჯერობით ზუსტად კონტროლირებადი cavitation და shear ძალების შედეგად სრული დარღვევა და მაღალი მოპოვების შემოსავალი (მაგ. ცილები, დნმ).
რატომ არის E. coli-ს ულტრაბგერითი უჯრედების მოშლა სასურველი მეთოდი?
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები ან ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატები გვთავაზობენ E. coli ლიზის რამდენიმე უპირატესობას, რადგან ინტენსიური ულტრაბგერითი ეფექტურად არღვევს უჯრედის კედლებსა და გარსებს. ზონდის ტიპის ულტრაბგერითები ფართოდ გამოიყენება E. coli ლიზისისთვის შემდეგი მიზეზების გამო:
ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატი ბევრ უპირატესობას გვთავაზობს E. coli ლიზისისთვის. ულტრაბგერითი პროცესის პარამეტრებზე საიმედო და ზუსტი კონტროლი საშუალებას იძლევა ოპტიმიზაცია მოახდინოს ოპერაციული პარამეტრების, როგორიცაა სიმძლავრე, ხანგრძლივობა და ნიმუშის დამუშავება სასურველი შედეგების მისაღწევად.
პროტეინის ექსტრაქცია E.coli უჯრედებიდან ეფექტურად ხორციელდება ულტრაბგერითი ზონდი UP200St
უჯრედის რღვევა ულტრაბგერითი კავიტაციის გამოყენებით
ულტრაბგერითი ზონდის ტიპის ჰომოგენიზატორები მუშაობენ დაახლ. 20000 ციკლი წამში (20kHz-ზე) და იწვევს კავიტაციას სითხეებში ან სუსენსიებში. აკუსტიკური კავიტაციის მიკროსკოპული უბნები ვაკუუმის მსგავსი ზეწოლისა და მაღალი ტემპერატურის, რომელიც ანადგურებს უჯრედებს. მიუხედავად იმისა, რომ ტემპერატურამ შეიძლება მიაღწიოს რამდენიმე ათას გრადუს ცელსიუსს, კავიტაციის მოცულობა იმდენად მცირეა, რომ პროცესი მნიშვნელოვნად არ ათბობს. ულტრაბგერითი გამომუშავებული აკუსტიკური კავიტაცია და ათვლის ძალები პერფორირებს ან არღვევს ბაქტერიული უჯრედების უჯრედულ მემბრანას, როგორიცაა E.coli. Hielscher ულტრაბგერითი საშუალებას იძლევა ზუსტი კონტროლი პროცესის პარამეტრებზე, როგორიცაა ულტრაბგერითი ინტენსივობა, ამპლიტუდა, ენერგიის შეყვანა და ტემპერატურა. ამრიგად, ულტრაბგერითი ლიზისის პროცესი შეიძლება ოპტიმალურად მორგებული იყოს უჯრედის ტიპზე, უჯრედის კულტურასა და პროცესის მიზანზე.
- ლილის ზუსტი კონტროლი (ინტენსივობა, ამპლიტუდა, ტემპერატურა)
- საიმედო, განმეორებადი შედეგები
- ოპტიმალური ადაპტაცია კონკრეტული ნიმუშების მიმართ
- ტემპერატურის კონტროლი
- ძალიან მცირე ძალიან დიდი ნიმუშები (μL ლიტრი)
- წმინდა მექანიკური მკურნალობა
- მოსახერხებელი, უსაფრთხო ოპერაცია
- ლაბორატორიიდან წარმოების ხაზოვანი მასშტაბი
VialTweeter ულტრაბგერითი ლიზისთვის
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი სხვა ლიზისის ტექნიკის წინააღმდეგ
ქიმიურ და ენზიმურ ლიზი შეიძლება იყოს პრობლემატური – რადგან ქიმიური ლიზისის შეცვლა შეუძლია ცილის სტრუქტურებში და გააცნოს გამწმენდი პრობლემები და ენზიმისტური ლიზირება მოითხოვს ხანგრძლივი ინკუბაციის დროს და არ არის რეპროდუქციული – ულტრაბგერითი დარღვევა არის დახვეწილი, სწრაფი საკანში დარღვევის მეთოდი.
