E. კოლის ულტრაბგერითი ლიზი

• E. coli ბაქტერია წარმოადგენს ყველაზე ხშირად გამოყენებულ ბაქტერიას მიკრობიოლოგიასა და ბიოტექნოლოგიაში.
• ულტრაბგერითი უჯრედის დარღვევები ე.კოლის ლილისთვის საიმედო და რეპროდუქციულ შედეგებს აწვდის.
• ინტენსიური ჯერჯერობით ზუსტად კონტროლირებადი cavitation და shear ძალების შედეგად სრული დარღვევა და მაღალი მოპოვების შემოსავალი (მაგ. ცილები, დნმ).

უჯრედის დარღვევა კვატაციის გზით

ულტრაბგერითი გამოსაძიებელი ჰომოგენიერები მოქმედებს. 20,000 ციკლის წამში (20 კგ-ზე) და გამოიწვიოს სითხეებში ან დამატებების დროს. აკუსტიკური cavitation მიკროსკოპული სფეროებში ვაკუუმი მსგავსი წნევა და მაღალი ტემპერატურა, რომ ცრემლსადენი საკნები გარდა. მიუხედავად იმისა, რომ ტემპერატურამ შესაძლოა რამდენიმე ათასი გრადუსამდე მიაღწიოს, მცირე ზომის კვამლის ტომი ძალიან მნიშვნელოვანია, რადგან ისინი მნიშვნელოვნად არ ამცირებენ პროცესს. ულტრაბგერითი გენერირებული აკუსტიკური cavitation და shear ძალების perforate ან შესვენება საკანში გარსის E.coli – დამოკიდებულია მოწყობილობის პარამეტრი ულტრაბგერითი homogenizer.

ულტრაბგერითი ლიზის უპირატესობები

• ლილის ზუსტი კონტროლი (ინტენსივობა, ამპლიტუდა, ტემპერატურა)
• ოპტიმალური ადაპტაცია კონკრეტული ნიმუშების მიმართ
• ტემპერატურის კონტროლი
• ძალიან მცირე ძალიან დიდი ნიმუშები (μL ლიტრი)
• სუფთა მექანიკური მკურნალობა
• ლაბორატორიიდან წარმოების ხაზოვანი მასშტაბი

ქიმიურ და ენზიმურ ლიზი შეიძლება იყოს პრობლემატური – რადგან ქიმიური ლიზისის შეცვლა შეუძლია ცილის სტრუქტურებში და გააცნოს გამწმენდი პრობლემები და ენზიმისტური ლიზირება მოითხოვს ხანგრძლივი ინკუბაციის დროს და არ არის რეპროდუქციული – ულტრაბგერითი დარღვევა არის დახვეწილი, სწრაფი საკანში დარღვევის მეთოდი.
ულტრაბგერითი ლილი ეფუძნება მხოლოდ მექანიკურ ძალებს. არ არის ქიმიური ნივთიერებები დაემატა, sonication უჯრედის კედელს დაარღვევს. ქიმიური ლიზისის შეცვლა შეუძლია ცილის სტრუქტურას და გააცნოს გამწმენდი პრობლემები. ენზიმისტური დარღვევა მოითხოვს ხანგრძლივი ინკუბაციის დროს და არ არის რეპროდუცირებადი.

ზოგადი რეკომენდაციები

Sonication არის ყველაზე პოპულარული ტექნიკა, რომელიც იძლევა ძალიან მცირე, საშუალო და დიდი რაოდენობით უჯრედების შეჩერებას – პიკო-ლიტრიდან 100 ლ / სთ-მდე (ულტრაბგერითი ნაკადის უჯრედის გამოყენებით). უჯრედები lysed მიერ თხევადი shear და cavitation. დნმ ასევე გამოიმუშავებს sonication, ამიტომ არ არის აუცილებელი დაამატოთ DNase საკანში შეჩერების.
ტემპერატურის კონტროლი:
ნიმუშის წინასწარი გაგრილებით და ნიმუშის ნიმუშის ყინვის დროს ნიმუშის შენახვა, ნიმუშის თერმული დეგრადაციის ნიმუში ადვილად შეიძლება.
იდეალურ შემთხვევაში, ნიმუშები უნდა იყოს ინახება ცივი ცივი სიცხის დროს, მაგრამ ნიმუშების უმრავლესობა საკმარისია თუ ტემპერატურა არ აღემატება კულტურის ან ქსოვილის წყაროს ზემოთ. აქედან გამომდინარე, რეკომენდებულია, რომ ყინულზე შეჩერება და 5-10 წმ-მდე რამდენიმე მოკლე ულტრაბგერითი pulses და sonicate 10-30 წამი pauses. დროს pauses, სითბოს შეიძლება dissipate, რათა აღდგენა დაბალი ტემპერატურა. დიდი უჯრედების ნიმუშებისთვის, სხვადასხვა ნაკადის საკანში რეაქტორი გაგრილების ქურთუკებით არის შესაძლებელი.