ულტრაბგერითი ლიზისი ეფუძნება მხოლოდ მექანიკურ ძალებს. ქიმიკატები არ არის დამატებული, სონიკა არღვევს უჯრედის კედელს ათვლის ძალებით. ქიმიურ ლიზისს შეუძლია შეცვალოს ცილის სტრუქტურა და გამოიწვიოს გაწმენდის პრობლემები. ფერმენტული დარღვევა მოითხოვს ინკუბაციის ხანგრძლივ პერიოდს და არ არის გამეორებადი. E.coli ბაქტერიის უჯრედების ულტრაბგერითი რღვევა არის სწრაფი, მარტივი, საიმედო და რეპროდუცირებადი. სწორედ ამიტომ Hielscher ულტრაბგერითი გამოიყენება ბიოლოგიურ და ბიოქიმიურ ლაბორატორიებში მთელს მსოფლიოში ნიმუშების მომზადებისთვის, წინასწარი ანალიტიკისთვის, ინ ვიტრო დიაგონსტიკისა და მრავალმხრივი ანალიზისთვის.
ზოგადი რეკომენდაციები ულტრაბგერითი ლიზისისთვის
Sonication არის ყველაზე პოპულარული ტექნიკა, რომელიც იძლევა ძალიან მცირე, საშუალო და დიდი რაოდენობით უჯრედების შეჩერებას – პიკო-ლიტრიდან 100 ლ / სთ-მდე (ულტრაბგერითი ნაკადის უჯრედის გამოყენებით). უჯრედები lysed მიერ თხევადი shear და cavitation. დნმ ასევე გამოიმუშავებს sonication, ამიტომ არ არის აუცილებელი დაამატოთ DNase საკანში შეჩერების.
ტემპერატურის კონტროლი ულტრაბგერითი E.coli ლიზისის დროს
ნიმუშის წინასწარი გაგრილებით და ნიმუშის ნიმუშის ყინვის დროს ნიმუშის შენახვა, ნიმუშის თერმული დეგრადაციის ნიმუში ადვილად შეიძლება.
იდეალურ შემთხვევაში, ნიმუშები უნდა ინახებოდეს ყინულის სახით ლიზისის დროს, მაგრამ ნიმუშების უმეტესობისთვის ეს საკმარისია, თუ ტემპერატურა არ მოიმატებს კულტურის ან ქსოვილის წყაროს ტემპერატურაზე. ამიტომ რეკომენდირებულია სუსპენზიის ყინულზე შენახვა და ულტრაბგერითი გაჟონვა რამდენიმე მოკლე ულტრაბგერითი იმპულსებით 5-10 წმ და პაუზებით 10-30 წმ. პაუზების დროს, სითბო შეიძლება გაიფანტოს დაბალი ტემპერატურის აღდგენის მიზნით. უფრო დიდი უჯრედის ნიმუშებისთვის ხელმისაწვდომია სხვადასხვა ნაკადის უჯრედის რეაქტორები გაგრილების ჟაკეტებით.
პროტოკოლები ულტრაბგერითი მომზადებისთვის E. Coli ლიზატებისთვის
მკვლევარები იყენებენ Hielscher-ის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები E.coli უჯრედების დარღვევისთვის. ქვემოთ შეგიძლიათ იხილოთ E.coli ლიზის სხვადასხვა შემოწმებული და დადასტურებული პროტოკოლები Hielscher ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების გამოყენებით E. coli-სთან დაკავშირებული სხვადასხვა აპლიკაციებისთვის.
უჯრედების ზრდა, ჯვარედინი კავშირი და E. coli უჯრედების ექსტრაქტების მომზადება ულტრაბგერითი გამოყენებით
იყიდება SeqA და RNA პოლიმერაზა ChIP-Chip E. coli MG1655 ან MG1655 ΔseqA გაიზარდა 37 ° C მდე OD600 დაახლოებით 50 მლ LB (+ 0.2% გლუკოზა), დაახლოებით 27 მლ ფორმალდეჰიდის (37%) თითო მლ / მლ-ზე დამატებამდე (საბოლოო კონცენტრაცია 1%). Crosslinking შეასრულა ნელა აფეთქება (100 rpm) ოთახის ტემპერატურაზე 20 წუთი, შემდეგ 10 მლ 2.5 მგ გლიცინის (საბოლოო კონცენტრაცია 0.5 მ) ჩაქუჩით. სითბოს-შოკის ექსპერიმენტებისათვის, E. coli MG1655 65 მლ ლმ-ში საშუალო 30 ° C- მდე გაიზარდა600 დაახლოებით 0.3. შემდგომში 30 მლ კულტურა გადაიტანეს წინასწარ გახურებულ კოლბაში 43°C-ზე და დარჩენილი ნაწილი ინახება 30°C-ზე. ჯვარედინი კავშირი და ჩაქრობა იყო როგორც ზემოთ აღწერილი, გარდა იმისა, რომ უჯრედები ინახებოდა 30 ან 43°C ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში შემდგომი ნელი შერყევის შემდეგ ოთახის ტემპერატურაზე. უჯრედები შეგროვდა ცენტრიფუგირებით და ორჯერ გარეცხეს ცივი TBS-ით (pH7.5). 1 მლ ლიზის ბუფერში ხელახალი სუსპენზიის შემდეგ (10 მმ ტრისი (pH 8.0), 20% საქაროზა, 50 მმ NaCl, 10 მმ EDTA, 10 მგ/მლ ლიზოზიმი) და ინკუბაციის შემდეგ 37°C-ზე 30 წუთის განმავლობაში, რასაც მოჰყვება 4 მლ IP-ის დამატება. ბუფერული, უჯრედების სონიკირება მოხდა ყინულზე 12-ჯერ 30 წმ და 30 წამის შესვენებით Hielscher ულტრაბგერითი პროცესორის UP400St გამოყენებით 100% სიმძლავრის პარამეტრზე. ცენტრიფუგაციის შემდეგ 10 წუთის განმავლობაში 9000 გ-ზე, 800 μl სუპერნატანტის ალიქვოტები ინახება -20°C-ზე. (Waldminghaus 2010)
ფერმენტების ჭარბი წარმოება და გაწმენდა ულტრაბგერითი ზონდით
დეკაჰისტიდინის (His10) მონიშნული ცილების ჭარბი წარმოებისთვის, E. coli BL21(DE3) გარდაიქმნა pET19b კონსტრუქციებით. ერთი ღამის პრეკულტურა შეგროვდა ცენტრიფუგირებით და 1% გამოიყენებოდა ექსპრესიული კულტურის დასანერგად. უჯრედები, რომლებიც ატარებენ pET19mgtB, გაიზარდა 22°C-ზე ოპტიკურ სიმკვრივემდე 600 ნმ (OD600) 0,7-მდე. კულტურა გადაიტანეს 17°C-მდე და ინდუცირებული იყო 100 μM IPTG-ით. 16 საათის შემდეგ, კულტურა აღებული იქნა ცენტრიფუგირებით 7500 × გ 4°C-ზე. უჯრედები ხელახლა შეჩერდა 50 მმ ფოსფატით ბუფერულ ფიზიოლოგიურ ხსნარში (PBS) 0.3 M NaCl-ით pH 7.4-ზე და დაირღვა ულტრაბგერითი S2 მიკრო-წვერის სონოტროდთან ერთად Hielscher ულტრაბგერითი UP200St ციკლით 0.5 და 75% ამპლიტუდა.
დეჰჰისიდინდინი-გიგანტური GtfC- ის ზედმეტი გამონაკლისი იყო 37 ° C- ზე OD- ზე600 0.6-დან 100 μM IPTG- ით. უჯრედები შემდგომში დაიბომბა 4 საათის განმავლობაში, მოსავალს და იწოვდნენ როგორც ზემოთ აღინიშნა MgtB- სთვის.