პროტოკოლები ე.კოლის ლაისტების მომზადებისთვის

გამოხატვის ანალიზი და გამწმენდი რეაქბინანტიანი ცილა

E. coli pellet იყო sonicated ერთად ულტრაბგერითი სისტემა UP100H (Hielscher). ამ მიზნით, საკანში ნალექი იყო გაცივებული გაცივებული ლიზის ბუფერში (50 მმ Tris-HCl pH = 7.5, 100 მმ NaCl, 5 მმ DTT, 1 მმ PMSF) და ყინულზე 10 წუთის განმავლობაში. შემდეგ, უჯრედების შეჩერებას 10 წამში 10 მოკლე აფეთქება მოჰყვა, რასაც მოჰყვა 30 სთ ინტერვალი გაგრილებისთვის. საბოლოოდ, საკანში ნამსხვრევები ამოიღეს ულტრაცენტრიფუგაზე 4 ° C- დან 15 მლნ-მდე 14000 rpm- ზე. RPR გამოხატვის დასამტკიცებლად, supernatant- ი 12% -იანი პოლილიკრილამიდული ლარით აწარმოებდა და გაანალიზდა SDS-PAGE და დასავლეთის ბლოკირება. RPR- ის გაწმენდა მოხდა Ni- ის გამოყენებით²⁺-ნან ფისოვანი (მოწინააღმდეგე, აშშ) მწარმოებლის სახელმძღვანელოს მიხედვით. ამ ეტაპზე გამოყენებული იყო ადგილობრივი გამწმენდი მეთოდი. გაწმენდილი ცილის სისუფთავე შეფასდა ელექტროფორეზის გამოყენებით 12% პოლიკარრილამდის გელზე და შემდგომ კომოსი ლურჯი შეღებვა. გაწმენდილი ცილის კონცენტრაცია იზომება მიკრო BCA პროტეინის ასაკის ნაკრებით (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

უჯრედების ზრდის, გადაჯგუფების და ე.კოლის უჯრედების ექსტრაქტების მომზადება

იყიდება SeqA და RNA პოლიმერაზა ChIP-Chip E. coli MG1655 ან MG1655 ΔseqA გაიზარდა 37 ° C მდე OD₆₀₀ დაახლოებით 50 მლ LB (+ 0.2% გლუკოზა), დაახლოებით 27 მლ ფორმალდეჰიდის (37%) თითო მლ / მლ-ზე დამატებამდე (საბოლოო კონცენტრაცია 1%). Crosslinking შეასრულა ნელა აფეთქება (100 rpm) ოთახის ტემპერატურაზე 20 წუთი, შემდეგ 10 მლ 2.5 მგ გლიცინის (საბოლოო კონცენტრაცია 0.5 მ) ჩაქუჩით. სითბოს-შოკის ექსპერიმენტებისათვის, E. coli MG1655 65 მლ ლმ-ში საშუალო 30 ° C- მდე გაიზარდა₆₀₀ დაახლოებით 0.3. შემდგომში 30 მლ კულტურა გადაეცა წინასწარ დათბუნებულ ფაზას 43 ° C და დანარჩენი 30 ° C- ზე. გადაკვეთა და ჩაქრობა იყო ზემოთ აღწერილი, გარდა იმისა, რომ საკნები ინახებოდა 30 ან 43 ° C 5 წთ-ის განმავლობაში, სანამ ოთახის ტემპერატურაზე უფრო ნელა მოხდებოდა. საკნები შეგროვდა ცენტრიფუგაციით და ორჯერ ცივი TBS (pH7.5 )თ. 1 მლ ლიზის ბუფერში (10 მმ Tris (pH 8.0), 20% საქაროზა, 50 მმ ნაქსოვი, 10 მმ EDTA, 10 მგ / მლ ლიზოსმი) და ინკუბაცია 30 ° C- ზე, შემდეგ 4 მლ IP ბუფერი, უჯრედები იყენებდნენ ყინულზე 12-ჯერ 30 წამით და 30 წმ-ზე UP400St ულტრაბგერითი პროცესორი (Hielscher Ultrasonics GmbH) 100% -ით. 10 მმ-ის დაშორებით 9000 გ-ის შემდეგ, 800 მლ სიგნალის შემცველობა იყო ინახება -20 ° C -ზე. (Waldminghaus 2010)