ნედლი უჯრედის ექსტრაქტები ცენტრიფუგირებულ იქნა 15000 × გ-ზე და 4°C-ზე უჯრედის ნამსხვრევების დასალექად. გასუფთავებული ექსტრაქტები ჩაიტვირთა 1 მლ HisTrap FF Crude სვეტებზე ÄKTAprime Plus სისტემის გამოყენებით. ფერმენტები გაიწმინდა მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით His-tagged ცილების გრადიენტული გამორეცხვისთვის. გამორეცხილი პროტეინის ხსნარები ორჯერ იყო დიალიზებული 50 მმ PBS-ის 1000 მოცულობის წინააღმდეგ, pH 7.4, 0.3 მ NaCl-ით 4°C-ზე. გაწმენდა გაანალიზდა 12% SDS-PAGE-ით. ცილის კონცენტრაცია განისაზღვრა ბრედფორდის მეთოდით Roti-Quant-ის გამოყენებით. (Rabausch et al. 2013)
პროტეინის ულტრაბგერითი ექსტრაქცია E. coli ბაქტერიებიდან
დაინტერესების საშიში ცილა (ამ შემთხვევაში, არაბვიპოსის თალიანის MTV1) GST- ის ტოლერანტთან არის დაკავშირებული და გამოხატულია BL21 Escherichia coli (E. coli) საკნებში.
- აიღეთ GST-MTV1 და GST თითო მარცვლები (შეესაბამება 50 მლ ბაქტერიულ კულტურას) და ხელახლა შეაჩერეთ თითოეული 2,5 მლ ყინულის ცივი ექსტრაქციის ბუფერში.
- გამოიყენეთ ულტრაბგერითი UP100H (აღჭურვილი MS3 microtip-sonotrode-ით მცირე მოცულობებისთვის, დაახლოებით 2-5 მლ) ბაქტერიების უჯრედების დაშლამდე, სანამ ისინი არ გაიზრდება, რაც მითითებულია შემცირებული გამჭვირვალობით და გაზრდილი სიბლანტით. ეს უნდა განხორციელდეს ყინულზე და რეკომენდირებულია სონიკირება ინტერვალებით (მაგ. 10 წამი სონიკირება, რასაც მოჰყვება 10 წამიანი პაუზა ყინულზე და ასე შემდეგ). სიფრთხილეა საჭირო, რომ არ მოხდეს ზედმეტად მაღალი ინტენსივობით სონიკა. თუ გამოვლინდა ქაფი ან თეთრი ნალექის წარმოქმნა, ინტენსივობა უნდა შემცირდეს.
- ლიზირებული ბაქტერიების ხსნარი გადაიტანეთ 1,5 მლ მიკროცენტრიფუგის მილებში და ცენტრიფუგა 4°C-ზე, 16000 xg 20 წუთის განმავლობაში.
ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი აპარატები, როგორიცაა UP400St გამოიყენეთ აკუსტიკური კავიტაციის მუშაობის პრინციპი E.coli-ის ეფექტური ლიზისისთვის.
რეკომბინანტული პროტეინის ექსპრესიის ანალიზი და გაწმენდა სონიკაციის გამოყენებით
E. coli-ის მარცვლები სონიკირებული იყო Hielscher ულტრაბგერითი UP100H-ით. ამ მიზნით, უჯრედის მარცვლები ხელახლა შეჩერდა გაცივებულ ლიზის ბუფერში (50 მმ Tris-HCl pH=7.5, 100 მმ NaCl, 5 მმ DTT, 1 მმ PMSF) და გაცივდა ყინულზე 10 წუთის განმავლობაში. შემდეგ, უჯრედის სუსპენზია გაჟღენთილი იყო 10 მოკლე აფეთქებით 10 წამის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა 30 წამის ინტერვალი გაგრილებისთვის. საბოლოოდ, უჯრედის ნამსხვრევები ამოღებულ იქნა ულტრაცენტრფუგირებით 4°C-ზე 15 წუთის განმავლობაში 14000 rpm-ზე. rPR ექსპრესიის დასადასტურებლად, სუპერნატანტი გაჟღენთილია 12% პოლიაკრილამიდის გელზე და გაანალიზებულია SDS-PAGE და Western blotting-ით. rPR-ის გაწმენდა განხორციელდა Ni2+-NTA ფისის გამოყენებით (Invitrogen, აშშ) მწარმოებლის სახელმძღვანელოს მიხედვით. ამ ეტაპზე გამოყენებული იქნა ადგილობრივი გამწმენდი მეთოდი. გასუფთავებული ცილის სისუფთავე შეფასდა ელექტროფორეზის გამოყენებით 12% პოლიაკრილამიდის გელზე და შემდგომი Coomassie ლურჯი შეღებვის გამოყენებით. გაწმენდილი ცილის კონცენტრაცია გაზომილი იყო Micro BCA პროტეინის ანალიზის ნაკრებით (PIERCE, აშშ). (აზარნეჟადი და სხვ. 2016 წ.)
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები E. coli Lysis-ისთვის
Hielscher Ultrasonics შეიმუშავებს, აწარმოებს და აწვდის მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების საიმედო და ეფექტური ლიზისისთვის E. coli ბაქტერიების და სხვა უჯრედების ტიპები, ქსოვილები და უჯრედული კულტურები.
ულტრაბგერითი ზონდების ფართო პორტფოლიო, ისევე როგორც არაპირდაპირი ბგერითი სისტემები გვაძლევს საშუალებას შემოგთავაზოთ იდეალური ულტრაბგერითი ქსოვილის ჰომოგენიზატორი თქვენი უჯრედების დაშლისა და ექსტრაქციის გამოყენებისთვის.
დიზაინი, წარმოება და კონსულტაცია – ხარისხი დამზადებულია გერმანიაში
Hielscher ულტრაბგერითები ცნობილია მათი უმაღლესი ხარისხისა და დიზაინის სტანდარტებით. ჭკვიანი პროგრამული უზრუნველყოფა, ინტუიციური მენიუ, პროგრამირებადი პარამეტრები და მონაცემთა ავტომატური პროტოკოლირება Hielscher ულტრაბგერითების მხოლოდ რამდენიმე მახასიათებელია. გამძლეობა და მარტივი ოპერაცია საშუალებას იძლევა ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების გლუვი ინტეგრაცია კვლევით და ბიოტექნოლოგიურ ობიექტებში. უხეში პირობები და მომთხოვნი გარემოც კი ადვილად უმკლავდება Hielscher ულტრაბგერითი აპარატებს.
Hielscher Ultrasonics არის ISO სერთიფიცირებული კომპანია და განსაკუთრებული აქცენტი კეთდება მაღალი ხარისხის ულტრაბგერაზე, რომელიც აღჭურვილია უახლესი ტექნოლოგიით და მომხმარებლის კეთილგანწყობით. რა თქმა უნდა, Hielscher ულტრაბგერითები შეესაბამება CE და აკმაყოფილებს UL, CSA და RoHs მოთხოვნებს.
ქვემოთ მოყვანილი ცხრილი გაძლევთ ჩვენს ულტრასონისტების სავარაუდო დამუშავების შესაძლებლობებს:
| Batch მოცულობა | დინების სიჩქარე | რეკომენდირებული მოწყობილობები |
|---|---|---|
| მრავალ ჭაბურღილის / მიკროტიტრული ფირფიტები | na | UIP400MTP |
| ჭიქა ფლაკონისთვის ან ჭიქისთვის | na | ულტრაბგერითი cuphorn |
| ულტრაბგერითი მიკრო ნაკადის რეაქტორი | na | GDmini2 |
| 10 ფლაკონი 0.5-დან 1.5მლ-მდე | na | VialTweeter |
| 05 დან 1.5 მლ | na | VialTweeter |
| 1-დან 500 მლ-მდე | 10 დან 200 მლ / წთ | UP100H |
| 10 დან 2000 მლ | 20 დან 400 მლ / წთ | Uf200 ः t, UP400St |
| 01-დან 20 ლ-მდე | 02-დან 4 ლ / წთ | UIP2000hdT |
| 10-დან 100 ლ | 2-დან 10 ლ / წთ | UIP4000 |
| na | 10-დან 100 ლ / წთ | UIP16000 |
| na | უფრო დიდი | კასეტური UIP16000 |
დაგვიკავშირდით! / გვკითხე ჩვენ!