ფერმენტების მოხმარება და გამწმენდი.

დეჰჰისტიდინის (მისი 10) შემცველობის პროტეინების დასადგენად, E. coli BL21 (DE3) გარდაიქმნა pET19b- ით. ღამის სიბრტყეზე მოსავლელი იყო ცენტრიფუგა, ხოლო 1% გამოყენებული იყო კულტურის გამოხატულებაში. PET19mgtB- ის უჯრედები 22 ° C- მდე გაიზარდა, სანამ ოპტიკური სიმკვრივე 600 ნმ₆₀₀) 0.7. კულტურა გადაეცათ 17 ° C და გამოწვეული იყო 100 μM IPTG. 16 სთ-ის შემდეგ, კულტურის მოსავლიანობა ცენტრიფუგაციით 7,500 × გ 4 ° C- ზე. საკნებში აღინიშნებოდა 50 მმ ფოსფატიანი ბალიშის სანელებლით (PBS) 0.3 მ NaCl- ზე pH 7.4 და ჩაიშალა ულტრაბგერითი გამოყოფით S2 მიკრო-წვერიანი sonotrode UP200St ულტრაბგერითი (Hielscher, Teltow, გერმანია) დროს ციკლი 0.5 და ამპლიტუდა 75%.
დეჰჰისიდინდინი-გიგანტური GtfC- ის ზედმეტი გამონაკლისი იყო 37 ° C- ზე OD- ზე₆₀₀ 0.6-დან 100 μM IPTG- ით. უჯრედები შემდგომში დაიბომბა 4 საათის განმავლობაში, მოსავალს და იწოვდნენ როგორც ზემოთ აღინიშნა MgtB- სთვის.
უჯრედის ნამსხვრევების ნალექი იყო 15,000 × გ და 4 ° C- ზე. დაზუსტებული ექსტრაქტები დატვირთული იქნა 1 მლ მისტრაბში FF Crude სვეტების მიერ ÄKTAprime Plus სისტემით (GE Healthcare) გამოყენებით. ფერმენტები გაწმენდილი იყო მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით მისი ციტატის ცილების გრადიენტური სიბრტყისათვის. გამოხატული პროტეინის ხსნარები ორჯერ დიამეტრიანი იყო 50 მმ-ის PBS, pH 7.4, 0.3 M NaCl- ზე, 4 ° C- ზე. გამწმენდი გაანალიზდა 12% SDS-PAGE. ცილის კონცენტრაცია განისაზღვრა ბრედფორდის მეთოდით Roti-Quant- ის გამოყენებით (კარლ როტ GmbH, კარლსრუე, გერმანია). (რაბუსჩი და სხვ. 2013)