დამატებითი პროტოკოლები ულტრაბგერითი E. coli ლიზისისთვის
ალიცინით მოდიფიცირებული პროტეინები E. coli-ში ულტრაბგერითი VialTweeter-ის გამოყენებით
სულფჰიდრილის შემცველობის განსაზღვრა 5,5-დიტირობით (2-ნიტრობენზოური მჟავა) (DTNB)
E. coli MG1655 ერთი ღამის კულტურა გამოყენებული იყო MOPS მინიმალური საშუალების (1:100) ინოკულაციისთვის. კულტურა იზრდებოდა აერობულად, სანამ არ მიიღწევა A600 0.4. კულტურა დაყოფილი იყო სამ 15-მლ კულტურად სტრესის სამკურნალოდ. არანამკურნალევი კულტურა ემსახურებოდა უარყოფით კონტროლს. 0,79 მმ ალიცინი (128 მკგ მლ-1) ან 1 მმ დიამიდი დაემატა დარჩენილ ორ კულტურას თითოეულს. კულტურები ინკუბირებული იყო 15 წუთის განმავლობაში. თითოეული კულტურის 5 მლ აღებული იქნა ცენტრიფუგაციით (8,525 × გ, 4°C, 10 წთ). უჯრედები ორჯერ გაირეცხა 1 მლ PBS-ით (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, ინახებოდა ანაერობულად გამოყენებამდე) და ცენტრიფუგა (13,000 × გ, 4°C, 10 წთ). უჯრედები ხელახლა სუსპენდირებული იყო ლიზის ბუფერში (PBS 6 მმ გუანიდინის HCl, pH 7.4) ულტრაბგერითი დაშლის დაწყებამდე 4°C-ზე.VialTweeter ულტრაბგერითი აპარატი, Hielscher GmbH, გერმანია) (3 × 1 წთ). უჯრედის ნამსხვრევები დაგროვდა ცენტრიფუგაციით (13000 × გ, 4 °C, 15 წთ). სუპერნატანტი გადატანილი იქნა 3.5 მლ QS-მაკრო კუვეტაში (10 მმ) მაგნიტური მორევის ზოლით და შერეული 1 მლ ლიზის ბუფერთან. ნიმუშების გაქრობის მონიტორინგი ხდებოდა 412 ნმ-ზე Jasco V-650 სპექტროფოტომეტრით, რომელიც აღჭურვილი იყო PSC-718 ტემპერატურის კონტროლირებადი უჯრედის დამჭერით ოთახის ტემპერატურაზე. დაემატა 100 მკლ 3 მმ დითიობის (2-ნიტრობენზოის მჟავა) ხსნარი. გადაშენებას აკონტროლებდნენ, სანამ არ მიაღწევდა გაჯერებას. თიოლის კონცენტრაციის გამოთვლა განხორციელდა გადაშენების კოეფიციენტის ϵ გამოყენებით412 = 13,700 მ-1 სმ-1 thio-2-nitrobenzoic მჟავა (TNB). უჯრედული თიოლური კონცენტრაციები გამოითვალა ე.კოლის უჯრედების მოცულობით 6.7 × 10-15 ლიტრი და უჯრედის სიმკვრივე A600 = 0,5 (ექვივალენტური 1 × 108 უჯრედების მლ-1 კულტურა). (მიულერის და 2016 წ.)
In Vivo გლუტათიონის განსაზღვრა ულტრაბგერითი უჯრედის გამანადგურებელი გამოყენებით
E.coli MG1655 გაიზარდა MOPS მინიმალურ გარემოში, საერთო მოცულობით 200 მლ, სანამ არ მიიღწევა A600 0.5. კულტურა დაყოფილი იყო 50 მლ კულტურებად სტრესის სამკურნალოდ. 15 წუთის ინკუბაციიდან 0,79 მმ ალიცინით, 1 მმ დიამიდით ან დიმეთილ სულფოქსიდით (საკონტროლო), უჯრედები აღებული იქნა 4000 გ-ზე 4°C-ზე 10 წუთის განმავლობაში. უჯრედები ორჯერ გაირეცხა KPE ბუფერით მარცვლების ხელახლა შეჩერებამდე 700 μl KPE ბუფერში. დეპროტეინაციისთვის, 300ლ 10% (w/v) სულფოსალიცილის მჟავა დაემატა ულტრაბგერითი უჯრედების დაშლამდე (3 x 1 წთ; VialTweeter ულტრაბგერითი). Supernatants შეგროვდა შემდეგ ცენტრიფუგირება (30 წუთი, 13,000 გ, 4 ° C). Sulfosalicylic მჟავა კონცენტრაციები შემცირდა 1% KPE ბუფერის 3 ტომის დამატებით. ზემოთ აღწერილი იქნა შესრულებული მთლიანი გლუტავტონისა და GSSG- ის გაზომვები. უჯრედული გლუტავითონური კონცენტრაციები გამოითვალა ე.კოლის უჯრედების მოცულობის მიხედვით 6.7×10-15 ლიტრი და უჯრედის სიმკვრივე A600 0,5 (ექვივალენტური 1×108 უჯრედების მლ-1 კულტურა). GSH- ის კონცენტრაციები გამოითვალა გლუტავტონის საერთო ჯამში 2 [GSSG] გამოყოფით. (მიულერის და 2016 წ.)
ადამიანის mAspAT-ის გამოხატვა E. coli-ში ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორის გამოყენებით
E. coli BL21- ის (DE3) ერთ კოლონიაში, გამოხატვის ვექტორი, Luria-Bertani (LB) საშუალო 100 მგ / მლ ამპიცილინის შემცველი 30 მლ-იანი ამპლიცილინის შემცველი და შემდეგ გაშენებულია 37ºC- მდე ოპტიკური სიმკვრივის600) მიაღწია 0.6. უჯრედები მოსავლიანობით 4000 × გ 10 წთ-ით გაიზარდა და 3L ახალი LB საშუალო შემცველობით 100 მგ / მლ ამპიცილინზე აღინიშნა.
შემდგომში, ცილის ექსპრესია ინდუცირებული იყო 1 მმ იზოპროპილ β-ᴅ-1-თიოგალაქტოპირანოზიდით (IPTG) 20 საათის განმავლობაში 16ºC-ზე. უჯრედები აღებული იქნა ცენტრიფუგირებით 8000 × გ 15 წუთის განმავლობაში და გარეცხილი იყო ბუფერი A-ით (20 მმ NaH2PO4, 0.5 მ NaCl, pH 7.4). მიახლოებითი 45 გ (სველი წონა) უჯრედები მიიღეს 3 ლ კულტივიდან. ცენტრიფუგაციის შემდეგ, უჯრედის მარცვლები ხელახლა შეჩერდა 40 მლ-ში (1 ლ კულტურისთვის) ყინულის ექსტრაქციის ბუფერ A-ში და დალიეს ულტრაბგერითი ყინულის ცივ ტემპერატურაზე Hielscher-ის ულტრაბგერითი უჯრედების გამანადგურებელი UP400St. უჯრედის ლიზისი იყო ცენტრიფუგირებული 12000 rpm-ზე 15 წუთის განმავლობაში ხსნადი (ზენატანი) და ნალექი (გრანულების) ფრაქციების გამოსაყოფად. (Jiang et al. 2015)
ფაქტები Worth Knowing
E.coli
Escherichia coli (E. coli) არის გრამ-ნეგატიური, ფაკულტეულურად ანაერობული, როდ ფორმირებული, კოლორიფული ბაქტერია ეშერიჩია, რომელიც ხშირად გვხვდება თბილ-სისხლძარღვთა ორგანიზმის ქვედა ნაწლავში (ენდოთერაპია). არსებობს დიდი რაოდენობით E. coli შტამები (ან subtypes) მრავალფეროვანი მახასიათებლები. უმეტესი E. coli შტამები უვნებელია ადამიანისთვის, მაგ. B და K-12 შტამები, რომლებიც გამოიყენება ლაბორატორიებში კვლევითი განაცხადებისთვის. თუმცა, ზოგიერთი შტამების მავნე და შეიძლება გამოიწვიოს სერიოზული ავადმყოფობის.
E. coli მნიშვნელოვან როლს ასრულებს თანამედროვე ბიოლოგიურ საინჟინრო და სამრეწველო მიკრობიოლოგიაში, რადგან ბაქტერიები ადვილად მანიპულირებადია. საერთო ლაბორატორიული აპლიკაციები, რომლებიც ხშირად იწვევენ E. coli- ის გამოყენებას, მაგალითად, რეკომბინანტი დეოქსირიბორნუკლის მჟავას (დნმ) შექმნას ან მოდელის ორგანიზმში.
E. coli არის ძალიან მრავალმხრივი მასპინძელი წარმოების ჰეტეროლოგიური ცილებისა და მრავალფეროვანი ცილის გამოხატვის სისტემები ხელმისაწვდომია რეკომბინენტური პროტეინის წარმოებაში E. coli. პლაზმატების გამოყენება, რომელიც იძლევა პროტეინის მაღალი დონის გამოხატვას, გენების მიღება შესაძლებელია ბაქტერიაში, რაც საშუალებას აძლევს ასეთი ცილების წარმოება მაღალ რაოდენობით სამრეწველო დუღილის პროცესებში.
E.coli გამოიყენება როგორც უჯრედული ქარხნები ინსულინის წარმოებისათვის. შემდგომი აპლიკაციები მოიცავს მოდიფიცირებული ეკოლოზის უჯრედების გამოყენებას ვაქცინებისა და იმობილიზირებული ფერმენტების შემუშავებასა და წარმოებაზე, ბიოპროდუქტების წარმოებაზე, ასევე ბიორემიაციისთვის.
შტამპი K-12 არის E. კოლის მუტანული ფორმა, რომელიც გამოხატავს ფერმენტ ალკალინ ფოსფატასს (ALP). ეს მუტაცია ხდება გენის დეფექტის გამო, რომელიც მუდმივად ემსახურება ფერმენტს. თუ გენი აწარმოებს პროდუქტს რაიმე დათრგუნვის გარეშე, ეს არის ცნობილი როგორც აქტიური საქმიანობა. ეს კონკრეტული მუტანტის ფორმა გამოიყენება ALP ფერმენტის იზოლაციისა და გაწმენდისათვის.
E. coli ბაქტერია ასევე ფართოდ გამოიყენება როგორც უჯრედული ქარხნები. ინჟინერიული მიკრობები (მაგ., ბაქტერიები) და მცენარეული უჯრედები შეიძლება გამოყენებულ იქნას, როგორც ე.წ. უჯრედების ქარხნები. ეს გენმოდიფიცირებული უჯრედები აწარმოებენ მოლეკულებს, ქიმიკატებს, პოლიმერებს, ცილებს და სხვა ნივთიერებებს, რომლებიც გამოიყენება მაგალითად ფარმაცევტულ, საკვებ და ქიმიურ მრეწველობაში. ასეთი ბიოინჟინერიული უჯრედების ინტერიერში წარმოქმნილი მოლეკულების გასათავისუფლებლად, ულტრაბგერითი ლიზისი ჩვეულებრივი მეთოდია უჯრედის კედლების დასაშლელად და სამიზნე ნივთიერებების მიმდებარე სითხეში გადასატანად. წაიკითხეთ მეტი ბიოინჟინერიული უჯრედების ლიზისის შესახებ!
ულტრაბგერითი დნმ Shearing
ულტრაბგერითი თხრილის ძალები არის საყოველთაოდ გამოყენებული მეთოდი, რომელიც გამოყოფენ უჯრედს და დნმ-ს დაშლას ცალი. აკუსტიკური cavitation არღვევს საკანში კედლები და მემბრანის ამონაწერი დნმ უჯრედები და წარმოქმნის ფრაგმენტები დაახლოებით 600 – 800 bp სიგრძის, რომელიც იდეალურია ანალიზისთვის.
დააწკაპუნეთ აქ, რომ გაიგოთ უფრო მეტი ულტრაბგერითი ჰომოგენეზერები დნმ-ის ფრაგმენტაციისთვის!
ლიტერატურა / ცნობები
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics აწარმოებს მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორებისგან ლაბორატორია to სამრეწველო ზომა.