ცილოვანი ბაქტერიების პროტეინის ექსტრაქცია
დაინტერესების საშიში ცილა (ამ შემთხვევაში, არაბვიპოსის თალიანის MTV1) GST- ის ტოლერანტთან არის დაკავშირებული და გამოხატულია BL21 Escherichia coli (E. coli) საკნებში.
1. მიიღეთ ერთი გლეტი GST-MTV1 და GST (შეესაბამება 50 მლ ბაქტერიულ კულტურას) და ყოველი 2.5 მლ ყინულის ცივი მოცილების ბუფერში.
2. გამოიყენეთ ულტრაბგერითი UP100H (აღჭურვილია MS3 მიკროტოპი- sonotrode მცირე მოცულობით (2-5 მლ)), რათა ჩაიშალოს ბაქტერიული უჯრედები, სანამ არ აისახება, რაც აღინიშნება შეწოვისა და სიბლანტის შემცირებით. ეს უნდა ჩატარდეს ყინულზე და რეკომენდებულია ინტერვალებით გამოსაყენებლად (მაგ. 10 წამიანი გამაძლიერებელი, რომელიც მოყვება 10 წამს ყინულზე და ა.შ.). ზრუნვა უნდა იქნას მიღებული არა ძალიან მაღალი ინტენსივობით. თუ fomaming ან ფორმირების თეთრი precipitate აღმოჩენილი, ინტენსივობის უნდა შემცირდეს.
3. Lysed ბაქტერიების ხსნარი 1.5 მლ მიკროციფრულების მილები და ცენტრიფუგა 4 ° C, 16,000 x 20 წთ.

ალინი-მოდიფიცირებული პროტეინები E. coli- ში

სულფჰიდრილის შემცველობის განსაზღვრა 5,5-დიტირობით (2-ნიტრობენზოური მჟავა) (DTNB)
ეკო კოლი MG1655 ღამე კულტურა გამოყენებულ იქნა MOPS მინიმალური საშუალო ინოვაციისთვის (1: 100). კულტურის აეროდრომი გაიზარდა, სანამ A600 0.4 მიღწეული იყო. კულტურა გაყოფილი იყო სამ -15 მლ კულტურაზე სტრესული მკურნალობისთვის. არათანმიმდევრული კულტურა ნეგატიურ კონტროლს წარმოადგენს. 0.79 მმ ალცინი (128 მკგ მლ^-1) ან 1 მმ დიამედი დაემატა ერთ დანარჩენ ორ კულტურას. კულტურები 15 წუთის განმავლობაში დაიხარჯა თითოეული კულტურის 5 მლ-ზე მოსავალს მიეკუთვნება ცენტრიფუგა (8,525 × გ, 4 ° C, 10 წთ). უჯრედები დაიბანეთ ორჯერ 1 მლ PBS (137 მმ NaCl, 2.7 მმ კკკ, 10 მმ₂HPO₄2 მმ კჰ₂PO₄, pH 7.4, ინახება ანაერობულად ადრე გამოყენება) და ცენტრიფუგით (13,000 × გ, 4 ° C, 10 წთ). საკნებში აღინიშნა ლიზონური ბუფერში (PBS 6 მმ Guanidinium HCl, pH 7.4), სანამ არღვევდა 4 ° C- ს მიერ ულტრაბგერითიVialTweeter ულტრაბგერითი, Hielscher GmbH, გერმანია) (3 × 1 წთ). უჯრედის ნამსხვრევები გაჟღენთილი იყო ცენტრიფუგაით (13,000 × გ, 4 ° C, 15 წთ). სუნამომ გადაიყვანა 3.5 მლ QS-macro cuvette (10 მმ) მაგნიტური სტაბილური ბარი და შერეული 1 მლ ლიზის ბუფერი. ნიმუშების გადანაწილება 412 ნმ-ზე მონიტორინგს იწყებს, რომელიც აღჭურვილია PSC-718 ტემპერატურული კონტროლირებადი საკანში (ჯასკო) ოთახის ტემპერატურის მქონე Jasco V-650 სპექტროფოტომეტრით. დაემატა 3 მმ დიტირობის 100 მლ (2-ნიტრობენზოური მჟავა) ხსნარი. გადაშენება მოხდა მანამ, სანამ არ მოხდებოდა ინტენსივობა. თოლილი კონცენტრაციის გაანგარიშება განხორციელდა გადაშენების კოეფიციენტის ε₄₁₂ = 13,700 მ^-1 სმ^-1 thio-2-nitrobenzoic მჟავა (TNB). უჯრედული თიოლური კონცენტრაციები გამოითვალა ე.კოლის უჯრედების მოცულობით 6.7 × 10^-15 ლიტრი და საკანში სიმჭიდროვე₆₀₀ = 0.5 (1 × 10 ექვივალენტი⁸ უჯრედების მლ^-1 კულტურა). (მიულერის და 2016 წ.)

ვივო გლუტათოიონში განსაზღვრა

E.coli MG1655 გაიზარდა MOPS მინიმალური საშუალო რაოდენობა 200 მლ-მდე, სანამ ა₆₀₀ 0.5-ს მიაღწია. კულტურა გაყოფილი იყო 50 მლ კულტურაში სტრესული მკურნალობისთვის. 15 მგ ინკუბაციის შემდეგ 0.79 მმ ალცინის, 1 მმ დიამედი, ან დიმეთილის სულფაიდიდი (კონტროლი), უჯრედები მოსავალს 4,000 გ 4 ° C 10 წუთის განმავლობაში. საკნებში ორჯერ დაიბლოკა კეპ-ის ბუფერით 700 მლ KPE ბუფერში გრანულების რეზისტენტობის წინ. დეტროტერაციისთვის, უჯრედების დარღვევამდე 10% -მდე (ვ / ვ) სულფოსალიცილის მჟავას დამატებამდე (3 x 1 წთ; VialTweeter ულტრაბგერითი). Supernatants შეგროვდა შემდეგ ცენტრიფუგირება (30 წუთი, 13,000 გ, 4 ° C). Sulfosalicylic მჟავა კონცენტრაციები შემცირდა 1% KPE ბუფერის 3 ტომის დამატებით. ზემოთ აღწერილი იქნა შესრულებული მთლიანი გლუტავტონისა და GSSG- ის გაზომვები. უჯრედული გლუტავითონური კონცენტრაციები გამოითვალა ე.კოლის უჯრედების მოცულობის მიხედვით 6.7×10^-15 ლიტრი და საკანში სიმჭიდროვე₆₀₀ 0.5 (ეკვივალენტი 1×10⁸ უჯრედების მლ^-1 კულტურა). GSH- ის კონცენტრაციები გამოითვალა გლუტავტონის საერთო ჯამში 2 [GSSG] გამოყოფით. (მიულერის და 2016 წ.)

ადამიანის ასახვა ე.კოლისადმი

E. coli BL21- ის (DE3) ერთ კოლონიაში, გამოხატვის ვექტორი, Luria-Bertani (LB) საშუალო 100 მგ / მლ ამპიცილინის შემცველი 30 მლ-იანი ამპლიცილინის შემცველი და შემდეგ გაშენებულია 37ºC- მდე ოპტიკური სიმკვრივის₆₀₀) მიაღწია 0.6. უჯრედები მოსავლიანობით 4000 × გ 10 წთ-ით გაიზარდა და 3L ახალი LB საშუალო შემცველობით 100 მგ / მლ ამპიცილინზე აღინიშნა.
შემდგომში პროტეინის გამოხატულება გამოწვეული იქნა 1 მმ იზოპროპილის β-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 20 საათის განმავლობაში 16 სმ. უჯრედები მოსავალს ღებულობდნენ ცენტრში 8000 × გ 15 წუთის განმავლობაში და გარეცხილით ბუფერი A (20 მმ NaH2PO4, 0.5 მ NaCl, pH 7.4). სავარაუდო 45 გ (სველი წონა) უჯრედები მიიღეს 3 ლ კულტურისგან. ცენტრიფუგების შემდეგ, უჯრედების მარცვლები აღდგა 40 მლ-ში (1 ლ კულტურისათვის) ყინულის გამონაბოლქვის ბუფერული ატრიბუტი, რომელიც იწყება ულტრაბგერითი გზით ცივი ცივი ტემპერატურის გამოყენებით UP400St ინსტრუმენტი (დოქტორი Hielscher GmbH, გერმანია). უჯრედების ლიზინგი 12 მილიარდი rpm- ზე ცენტრიფუგირებული იყო 15 წუთის განმავლობაში ხსნადი ხსნარის და მწვავე (ნალექის) ფრაქციების განცალკევებით. (Jiang et al., 2015)

ქვემოთ მოყვანილი ცხრილი გაძლევთ ჩვენს ულტრასონისტების სავარაუდო დამუშავების შესაძლებლობებს: